劉寶玲，蔡汝健

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東廣州 510220；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣東廣州 510640)

使用抗生素是預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病感染的有效手段之一，但由于抗生素的長期使用、濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題也日趨凸顯，甚至出現(xiàn)了多重耐藥或是超級耐藥細(xì)菌，導(dǎo)致細(xì)菌感染的疾病治療愈發(fā)難以用藥，甚至無藥可治。細(xì)菌對抗生素的耐藥性已經(jīng)被世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)確定為人類公共衛(wèi)生方面面臨的三個主要問題之一[1]。

細(xì)菌生物被膜的形成是細(xì)菌耐藥的一個重要原因。許多致病菌聚集后會形成生物被膜，為細(xì)菌提供一層保護(hù)屏障，使細(xì)菌在一定程度上逃避抗生素或者消毒劑的損傷。張麗蓉等[2]研究發(fā)現(xiàn)形成生物被膜的細(xì)菌對消毒劑的抵抗力增強(qiáng)。研究表明，形成生物被膜的表皮葡萄球菌對常用于表皮葡萄球菌治療的抗生素的耐受性明顯增強(qiáng)[3]。與浮游菌相比，形成生物被膜的細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，可以逃避宿主免疫作用和抗生素殺傷，使得感染部位細(xì)菌難以徹底清除，導(dǎo)致感染久治不愈，因此，新型抗菌藥物的研發(fā)與應(yīng)用具有重要意義。

近年來，納米銀(AgNPs)由于自身的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，在抗菌抗生物被膜方面受到廣泛的關(guān)注。AgNPs對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性都具有明顯的抗菌和抗生物被膜作用，有研究報(bào)道了AgNPs對多重耐藥肺炎克雷伯菌的抗菌和抗生物被膜的作用[1]。研究表明，AgNPs能有效抑制枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌的生長[4]，AgNPs對多重耐藥銅綠假單胞菌具有明顯的抗菌作用[5]。AgNPs的抗菌、抗生物被膜作用已被廣泛證實(shí)，但其作用機(jī)制尚未得到充分闡明。本文主要從AgNPs的抗菌機(jī)制、AgNPs抗生物被膜機(jī)制以及AgNPs的應(yīng)用前景和局限性等方面闡述AgNPs抗菌及抗生物被膜的研究進(jìn)展。

1 納米銀

AgNPs是以原子結(jié)構(gòu)組成的納米銀粒子，粒徑在1 nm～100 nm之間，因其具有高效、廣譜、不易產(chǎn)生耐藥的特點(diǎn)，被認(rèn)為是抗生素潛在的優(yōu)質(zhì)替代品。AgNPs可以通過物理、化學(xué)和生物方法制備，其中物理方法速度快，不涉及危險(xiǎn)化學(xué)品，但產(chǎn)能低、耗能高；化學(xué)方法生產(chǎn)方便成本低、產(chǎn)量高，但涉及危險(xiǎn)化學(xué)品、不純且可能不穩(wěn)定。目前，生物方法被認(rèn)為是一種簡單、無毒、可靠和綠色的方法[6]。AgNPs的生物活性取決于表面化學(xué)、大小、尺寸分布、形狀、顆粒形態(tài)、顆粒組成、涂層、聚集和溶解速率、溶液中的顆粒反應(yīng)性、離子釋放效率和細(xì)胞類型，此外，用于合成AgNPs的還原劑類型是決定細(xì)胞毒性的關(guān)鍵因素[7]。

2 AgNPs的抗菌機(jī)制

大量的研究表明AgNPs具有顯著抗菌作用，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌都有較強(qiáng)的抗菌或殺菌作用。AgNPs的抗菌機(jī)制主要包括破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、DNA損傷、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、抑制重要功能蛋白等。

2.1 AgNPs對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞

細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是細(xì)菌的重要保護(hù)屏障，AgNPs的作用會破壞這個屏障。據(jù)報(bào)道，AgNPs與細(xì)菌直接接觸后可附著在細(xì)胞壁上，致使糖鏈斷裂，改變細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的總構(gòu)型，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁被破壞，進(jìn)一步滲透，從而改變膜的理化性質(zhì)，進(jìn)而引起膜內(nèi)物質(zhì)的泄露而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[8]。研究證明，沙門氏菌內(nèi)膜的通透性會隨著AgNPs作用濃度的增加而增加[9]。由心葉青牛膽莖提取物還原合成的AgNPs與金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌膜蛋白的相互作用，導(dǎo)致zeta電位的交替與膜透性的增強(qiáng)，破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[10]。由黃孢原毛平革菌提取物還原合成的AgNPs能使大腸埃希氏菌細(xì)胞膜的完整性喪失[11]。由于AgNPs對細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞外聚合物的產(chǎn)生減少，細(xì)胞糖類、蛋白泄漏增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡[1,12]。

2.2 AgNPs造成DNA損傷

DNA是細(xì)菌的重要遺傳物質(zhì)，AgNPs可使DNA不再隨機(jī)的分布于核區(qū)，而是在核區(qū)濃縮呈緊張狀態(tài)、進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，抑制細(xì)菌的翻譯過程，或是直接造成DNA的損傷[13]。由香菜葉提取物還原合成的AgNPs作用于枯草桿菌后釋放Ag+介導(dǎo)DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[14]。AgNPs對大腸埃希氏菌的DNA有損傷[15]。

2.3 AgNPs引起氧化應(yīng)激

AgNPs導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是其發(fā)揮抗菌作用的重要原因。研究表明，AgNPs通過促進(jìn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致過量活性氧(ROS)產(chǎn)生，造成氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)AgNPs導(dǎo)致多重耐藥銅綠假單胞菌內(nèi)抗氧化酶如過氧化物酶、過氧化氫酶活性下降，無法消除過量的ROS，引起氧化和抗氧化的失衡導(dǎo)致細(xì)菌死亡[5]。由槲皮素還原合成的AgNPs作用于銅綠假單胞菌葡萄球菌后，谷胱甘肽的濃度下降，產(chǎn)生過量的ROS使細(xì)菌抗氧化系統(tǒng)不堪重負(fù)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激并最終喪失活性[16]。

3 AgNPs抗生物被膜機(jī)制

3.1 細(xì)菌生物被膜

3.1.1 細(xì)菌生物被膜的結(jié)構(gòu) 生物被膜是指細(xì)菌黏附于表面形成的自我保護(hù)的細(xì)菌結(jié)構(gòu)[18]。生物被膜主要由兩部分構(gòu)成，分別是微生物細(xì)胞及細(xì)胞外聚合物(EPS)[19]，其中微生物細(xì)胞附著在物體表面，由EPS組成的復(fù)雜基質(zhì)包裹，其主要成分包括多糖、胞外DNA和蛋白質(zhì)[20]，這樣的組成增強(qiáng)了細(xì)菌抵抗宿主免疫反應(yīng)及抗菌藥物的攻擊能力。EPS由細(xì)菌自身分泌或營養(yǎng)豐富的環(huán)境提供，因此，生物被膜的結(jié)構(gòu)和組成，在細(xì)菌之間可能有所不同，同一種細(xì)菌在不同的環(huán)境條件下也可能存在幾種不同類型的生物被膜。

3.1.2 生物被膜的形成過程 細(xì)菌生物被膜既可以在環(huán)境非生物表面形成，也可以在生物表面形成，并且受到多種信號及基因的調(diào)控。一般認(rèn)為生物被膜的形成過程主要分為五個階段[21]；第一階段細(xì)菌可逆的附著在機(jī)體的表面；第二階段細(xì)菌不可逆轉(zhuǎn)地黏附定植，這一階段能夠使細(xì)菌牢固地黏附在表面；第三階段是形成菌落之后結(jié)構(gòu)分化；第四階段是成熟發(fā)展；第五階段是解聚再定植，這一階段生物被膜內(nèi)細(xì)菌再次成為浮游狀態(tài)[22]，可滲透和定植于其他部位再形成生物被膜，構(gòu)成一個新的循環(huán)的過程。因此，病原細(xì)菌形成生物被膜后不但可增加自身的存活概率，而且能對宿主造成持續(xù)的感染。

3.1.3 生物被膜的危害 當(dāng)前，形成生物被膜的病原微生物感染已成為醫(yī)療衛(wèi)生的一個棘手問題，細(xì)菌能夠黏附醫(yī)療器械和體內(nèi)植入物品上形成生物被膜，導(dǎo)致感染并難于清除，最后造成嚴(yán)重的醫(yī)療事故[22-23]。細(xì)菌形成生物被膜后，耐藥性增強(qiáng)[24]，抗生素的治療效果大大降低。

3.2 AgNPs的抗生物被膜機(jī)制

細(xì)菌對抗生素的抗性可能是由于生物被膜基質(zhì)中抗生素滲透性差，微環(huán)境改變或細(xì)菌的適應(yīng)性反應(yīng)引起的，如果能夠有效抑制生物被膜的形成，就能夠大大提高抗生素的治療效果。AgNPs的抗生物被膜活性已經(jīng)在很多研究中得到了證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)通過生物方法合成的AgNPs表現(xiàn)出生物被膜破壞性特性，減少大腸埃希氏菌生物被膜量[25]。AgNPs對多重耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有較好的抗生物被膜活性[26]。目前，AgNPs抑制細(xì)菌生物被膜的機(jī)制主要包括抑制細(xì)菌生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)、阻止細(xì)菌黏附、阻斷群體感應(yīng)、氧化應(yīng)激等。

3.2.1 抑制細(xì)菌生物被膜相關(guān)基因的表達(dá) 生物被膜的形成受多種信號和基因的調(diào)控，相關(guān)研究表明AgNPs能抑制細(xì)菌生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)。AgNPs通過抑制生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)抑制細(xì)菌生物被膜的生長[27]。AgNPs(Ag@Glu/TscNPs)能通過抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)生物被膜相關(guān)基因ICA和ICAD的表達(dá)來抑制其生物被膜的形成[28]。由香根草根提取物合成的AgNPs(VzAgNPs)通過下調(diào)生物被膜形成相關(guān)基因bsmB、fimA和fimC來抑制黏質(zhì)沙雷氏菌的生物被膜的形成[29]。AgNPs通過減少bap、OmpA和csuA/B的表達(dá)而減少鮑曼芽孢桿菌生物被膜的形成[30]。

3.2.2 阻止細(xì)菌黏附或聚集 細(xì)菌黏附于表面是生物被膜形成的首要條件，AgNPs通過阻止細(xì)菌黏附或聚集來破壞生物被膜的形成。研究表明，AgNPs通過破壞細(xì)菌胞外聚合物(EPS)基質(zhì)來阻止細(xì)菌黏附或聚集，進(jìn)一步影響細(xì)菌生物被膜的形成[1]。VzAgNPs作用后黏質(zhì)沙雷氏菌EPS產(chǎn)生量顯著減少[29]。此外，有研究報(bào)道AgNPs通過釋放銀離子(Ag+)改變生物被膜的黏附性、結(jié)構(gòu)和孔隙率[31]，達(dá)到阻止細(xì)菌黏附或聚集作用。

3.2.3 阻斷群體感應(yīng) 群體感應(yīng)是細(xì)菌間的通信系統(tǒng)，可利用信號分子來調(diào)節(jié)生物被膜形成。研究發(fā)現(xiàn)[32],AgNPs可以通過抑制LasI/RhlI合成酶來阻斷信號分子的生物合成，從而影響生物被膜形成。AgNPs降低了信號分子鄰氨基苯甲酸的濃度，進(jìn)而影響群體感應(yīng)系統(tǒng)[33]。單寧酸與AgNPs復(fù)合物具有抑制群體感應(yīng)信號子生成的作用[34]。

3.2.4 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激 AgNPs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是其抗菌機(jī)制之一，也是其抗生物被膜機(jī)制之一。研究表明,AgNPs通過誘導(dǎo)銅綠假單胞菌發(fā)生氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗生物被膜作用[33]。

4 AgNPs的應(yīng)用前景與局限

AgNPs因其獨(dú)特的性質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛，主要應(yīng)用領(lǐng)域包括了抗菌、抗病毒、抗癌、組織工程以及傷口護(hù)理等。近年來AgNPs廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，但它的毒性也受到廣泛關(guān)注。研究表明體內(nèi)使用高劑量AgNPs時會對體內(nèi)生化指標(biāo)造成負(fù)面影響，甚至對哺乳動物的生殖發(fā)育會產(chǎn)生不良影響[35]。但有研究發(fā)現(xiàn)在可接受濃度下AgNPs對實(shí)驗(yàn)動物未造成不良影響[36]。AgNPs的安全性可能與AgNPs的合成方式、形態(tài)、劑量、結(jié)構(gòu)及顆粒大小密切相關(guān)。AgNPs的長期使用也會使微生物產(chǎn)生耐藥性，研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)暴露于亞抑制濃度的AgNPs的大腸埃希氏菌會對AgNPs產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，這可能是細(xì)菌通過增加對AgNPs釋放的銀離子的外排而產(chǎn)生抗性[37]。

AgNPs是一種新型廣譜高效的抗菌及抗生物被膜的生物材料，通過綠色合成、顆粒大小、形態(tài)、使用劑量、包被等降低其毒性的研究，為開發(fā)新型廣譜高效、不易耐藥的生物醫(yī)藥及臨床應(yīng)用提供可靠數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

5 小結(jié)

AgNPs是良好的廣譜抗菌材料，論文從AgNPs的抗菌機(jī)制、抗生物被膜機(jī)制闡述了AgNPs對細(xì)菌的作用機(jī)制，AgNPs通過多種機(jī)制產(chǎn)生抗菌抗生物被膜作用，目前AgNPs廣泛的抗菌抗生物被膜作用已經(jīng)被證明，但是其抗菌抗生物被膜的機(jī)制仍不完全清楚，并且因其本身的性質(zhì)，它的應(yīng)用也存在一定的局限性。探索AgNPs的具體作用機(jī)制及如何克服其毒性將是未來相關(guān)研究的重點(diǎn)。