吳 雙，薛 偉，王德爐，李春萍，陳 卓*

（1.貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025；3.中華人民共和國貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴陽 550002）

植物病毒是一類可侵染植物的微生物，由植物病毒導(dǎo)致的農(nóng)作物病害難控制，對(duì)產(chǎn)量損失大，危害重。因此，植物病毒病又稱為植物癌癥。采用抗植物病毒劑是防治植物病毒病的一種主要防控措施。基于傳統(tǒng)的研究，我們從作用機(jī)理的角度將抗植物病毒劑劃分為病毒抑制劑、病毒鈍化劑、寄主誘導(dǎo)保護(hù)劑[1]。例如，娃兒藤堿（Tylophorine）作為病毒抑制劑，作用于煙草花葉病毒（TMV）RNA起始?jí)A基發(fā)夾處，干擾病毒基因組和外殼蛋白的組裝，影響病毒的復(fù)制[2]。寧南霉素（Ningnanmycin）作為病毒鈍化劑，對(duì)病毒粒子的結(jié)構(gòu)具有破壞作用[1]。苯并噻二唑（BTH）、毒氟磷（Dufulin）作為誘導(dǎo)保護(hù)劑，可激活植物寄主水楊酸信號(hào)通路，使寄主產(chǎn)生系統(tǒng)性獲得性抗性（SAR），從而抑制病毒的增殖[3-4]。

槲皮素（Quercetin），化學(xué)名為3,3',4',5,7-五羥基黃酮，是一種黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于植物的葉、花和果實(shí)中[5]。槲皮素在醫(yī)學(xué)中有廣泛的用途，具有抗癌、降血壓、抗病毒活性[6-8]。槲皮素對(duì)馬皰疹病毒Ⅰ型等動(dòng)物病毒也具有抑制活性[9]。也有研究表明，槲皮素對(duì)多種植物病毒具有抑制活性[10-17]。因此，關(guān)于槲皮素對(duì)植物病毒的抑制活性及其作用機(jī)理值得研究。本文以槲皮素及其衍生物為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)其對(duì)煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）和水稻條紋病毒（RSV）的抑制活性，并研究槲皮素及其衍生物對(duì)本氏煙熱休克蛋白（Hsp）mRNA表達(dá)的影響，以期為創(chuàng)制作用機(jī)制新穎的高活性抗植物病毒劑提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

TMV、CMV和PVY保存于普通煙‘K326’（Nicotiana tabacumL.cv.K326）中，RSV保存于常規(guī)水稻品種上。普通煙‘K326’、本氏煙（Nicotiana benthamiana）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）和莧色藜（Chenopodium amaranticolor）種植于本實(shí)驗(yàn)室的智能溫室。

1.1.2 供試藥劑

槲皮素、3-O-甲基槲皮素、5-O-甲基槲皮素、3,7-Di-O-甲基槲皮素、3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素、3,4＇-Di-O-甲基槲皮素、7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、6-羥基-槲皮素、3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素、7-O-甲基槲皮素、3,3-Di-OSO3H-槲 皮 素、3,7,4＇-Tri-OSO3H-槲 皮素、3＇-O-甲基-6-氫-槲皮素（純度≥90%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO），生工生物工程（上海）股份有限公司；檢測PVY的ELISA試劑盒，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、熒光定量PCR分別采用的TransZol（目錄號(hào)：ET101-01）、TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)（目錄號(hào)：AU341-02）和PerfectStart Fast Green qPCR SuperMix（目錄號(hào)：AQ611-01）試劑，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 供試儀器

Quant Studio 6 Flex熒光定量PCR儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；HBS-1096C酶標(biāo)儀，南京德鐵生物科技有限公司。

1.2 抗植物病毒活性測試

TMV、CMV和PVY保存在煙草‘K326’上。TMV的純化采用Gooding等[18]報(bào)道的方法，CMV的純化采用周雪平等[19]報(bào)道的方法，PVY的純化采用羅亮指[20]的方法，RSV的純化采用戈林泉等[21]報(bào)道的方法。TMV和RSV的抗病毒活性評(píng)價(jià)采用半葉枯斑法在心葉煙上完成[22-23]，CMV和PVY的抗病毒活性評(píng)價(jià)采用半葉枯斑法在莧色藜上完成[20,24]。心葉煙和莧色藜種植于智能溫室，白天和黑夜溫度分別為25℃和20℃；光周期L∥D=16 h∥8 h，濕度控制在70%～80%。6葉期的心葉煙和莧色藜用于抗病毒活性測試。采用金剛砂磨擦接種病毒至2片葉上。將待測化合物溶解于80 μL DMSO，加入含0.1% tween 80的二次蒸餾水，定容至100 μmol/L。采用細(xì)軟的毛筆將待測化合物刷在右半葉上，左半葉僅刷含0.1%tween 80的水作為對(duì)照。每個(gè)處理15個(gè)重復(fù)，獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)。抗病毒活性按式（1）計(jì)算。

式中：X代表抑制率，%；A代表右半葉上的枯斑數(shù)；ACK代表左半葉上的枯斑數(shù)。

1.3 槲皮素對(duì)Hsp mRNA表達(dá)的影響

槲皮素對(duì)HspmRNA表達(dá)影響的分析在本氏煙上完成。本氏煙種植于智能溫室，白天與黑夜溫度分別為25℃和20℃，光周期L∥D=16 h∥8 h，濕度控制在70%～80%。葉齡為3葉期，采用RT-qPCR研究Hsp70和Hsp90mRNAs的表達(dá)。采用Primer 3軟件（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)上述基因的熒光定量PCR引物，選擇actin為內(nèi)參基因（表1）。槲皮素的作用劑量為125、250、500 μmol/L和1 000 μmol/L，采用42℃的高溫?zé)峒け臼蠠? h，葉面噴施槲皮素后繼續(xù)在42℃的高溫條件下熱激1 h。收集本氏煙第3葉，液氮條件下研磨成細(xì)粉。采用TransZol試劑提取總RNA，采用TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑合成cDNA，采用熒光定量PCR儀進(jìn)行基因定量分析。

表1 Hsp70和Hsp90的基因引物序列

1.4 槲皮素或槲皮素衍生物對(duì)Hsp mRNAs表達(dá)的影響

基于本研究中抗植物病毒活性數(shù)據(jù)，研究500 μmol/L槲皮素、7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3-O-甲基槲皮素或7-O-甲基槲皮素對(duì)Hsp70mRNA表達(dá)的影響。將本氏煙置于光照培養(yǎng)箱中于42℃熱激1 h后，葉面噴施槲皮素和槲皮素衍生物，繼續(xù)放置在42℃條件下熱激1 h。收集本氏煙第3葉，采用RT-qPCR方法研究槲皮素或槲皮素衍生物對(duì)Hsp70mRNA表達(dá)的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS version 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。針對(duì)抗植物病毒活性和基因定量分析的數(shù)據(jù)，方差分析采用最小顯著差異方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗植物病毒活性

抗TMV活性測試表明，7,4'-Di-O-甲基槲皮素和3＇-O-甲基-6-氫-槲皮素對(duì)TMV的抑制活性較強(qiáng)，抑制率分別為68.46%、57.83%；槲皮素和3-O-甲基槲皮素也具有較高的抑制活性，抑制率分別為54.68%和52.47%。3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素也具有一定的抑制活性，抑制率為49.38%和48.62%（表2）。

表2 槲皮素或槲皮素衍生物對(duì)4 種植物病毒的抑制活性

抗CMV活性測試表明，3-O-甲基槲皮素、3＇-O-甲基-6-氫-槲皮素、槲皮素、7,4'-Di-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素具有較強(qiáng)的抑制活性，抑制率分別為54.82%、52.75%、52.41%、51.10%和50.35%。3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素也具有一定的抑制活性，抑制率為46.63%。其他的槲皮素衍生物對(duì)CMV的抑制活性較弱（表2）。

抗PVY活性測試表明，7,4＇-Di-O-甲基槲皮素對(duì)PVY的抑制活性最強(qiáng)，3＇-O-甲基-6-氫-槲皮素、槲皮素、3-O-甲基槲皮素、3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素也具有較強(qiáng)的抑制活性（表2）。

抗RSV活性測試表明，7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3＇-O-甲基-6-氫-槲皮素、槲皮素、3-O-甲基槲皮素和3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素具有較強(qiáng)的抑制活性。而3,3-Di-OSO3H-槲皮素、6-羥基-槲皮素、7-O-甲基槲皮素、3,4＇-Di-O-甲基槲皮素對(duì)4種病毒的抑制活性較弱（表2）。

2.2 槲皮素對(duì)Hsp70和Hsp90 mRNAs的表達(dá)影響

RT-qPCR研究結(jié)果表明，高溫?zé)峒ぬ幚淼腍sp70mRNA表達(dá)倍數(shù)為3.59倍，采用不同劑量的槲皮素及高溫?zé)峒ぬ幚砟芟抡{(diào)Hsp70mRNA的表達(dá)，其在125～1 000 μmol/L作用劑量下的表達(dá)倍數(shù)分別為2.03、1.84、1.61倍和1.44倍，隨作用劑量的增加，表達(dá)倍數(shù)下調(diào)也越明顯（圖1）。此外，高溫?zé)峒ぬ幚硪部缮险{(diào)Hsp90mRNA表達(dá)，其表達(dá)倍數(shù)為2.87倍，125～1 000 μmol/L槲皮素及高溫?zé)峒ぬ幚砟芟抡{(diào)Hsp90mRNA的表達(dá)，其表達(dá)倍數(shù)分別為1.08、1.02、0.94倍和0.83倍。綜合Hsp70和Hsp90mRNA的定量PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)Hsp90mRNA 調(diào)控效果顯著于Hsp70mRNA（圖2）。

圖1 槲皮素對(duì)Hsp70 mRNA表達(dá)的影響

圖2 槲皮素對(duì)Hsp90 mRNA表達(dá)的影響

2.3 槲皮素或槲皮素衍生物對(duì)Hsp70 mRNA的表達(dá)影響

RT-qPCR研究結(jié)果表明，熱激處理的Hsp70mRNA表達(dá)倍數(shù)為3.59倍。槲皮素、7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3-O-甲基槲皮素、7-O-甲基槲皮素分別與42℃熱激協(xié)同處理下的Hsp70mRNA表達(dá)倍數(shù)為1.84、1.21、2.26倍和2.77倍，下調(diào)比例分別為48.74%、66.30%、37.05%和22.84%。結(jié)果表明，7,4＇-Di-O-甲基槲皮素對(duì)Hsp70mRNA的調(diào)控最為明顯（圖3）。

圖3 500 μmol/L槲皮素和槲皮素衍生物對(duì)Hsp70 mRNA的影響

3 討論與結(jié)論

采用抗植物病毒病藥劑防治植物病毒病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一種主要措施。近年來，生產(chǎn)上主要采用的抗植物病毒病藥劑主要是病毒治療劑、病毒鈍化劑和免疫激活劑，3類藥劑各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，病毒治療劑存在用藥次數(shù)多，推廣成本高，對(duì)作物沒有保護(hù)效果；免疫激活劑的施用最佳時(shí)期為病毒侵染前或作物苗期或發(fā)病早期。槲皮素是一種具有廣泛生物活性的黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于植物中。槲皮素也是中醫(yī)藥的主要成分之一，對(duì)人、畜和環(huán)境安全?；陂纹に氐哪阁w結(jié)構(gòu)進(jìn)行新農(nóng)藥開發(fā)，在毒性、環(huán)境評(píng)價(jià)上潛在風(fēng)險(xiǎn)較小。為了探明槲皮素的活性基團(tuán)，創(chuàng)制結(jié)構(gòu)新穎、病毒抑制活性突出的槲皮素類似結(jié)構(gòu)衍生物，本研究通過比較槲皮素及其衍生物的抗病毒活性，發(fā)現(xiàn)槲皮素及其衍生物7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3＇-O-甲基-6-氫-槲皮素、3-O-甲基槲皮素、3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素對(duì)4種病毒具有較強(qiáng)的抑制活性，其結(jié)果與前人報(bào)道對(duì)PVX、番茄環(huán)斑病毒（TomRSV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）的抑制活性相似[10-11,25]。因此，我們推測槲皮素骨架分子上3位的甲基有助于提高抗植物病毒活性，7和4＇位甲基的存在可增加抗植物病毒的活性。關(guān)于槲皮素及其衍生物的作用機(jī)制的研究有少量報(bào)道。例如，3＇-O-甲基-6-氫-槲皮素作用于缺乏系統(tǒng)性獲得性抗性的煙草，煙草缺乏相應(yīng)的抗性物質(zhì)，也不表現(xiàn)出抗病毒活性，提示槲皮素衍生物不會(huì)誘導(dǎo)增加植物寄主抗性[26]。同時(shí)，也有研究報(bào)道3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素在體外條件下對(duì)TMV粒子沒有破壞作用[25]。此外，3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素或3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素在體外條件下不影響TMV RNA復(fù)制，說明槲皮素衍生物對(duì)病毒沒有直接的抑制作用[23]。目前，所有槲皮素及其衍生物抗植物病毒的活性均來自活體上的數(shù)據(jù)。因此，我們推測槲皮素及其衍生物對(duì)植物寄主產(chǎn)生了間接的影響。Hsp作為分子伴侶蛋白，可以幫助蛋白完成折疊、修飾等過程，使得蛋白表現(xiàn)出相應(yīng)的活性。例如，Hsp70可與TBSV復(fù)制蛋白、Viral RNA復(fù)制子和rNTP等共同構(gòu)成病毒復(fù)制酶復(fù)合體，促進(jìn)TBSV的復(fù)制[25]。同時(shí)，前人研究也發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)經(jīng)TBSV侵染本氏煙的Hsp70，但關(guān)于槲皮素及其衍生物與Hsp70和Hsp90間的調(diào)控關(guān)系，至今未見有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)經(jīng)高溫?zé)峒さ谋臼蠠煹腍sp70和Hsp90。其中，對(duì)Hsp90的下調(diào)較Hsp70明顯，量效關(guān)系發(fā)現(xiàn)500 μmol/L對(duì)Hsp的效果較為顯著。此外，通過比較槲皮素及其衍生物對(duì)Hsp70的調(diào)控效果，我們發(fā)現(xiàn)7,4＇-Di-O-甲基槲皮素對(duì)Hsp的調(diào)控效果明顯，這為今后篩選高活性的抗病毒物質(zhì)提供啟示。