邱祥玉，胡金，吳施國

云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)是一種起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的85%～90%，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1-2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2018年，全球有84.1萬例新確診肝癌病例，而死亡病例已高達78.1萬例，成為臨床死亡率較高的疾病之一[3]。我國HCC的發(fā)生主要與慢性肝炎病毒感染、酒精、黃曲霉素的攝入有關(guān)。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中存在異常的葡萄糖、脂質(zhì)、氨基酸代謝，如葡萄糖有氧糖酵解增加、脂肪酸合成增強以及谷氨酰胺的消耗等，這些代謝改變構(gòu)成了肝癌細(xì)胞生長、增殖和生存的優(yōu)勢，推動著肝癌的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。

此外，HCC起病隱匿，早期缺乏明顯的臨床癥狀，多數(shù)患者確診時已是晚期肝癌，5年生存率僅為10.1%[6]。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、影像學(xué)檢查被用于肝癌的診斷，但研究發(fā)現(xiàn)AFP在肝癌早期并不敏感，且存在假陽性[7]。超聲、電子計算機斷層掃描(computerized tomography，CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)在區(qū)分小肝癌與肝硬化結(jié)節(jié)時仍存在困難，而早期診斷和識別是肝癌能否得到及時有效治療的關(guān)鍵。

近年來，隨著生命科學(xué)與分析技術(shù)的不斷發(fā)展進步，代謝組學(xué)作為一種通用的系統(tǒng)生物學(xué)方法，運用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)等代謝組學(xué)技術(shù)平臺，可對生物體血液、尿液、糞便和組織中的代謝物進行檢測以發(fā)現(xiàn)特異性代謝物或代謝組[8-9]。代謝組學(xué)具有無創(chuàng)性、高靈敏性、高特異性的特點，被廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)肝癌診斷生物標(biāo)志物、揭示肝癌代謝特征、探索中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)、研究中藥及復(fù)方起效機制等方面，該技術(shù)對肝癌的診斷、治療、機制探索起到了重要的推動作用?；诖?，本文通過分析肝癌的代謝特征，并對代謝組學(xué)在肝癌診斷標(biāo)志物的篩選以及中醫(yī)證候、單味中藥及復(fù)方中的應(yīng)用進行綜述，以期對肝癌代謝有更深刻的認(rèn)識，為深入探索肝癌代謝提供參考。

1 肝癌的代謝特征

與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞具有快速生長、增殖的特點，因此肝癌細(xì)胞需要通過對糖、脂質(zhì)、氨基酸等代謝途徑進行重編程，以滿足其增加的生物能量和生物合成需求，以及減輕肝癌細(xì)胞增殖和生存所需的氧化應(yīng)激[10]。此外，腸道菌群失調(diào)也可通過影響代謝物水平的方式參與到肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程。深入了解肝癌的代謝特征，能更好地了解肝癌的發(fā)病機制和可能的治療途徑。

1.1 葡萄糖代謝

1.1.1 有氧糖酵解肝癌代謝最突出的特點之一是對葡萄糖的高需求，而有氧糖酵解是肝癌細(xì)胞利用葡萄糖產(chǎn)能的主要途徑。有氧糖酵解是指即使在氧氣充足的情況下，癌細(xì)胞也傾向于通過“酵解”的方式代謝葡萄糖以獲取能量，也稱瓦伯格(Warburg)效應(yīng)。在有氧糖酵解過程中，1分子葡萄分解只能產(chǎn)生2分子三磷酸腺苷(adenosine triphosphate ATP)。由于ATP產(chǎn)量極低，所以在代償機制中，癌細(xì)胞會顯著提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(glucose transporters protein，GLUTs)的水平和己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等關(guān)鍵代謝酶的活性，以增加對葡萄糖的攝取和利用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，GLUT1和HK2的表達顯著增加[12-13]。在有氧糖酵解過程中，葡萄糖轉(zhuǎn)運體將葡萄糖運輸?shù)桨麧{，在HK作用下不可逆地生成葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate，G6P)[14]。G6P隨著糖酵解的發(fā)生進一步產(chǎn)生大量的二羥丙酮磷酸，用于合成三酰甘油以及磷脂；產(chǎn)生3-磷酸甘油酸可以用于合成氨基酸等中間代謝物。這些物質(zhì)將參與到其他代謝途徑用以合成脂類、蛋白質(zhì)、核苷酸，促使癌細(xì)胞增殖[15]。此外，丙酮酸激酶催化磷酸基從磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移到腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)，產(chǎn)生丙酮酸和ATP。丙酮酸在乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LHD)的作用下產(chǎn)生大量乳酸，造成腫瘤微環(huán)境酸化，而酸化的微環(huán)境將抑制淋巴細(xì)胞、M型巨噬細(xì)胞的免疫功能，促使其發(fā)生免疫逃逸，為肝癌細(xì)胞提供更大的生存空間[16]。

由此可見，有氧糖酵解一方面為肝癌細(xì)胞提供大量能量，一方面為生物大分子合成提供中間體，其終產(chǎn)代謝物乳酸還可以作用于腫瘤微環(huán)境(the tumor microenvironment，TME)，支持癌細(xì)胞增殖。

1.1.2 三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)TCA循環(huán)是細(xì)胞在有氧條件下，發(fā)生在線粒體基質(zhì)中的循環(huán)反應(yīng)過程，是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵途徑之一，也是葡萄糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝的中心樞紐[17]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞具有更高的TCA循環(huán)活性，以滿足細(xì)胞生長、增殖需求[18]。1分子葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)中生成2分子丙酮酸，丙酮酸氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A，進入TCA循環(huán)，完成葡萄糖的完全代謝，在這個過程中產(chǎn)生還原性等價物NADH和FADH2，這些分子隨后通過氧化磷酸化(OXPHOS)產(chǎn)生30～32個ATP。除了葡萄糖，色氨酸、亮氨酸等氨基酸分解代謝以及脂肪酸β-氧化均可生成乙酰輔酶A進入TCA循環(huán)氧化供能[19]。不僅如此，TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物也經(jīng)常被耗盡，用于脂質(zhì)、氨基酸合成代謝[20]。例如，乙酰輔酶A在檸檬酸合酶(citrate synthase，CS)的催化下生成檸檬酸。檸檬酸作為TCA循環(huán)中的第一個產(chǎn)物，不僅可以由烏頭酸酶轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，也可以輸出到細(xì)胞質(zhì)中，作為脂質(zhì)生物合成的前體，形成脂肪酸。

此外，TCA循環(huán)中產(chǎn)生的中間代謝物質(zhì)可作為活性分子促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展。在TCA循環(huán)中，琥珀酸被琥珀酸脫氫酶(succinic de hydrogenase，SDH)氧化生成延胡索酸。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中SDH的表達降低會導(dǎo)致琥珀酸和延胡索酸的積累，而琥珀酸是一種致癌代謝物[21]。琥珀酸通過激活琥珀酸受體信號，觸發(fā)PI3K-HIF-1α軸，介導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[22]。而延胡索酸可以與谷胱甘肽結(jié)合，破壞谷胱甘肽抗氧化的功能，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激[23]。

1.2 氨基酸代謝肝臟是氨基酸代謝的重要器官，在肝癌細(xì)胞中存在明顯的氨基酸代謝紊亂[24]。其中，谷氨酰胺代謝增強是肝癌氨基酸代謝的重要特征。Yang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌與肝硬化患者肝組織中谷氨酰胺顯著升高。Xie等[26]分別對l0例肝癌患者、10例肝血管瘤和10例健康對照者的尿液做了代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要富集于谷氨酰胺(glutamine，Gln)/谷氨酸代謝通路。何曉博等[27]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞對Gln的消耗比正常細(xì)胞高出 5～10倍。雖然Gln是一種非必需氨基酸，但肝癌細(xì)胞的生存嚴(yán)重依賴于這種氨基酸。

肝癌細(xì)胞除了通過糖酵解產(chǎn)生能量外，Gln也是其重要的能源物質(zhì)之一。Gln在谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS) 催化下脫去一個氨基生成谷氨酸，谷氨酸經(jīng)過谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH) 進一步轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，進入TCA循環(huán)，產(chǎn)生ATP以供應(yīng)能量所需[28]。研究表明，GLS在增殖的肝癌細(xì)胞中過度表達，可以通過 Wnt信號通路促進肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[29-30]。此外，Gln是用于合成嘌呤、嘧啶和氨基葡萄糖-6-磷酸的氮、碳的重要來源，合成的嘌呤、嘧啶和氨基葡萄糖-6-磷酸可促進肝癌細(xì)胞增殖[31]。不僅如此，Gln還可以通過促進谷胱甘肽形成以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而減輕氧化應(yīng)激對肝癌細(xì)胞帶來的損傷[32]。

1.3 脂質(zhì)代謝脂質(zhì)也稱為脂肪，包括脂肪酸、三酰甘油、鞘脂、磷脂、膽固醇等在內(nèi)的多種分子[33]。在肝癌中存在異常的脂質(zhì)代謝，主要表現(xiàn)為異于正常細(xì)胞的脂肪酸合成(fatty acid synthesis，F(xiàn)AS)增強。肝癌細(xì)胞既可以通過從頭合成途徑產(chǎn)生脂肪酸，也可以通過脂肪分解途徑產(chǎn)生脂肪酸，其中脂質(zhì)從頭合成在肝癌細(xì)胞中占據(jù)主要地位[34-35]。Gln、乙酸都是肝癌細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的重要來源。谷氨酰胺脫氨生成為α-酮戊二酸，α-酮戊二酸通過還原羧化轉(zhuǎn)化為檸檬酸，檸檬酸在ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase，ACL)作用下可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A[36]。乙酸通過乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases，ACSSs)也可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A是脂肪酸合成的必要底物。上述途徑產(chǎn)生的乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylaseα，ACCα)的作用下生成丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)，最后在脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)催化下生成脂肪酸[37]。

脂肪酸不僅是肝癌細(xì)胞增殖中所需合成的大量膜結(jié)構(gòu)的主要成分，還可以作為信號分子。比如，溶血磷脂酸可以通過G蛋白偶聯(lián)溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)受體在癌細(xì)胞的質(zhì)膜上通過自分泌和旁分泌機制發(fā)出信號，刺激癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[38]。此外在葡萄糖缺乏時，脂肪酸還可轉(zhuǎn)化為?；鈮A，在線粒體中經(jīng)β-氧化產(chǎn)生ATP，為肝癌細(xì)胞提供能量，因此脂肪酸合成對于肝癌細(xì)胞尤為重要[39]。

1.4 氧化應(yīng)激肝臟是自由基產(chǎn)生的重要場所，超氧自由基(O2-)、羥基自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)是活性氧的主要形式。當(dāng)ROS的含量增加，超過細(xì)胞正常的抗氧化能力時，就會發(fā)生氧化應(yīng)激[40]。此時，過量的自由基可攻擊細(xì)胞膜、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致其發(fā)生氧化損傷[41]。人體具有抗氧化系統(tǒng)，通過滅活或消除ROS，維持氧化物質(zhì)和抗氧化物的平衡，最大限度地減少或防止氧化應(yīng)激帶來的損傷。谷胱甘肽是肝細(xì)胞中最豐富且具有強大抗氧化性能的非酶抗氧化劑，由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸組成。谷胱甘肽可以直接清除OH-，還可以被谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化為谷胱甘肽二硫化物消耗H2O2以發(fā)揮其抗氧化性[42]。

肝癌細(xì)胞的高代謝伴隨著ROS的增加，為了減輕ROS對自身的傷害，肝癌細(xì)胞比正常肝細(xì)胞表現(xiàn)出對谷胱甘肽更大的需求。有研究表明，肝癌患者血清中用以合成谷胱甘肽的3種氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸)顯著增加[43]。Cheng等[44]發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常肝組織相比，肝細(xì)胞癌組織中的谷胱甘肽水平顯著升高，而高水平的谷胱甘肽可維持肝癌細(xì)胞更高的抗氧化應(yīng)激能力。因此，肝癌細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽的代謝，逃避氧化應(yīng)激帶來的傷害，從而最大限制地為自身創(chuàng)造有利的生存環(huán)境。

1.5 腸道菌群肝癌患者存在腸道菌群失調(diào)，失調(diào)的腸道菌群可通過促進肝纖維化、導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、影響代謝物水平等機制參與肝癌的病理過程[45-46]。次級膽汁酸和短鏈脂肪酸是腸道菌群的代謝產(chǎn)物。目前，已有大量研究證實，腸道菌群的膽汁酸代謝與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。初級膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)合成后進入腸道，梭菌屬將其脫羥基化、氧化和差向異構(gòu)化形成次級膽汁酸，而次級膽汁酸被重吸收后會對肝臟造成損傷[47]。脫氧膽酸是常見的次級膽汁酸，有研究表明，脫氧膽酸可導(dǎo)致DNA損傷，引起肝細(xì)胞老化，老化的肝細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進肝癌發(fā)生[48-49]。短鏈脂肪酸是腸道菌群酵解膳食纖維而產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物，在結(jié)腸產(chǎn)生后經(jīng)門靜脈到達肝臟及全身。肝癌患者腸道菌群失衡會導(dǎo)致短鏈脂肪酸嚴(yán)重缺失，而短鏈脂肪酸具有抗癌作用[50]。研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可以被肝癌細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)特異性識別后可激活下游死亡受體凋亡途徑，促進TNF-α分泌，從而誘導(dǎo)Hepg2肝癌細(xì)胞凋亡[51]。由此可見，腸道菌群失調(diào)引起的代謝物改變是促進肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

2 代謝組學(xué)對肝癌早期診斷和鑒別診斷的推動作用

超過2/3的肝癌患者因診斷晚而得不到及時、有效的治療，生存率低，而現(xiàn)有的診斷標(biāo)志物并不能滿足臨床實際需求，尋找新型的敏感、低創(chuàng)的診斷標(biāo)志物已迫在眉睫[52]。利用代謝組學(xué)尋找肝癌早期篩查與診斷標(biāo)志物是肝癌研究的重要方向。

Han等[53]用液相色譜-質(zhì)譜法進行非靶向和靶向代謝組學(xué)分析，并結(jié)合肝組織和血清代謝物進行驗證，發(fā)現(xiàn)肝癌患者肝臟中的類維生素A含量顯著下降，具有90%的特異性，可用以區(qū)分肝癌患者和健康個體。其中，視黃醇有望成為一種肝癌候選診斷生物標(biāo)志物。人體絕大部分視黃醇貯存在于肝臟中，因此肝癌的發(fā)展對視黃醇含量的影響可能比其他類型的癌癥更大。

Luo等[54]對包括肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者、慢性乙型肝炎病毒感染者和健康對照者在內(nèi)的 1 448 名中國受試者進行研究，通過液相色譜-質(zhì)譜篩選，確定苯丙氨酸-色氨酸、甘氨膽酸為潛在診斷標(biāo)志物。為了進一步驗證這組生物標(biāo)志物的特異性，研究者將胃癌和肝內(nèi)膽管癌患者納入此次研究。在驗證中發(fā)現(xiàn)，與胃癌患者和肝內(nèi)膽管癌患者相比，肝細(xì)胞癌患者血清苯丙氨酸-色氨酸明顯下降，而甘氨膽酸水平明顯升高，表明這兩種代謝物的結(jié)合可能是區(qū)分肝癌患者和非肝癌患者的理想標(biāo)準(zhǔn)物。

Bai 等[55]通過定量靶向代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌患者的血清尿素遠(yuǎn)高于慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者和慢性丙型肝炎患者，尿素是肝細(xì)胞癌患者特異性升高的血清生物標(biāo)志物，說明尿素可能是肝癌潛在的血清生物標(biāo)志物。同時該研究數(shù)據(jù)顯示，甲胚蛋白診斷肝癌的敏感性只有60.49%，尿素聯(lián)合甲胚蛋白、癌胚抗原可提高肝癌診斷的敏感性。楊訓(xùn)俊等[56]通過檢測肝癌患者、肝硬化患者以及慢性乙型肝炎患者血清中的尿素和甲胚蛋白水平，發(fā)現(xiàn)尿素聯(lián)合甲胚蛋白可用于監(jiān)測慢性乙型肝炎病情是否發(fā)展及肝癌的診斷上，其特異度可達90%以上。

Jee等[57]利用代謝組學(xué)分析了75例轉(zhuǎn)移肝癌患者和134名年齡和性別匹配的未轉(zhuǎn)移癌患者的基線血清樣本，試圖找到有價值的肝癌代謝生物標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸中的花生四烯酸和亞油酸代謝與肝癌的發(fā)病相關(guān)，肝癌組花生四烯酸水平高于無癌對照組，花生四烯酸可能在肝癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

單個癌結(jié)節(jié)直徑小于3 cm，或相鄰的兩個癌結(jié)節(jié)直徑之和不超過3 cm的肝細(xì)胞癌被稱為小肝癌。小肝癌患者往往伴隨多發(fā)結(jié)節(jié)性肝硬化，且肝硬化的結(jié)節(jié)與腫瘤非常相似[58]，如何區(qū)分小肝癌與肝硬化結(jié)節(jié)仍是影像學(xué)檢查的一個挑戰(zhàn)，代謝組學(xué)可以為肝癌和肝硬化的鑒別提供策略。Han等[59]通過靶向代謝組學(xué)研究肝癌與肝硬化肝組織及血清的差異性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸、溶血磷脂酰膽堿205、琥珀酰腺苷和尿苷是肝癌與肝硬化異質(zhì)性生物標(biāo)志物，提高了肝癌診斷的敏感性和特異性，為臨床區(qū)分肝癌與肝硬化提供了策略。Gong等[60]采用非靶向代謝組學(xué)和靶向花生四烯酸分析研究乙肝致肝硬化和肝癌患者的血清代謝譜，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中花生四烯酸和甘油磷脂含量高于乙肝-肝硬化患者。有文獻報道，肝癌血清中鞘脂類和溶血卵磷脂等的表達量顯著高于肝硬化患者，而?；悄懰?、甘氨脫氧膽酸等的表達量顯著低于肝硬化患者，這些小分子化合物的代謝特征能有效區(qū)分肝硬化和肝癌[61]。

這些研究表明，代謝組學(xué)是肝癌早期診斷和鑒別的一種較有發(fā)展前景的工具，這些研究或許會發(fā)現(xiàn)能夠早期診斷肝癌患者的代謝生物標(biāo)志物，推動肝癌的早期診斷和鑒別。

3 代謝組學(xué)對肝癌中醫(yī)證型研究的推動作用

中醫(yī)的證是建立在司外揣內(nèi)、整體觀念下對疾病過程中某一階段病因、病機和病位的高度概括，與代謝組學(xué)通過對代謝產(chǎn)物進行動態(tài)化、整體性分析，以進一步發(fā)現(xiàn)機體內(nèi)部變化進而認(rèn)識機體整體功能狀態(tài)的特點相似[62]。因此，中醫(yī)研究者們也逐漸采用代謝組學(xué)方法研究證候潛在的生物學(xué)基礎(chǔ)和差異性代謝通路，以期用現(xiàn)代研究術(shù)語揭示中醫(yī)證候本質(zhì)[63]。代謝組學(xué)不僅可以區(qū)分同一疾病不同證候，還可以辨別同一證候的不同疾病。

3.1 同病異癥

3.1.1 脾虛濕盛證有學(xué)者對脾虛濕盛證肝癌患者的血漿代謝組學(xué)、尿液代謝組學(xué)進行了研究，結(jié)果顯示肝癌患者血漿和尿中的檸檬酸含量均明顯低于健康人群[64-65]。脾虛濕盛型肝癌患者血漿中的膽酸水平顯著升高，膽酸可能是肝癌脾虛濕盛證血漿中的候選生物標(biāo)志物之一。此外，肝癌患者尿中?；撬崴斤@著高于健康人群，且脾虛濕盛證組高于非脾虛濕盛證組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明?；撬峥赡苁瞧⑻摑袷⒆C和非脾虛濕盛證兼?zhèn)涞闹匾x物，而牛磺酸作為膽汁酸鹽的重要組成部分，主要參與脂肪的消化過程，牛磺酸水平的紊亂提示辨證屬脾虛濕盛證肝癌患者可能存在更為嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝失調(diào)。

3.1.2 陽虛證陳群偉等[66]應(yīng)用核磁共振波譜技術(shù)分析21例陽虛證原發(fā)性肝癌患者和21例非陽虛證肝癌患者的血清代謝物，發(fā)現(xiàn)肝癌陽虛證組極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、膽堿、脂類、異亮氨酸、乳酸、糖類等代謝物較非陽虛證組均明顯下降。其中，低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白分別參與膽固醇和三酰甘油的運輸，而這可能會導(dǎo)致脂類化合物的異常聚集或利用障礙，說明脂質(zhì)代謝紊亂可能是區(qū)別陽虛證和非陽虛證的代謝特征之一。正常細(xì)胞和肝癌細(xì)胞都要利用葡萄糖產(chǎn)能，葡萄糖有氧糖酵解可以生成丙酮酸，丙酮酸生成乳酸，產(chǎn)生ATP，葡萄糖和乳酸代謝水平的降低一定程度上說明陽虛證肝癌患者較非陽虛證肝癌患者能量生成低下，而能量代謝不足可能是陽虛證患者畏寒乏力、肢冷蜷臥的重要原因。

3.2 異病同證中醫(yī)治療是建立在整體觀、辨證論治的基礎(chǔ)之上，證型是指導(dǎo)中醫(yī)遣藥組方的基本依據(jù)，若證型相同，即使是不同疾病，也可以使用同樣的處方。為了探求“異病同證”的共同代謝物，魏濱等[67]對大腸癌和肝癌術(shù)后患者肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證的血漿代謝物進行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)甘氨酸、色氨酸、尿素是肝腎陰虛證和濕熱證肝癌、大腸癌術(shù)后患者共同升高的代謝產(chǎn)物，其中隱證患者的色氨酸卻是降低的，說明色氨酸可能是濕熱證、肝腎陰虛證特征性的代謝物。此外，除了甘氨酸、色氨酸、尿素代謝水平的改變，濕熱證相較于肝腎陰虛證存在更為嚴(yán)重的代謝紊亂，如葡萄糖、甘露醇、山梨醇代謝水平升高，而肝腎陰虛證并無此代謝改變。甘露醇、山梨醇均為糖類分解過程中產(chǎn)生的物質(zhì)，說明濕熱證主要影響糖代謝，而肝腎陰虛證卻主要以氨基酸代謝擾動為主。

這些研究有助于從代謝組學(xué)的角度理解“同病異證”“異病同證”下中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵。

4 代謝組學(xué)對中藥及復(fù)方研究的推動作用

“藥有個性之特長，方有合群之妙用”，單味中藥還是復(fù)方在肝癌的治療中均起到了重要的作用。近年來，研究者們運用代謝組學(xué)技術(shù)從代謝物質(zhì)改變的角度闡釋中藥及復(fù)方治療肝癌的起效機制，而這些研究工作將有利于正確指導(dǎo)中醫(yī)藥在臨床中的運用。

4.1 單味中藥及單體的代謝組學(xué)研究

已故女畫家孫多慈女士是吳健雄一輩子的閨蜜，孫多慈比吳健雄小一歲。她們相識于中央大學(xué)，那時她們一個讀藝術(shù)系，一個在物理系。孫多慈回憶當(dāng)年青春逼人的吳健雄簡直是魅力四射、男女通吃：“遠(yuǎn)在民國20年即1931年，我們同在南京中央大學(xué)讀書，那時的健雄是一個嬌小玲瓏、活潑矯健的女孩子。她是江蘇太倉人，一雙神采奕奕的眸子，靈巧的嘴唇，短發(fā)，平鞋，樸素大方但剪裁合身的短旗袍。在兩百左右的女同學(xué)中她顯得那樣地突出，當(dāng)然她也是一般男孩子的追求目標(biāo)。不僅男孩子，女孩子竟也有人為她神魂顛倒呢?！?/p>

4.1.1 雙氫青蒿素雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物，不僅具有抗瘧疾、抗炎的作用，還可促進腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長[68]。為了解雙氫青蒿素是否可以通過影響肝癌細(xì)胞代謝從而抑制肝癌細(xì)胞生長，王惠國等[69]以Huh7和BEL-7402肝癌細(xì)胞為研究對象，采用GC-MS法檢測雙氫青蒿素干預(yù)后兩種細(xì)胞代謝物的變化。結(jié)果顯示，雙氫青蒿素可影響兩種細(xì)胞的氨基酸代謝。具體來說，雙氫青蒿素可能參與調(diào)解天冬氨酸-丙氨酸-谷氨酸的代謝，抑制兩種肝癌細(xì)胞生長。

4.1.2 苦參堿王珂欣等[70]采用1H-NMR方法研究苦參堿對人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化特點，發(fā)現(xiàn)苦參堿能顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)外谷氨酸，破壞肝癌細(xì)胞能量代謝，降低細(xì)胞內(nèi)外甘氨酸的量。甘氨酸是合成嘌呤的重要原料，因此降低細(xì)胞內(nèi)外甘氨酸可抑制DNA合成，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。

4.1.3 青蒿琥酯王惠國等[71]以Huh7、SMMC-7721肝癌細(xì)胞為研究對象，運用GC-MS技術(shù)研究青蒿琥酯干預(yù)24h后的差異性代謝物，發(fā)現(xiàn)了18種顯著上調(diào)和21種顯著下調(diào)的差異代謝物，主要涉及丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽的代謝，而這些氨基酸可作為合成脂類、核苷酸的中間代謝物以促進癌細(xì)胞增殖。

4.1.4 鵝掌草三萜皂苷姚詩琪等[72]建立H22肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，采用GC-MS技術(shù)對模型組及鵝掌草三萜皂苷高劑量組的腫瘤組織做代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)鵝掌草三萜皂苷可以有效抑制肝癌移植瘤生長，其機制可能與組氨酸代謝有關(guān)。

4.1.5 靈芝多糖有研究證明中藥單體靈芝多糖有抗肝癌作用[73]。于雷等[74]采用Hep G2細(xì)胞構(gòu)建小鼠肝癌模型，收集靈芝多糖干預(yù)組和模型組肝癌小鼠糞便進行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖組小鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物乙酸、丙酸、正丁酸3種短鏈脂肪酸水平均顯著高于模型組，表明靈芝多糖可增加腸道菌群有益代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸，發(fā)揮治療肝癌的潛在機制。

4.1.6 大黃素邢月曉[75]采用核磁共振分析大黃素干預(yù)Hep G2肝癌細(xì)胞的代謝組學(xué)，結(jié)果顯示大黃素可降低甘氨酸和谷胱甘肽的水平，甘氨酸可作為谷胱甘肽的底物，而谷胱甘肽可以維持細(xì)胞氧化還原平衡，其含量顯著降低，提示大黃素可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激代謝引起細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用。

4.1.7 重樓皂苷有研究表明，重樓皂苷作為天然產(chǎn)物具有抗肝癌活性。邱培宇[76]構(gòu)建H22肝癌荷瘤小鼠模型并利用核磁共振方法研究重樓皂苷干預(yù)后的血清代謝組學(xué)。與模型組相比，重樓皂苷治療后，肝癌小鼠血清中磷酸膽堿、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳酸水平降低，說明重樓皂苷參與肝癌脂質(zhì)代謝和能量代謝。

4.1.8 木蝴蝶總黃酮李楠楠等[77]采用二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌模型，并分析木蝴蝶總黃酮干預(yù)后各組大鼠血漿代謝物的變化。與模型組比較，木蝴蝶總黃酮干預(yù)后共有285種差異性代謝物，這些代謝物主要與膽汁酸合成、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝等途徑有關(guān)。亞油酸、花生四烯酸等脂肪酸在腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及促血管新生過程中，均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[78]，而木蝴蝶總黃酮能降低這些代謝物質(zhì)表達，表明其抗肝癌機制可能與調(diào)控脂質(zhì)代謝有關(guān)。

4.1.10 紫雛菊Xu等[80]用Hepa1-6細(xì)胞構(gòu)建肝癌荷瘤小鼠模型，采用LC-MS技術(shù)確定L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、D-(+)-色氨酸和棕櫚等14種血清差異代謝物，而高劑量紫雛菊干預(yù)組主要調(diào)節(jié)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成代謝。

4.2 中藥復(fù)方的代謝組學(xué)研究

4.2.1 健脾解毒方劉嘉輝等[81]采用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝癌大鼠模型，用代謝組學(xué)的方法研究健脾解毒方(黨參、茯苓、白術(shù)、炙甘草、柴胡、半枝蓮、龍葵、馬齒莧、莪術(shù))抗肝癌的作用機制。以健脾解毒方干預(yù)2周后，應(yīng)用 GC-MS 技術(shù)檢測大鼠肝臟組織代謝物，發(fā)現(xiàn)健脾解毒方主要從上調(diào)煙酸和煙酰胺代謝、減少腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)、上調(diào)纈氨酸及異亮氨酸含量改善肝癌的氨基酸代謝紊亂，以及下調(diào)脫氫抗壞血酸水平改善氧化還原狀態(tài)，從而起到抗肝癌的作用。

4.2.2 青蒿鱉甲湯成欣等[82]通過分析H22原位肝細(xì)胞癌模型小鼠血漿代謝組學(xué)，研究青蒿鱉甲湯(青蒿、鱉甲、生地黃、知母、丹皮)治療癌性發(fā)熱的代謝機制。在青蒿鱉甲湯連續(xù)給藥14 d后，采用 LC-MS技術(shù)對給藥組、模型組以及空白組小鼠的血漿進行代謝組學(xué)分析，篩選出86個具有顯著差異的代謝物。通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些代謝物主要用于參與膽汁分泌、鞘脂代謝和類固醇激素生物合成代謝。

4.2.3 復(fù)方苦參注射液復(fù)方苦參注射液是用于治療癌癥相關(guān)疼痛和肝癌輔助治療的中成藥制劑。Wang等[83]利用1H-NMR技術(shù)對復(fù)方苦參注射液干預(yù)后的肝癌大鼠血清及肝臟組織中的差異性代謝物進行篩選并靶量化，發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液顯著降低了肝癌大鼠血清中檸檬酸、乳酸含量以及肝臟組織中檸檬酸的水平，血清和肝臟中的己糖激酶和丙酮酸激酶水平均顯著升高，3 mL·kg-1的復(fù)方苦參注射液干預(yù)后能顯著抑制己糖激酶和丙酮酸激酶的活性。乳酸是有氧糖酵解的產(chǎn)物，檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，己糖激酶和丙酮酸激酶是有氧糖酵解過程中關(guān)鍵的限速酶。該研究說明，復(fù)方苦參注射液治療肝癌的機制可能是抑制糖酵解過程中關(guān)鍵代謝物(檸檬酸和乳酸)和關(guān)鍵代謝酶的活性，從而干預(yù)肝癌的能量代謝。

4.2.4 艾迪注射液艾迪注射液是由斑蝥、人參，黃芪和刺五加組成的中成藥制劑，臨床用以治療肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥。有研究報道，多胺的代謝水平在肝癌中升高，但服用艾迪注射液后，多胺及其代謝物水平有下降趨勢[84]。為了探求多胺代謝與抗癌活性之間的關(guān)系，Liu等[85]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靶向分析艾迪注射液及拆解組合干預(yù)人肝癌細(xì)胞HL-7702和HepG2后細(xì)胞中的11種多胺代謝。結(jié)果顯示，艾迪注射液對HepG2細(xì)胞抑制作用最強，艾迪注射液及其拆解組和聯(lián)合組均可不同程度地降低HepG2細(xì)胞多胺代謝水平。

5 結(jié)語

代謝組學(xué)平臺能夠快速篩選出數(shù)百種代謝物，并同時監(jiān)測包括氨基酸、脂類、碳水化合物和核苷酸等不同途徑的代謝物，作為肝癌研究的重要手段，該技術(shù)在肝癌代謝研究中展現(xiàn)了巨大的潛力。①肝癌的早期診斷是預(yù)后的關(guān)鍵，但目前缺乏特異性和靈敏性較高的診斷標(biāo)志物，利用代謝組學(xué)尋找肝癌標(biāo)志物是肝癌早期篩查與診斷研究的重要方向。②手術(shù)、介入、放化療仍是肝癌主要的治療方式，但因復(fù)發(fā)性高、遠(yuǎn)期效果不理想等問題，肝癌的治療也逐漸趨向于從整體考慮，并不以消除整個癌腫作為治療目標(biāo)，更強調(diào)”帶瘤生存，與瘤共生”[86]。肝癌具有明顯代謝異常的特征，而干預(yù)腫瘤細(xì)胞代謝、打破腫瘤自身代謝平衡是當(dāng)下切實可行的一種治療方式[87]。代謝組學(xué)可監(jiān)測帶瘤生存狀態(tài)下患者的代謝改變，明確藥物治療后的效果，有利于對代謝治療做出針對性的指導(dǎo)。③中醫(yī)藥治療肝癌具有較好的效果，但具體機制需要闡明。代謝組學(xué)系統(tǒng)性、整體性的研究特點與中醫(yī)整體觀、辨證論治思維模式相契合，因此，代謝組學(xué)的應(yīng)用有利于中醫(yī)藥辨證論治下中醫(yī)證候本質(zhì)的探索。此外，中藥復(fù)方多靶點、多層次、多途徑協(xié)同作用的特點是肝癌治療起效的關(guān)鍵，將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到中藥復(fù)方的研究中，能夠探索中藥復(fù)方作用下體內(nèi)代謝物的變化，有助于充分挖掘中藥復(fù)方的作用機制和療效。

綜上所述，以肝癌為研究對象的代謝組學(xué)可以為我們提供一個更大的視角以了解機體整體代謝活動。