謝從寶, 祝強(qiáng)強(qiáng), 張 濤, 寧麗紅*,, 位燈國*,

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室，動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.湖北洪山實驗室，武漢430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，獸藥殘留國家基準(zhǔn)實驗室及農(nóng)業(yè)部獸藥殘留檢測重點實驗室，武漢 430070；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)深圳營養(yǎng)與健康研究院，深圳 518000；5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所和嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心，深圳 518000；6.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 交叉科學(xué)研究院，武漢430070；7.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，武漢 430070；8.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070)

植物病毒病，又稱“植物癌癥”，每年在全世界范圍造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá) 600 億美元，其中僅糧食作物損失就高達(dá) 200 億美元[1-2]。蔬菜作為我國僅次于糧食作物的第二大作物，近年來種植規(guī)模和面積不斷增加，蔬菜病毒病的發(fā)病率也呈指數(shù)級增長，然而目前可用于防治植物病毒病的藥劑較少，因此，尋找抗植物病毒藥物的新靶點，開發(fā)高效、低毒的植物病毒生態(tài)農(nóng)藥成為近年來農(nóng)藥學(xué)研究的熱點。

G-四鏈體(G4s)是一種特殊的核酸高級結(jié)構(gòu)，4 個鳥嘌呤堿基通過Hoogsteen 氫鍵配對形成一個鳥嘌呤堿基平面 (G-quartet)，多個堿基平面堆積成非常穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)[3]。形成G-四鏈體的序列廣泛存在基因組中的某些重要生物學(xué)功能區(qū)域，其在病毒基因組中的形成或解鏈可調(diào)節(jié)基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程，進(jìn)而影響病毒增殖[4]。前期工作表明，植物病毒基因組中存在大量的G-四鏈體可形成序列 (putative G-quadruplex sequences,PQS)，開展G-四鏈體結(jié)構(gòu)-功能研究，篩選靶向G-四鏈體配體，有望發(fā)現(xiàn)新的植物病毒抑制劑。

番茄叢矮病毒 (tomato bushy stunt virus，TBSV)屬于番茄叢矮病毒科 (Tombusviridae) 的番茄叢矮病毒屬 (Tombusvirus)[5]。感染TBSV 會導(dǎo)致寄主生長發(fā)育遲緩、矮化 (如番茄等)，葉片出現(xiàn)斑點、變形或黃化 (如天竺葵等)，果實變形或缺失[6-7]。該病毒于1935 年首次在愛爾蘭的番茄上被發(fā)現(xiàn)，廣泛分布在多個歐洲國家、北美及南美地區(qū)，是一種植物檢疫有害生物。然而，近年來在我國也分離出TBSV，其給蔬菜、花卉及其他農(nóng)作物的產(chǎn)量及質(zhì)量帶來嚴(yán)重?fù)p失。有關(guān)TBSV 的基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等分子機(jī)制的研究已較為成熟，TBSV 常被作為研究病毒與寄主互作的模式病毒[8-9]。揭示TBSV 基因組中G-四鏈體的結(jié)構(gòu)及功能，有望為植物病毒基因中的G-四鏈體研究奠定基礎(chǔ)。

TBSV 是一種正義ssRNA 病毒，全長4775 nt，基因組含有5 個ORF，編碼5 個蛋白。ORF2 (gp2基因) 編碼一個33 kD 的蛋白 (p33)[9]。ORF1 (gp1基因) 通過通讀p33 終止密碼子翻譯生成92 kD 的蛋白 (p92)，其具有復(fù)制酶活性。蛋白p33 和p92的正常表達(dá)是病毒復(fù)制的第1 步，p33 蛋白協(xié)同p92 蛋白結(jié)合單鏈核酸，二者與病毒RNA 及寄主相關(guān)因子共同形成復(fù)制酶-RNA 復(fù)合體，來調(diào)控病毒增殖[10]。ORF3 (gp3基因) 編碼41 kD 的衣殼蛋白 (p41)。ORF4 (gp4基因) 和ORF5 (gp5基因) 分別編碼移動蛋白 (p22) 和多功能蛋白 (p19)，這兩種蛋白質(zhì)從重疊的基因序列中表達(dá)。p22 是一種RNA 結(jié)合蛋白，決定病毒運輸，可與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合。p19 是一種多功能蛋白，充當(dāng)病毒基因沉默的抑制子。p19 蛋白與siRNA 結(jié)合，阻止siRNA 與沉默復(fù)合體整合。在感染時，亞基因組以獨特的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄：侵染前期，sg mRNA2 先轉(zhuǎn)錄；侵染后期，sg mRNA1 轉(zhuǎn)錄[11-12]。TBSV 基因組與亞基因組的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

本研究擬基于基因組數(shù)據(jù)庫中5 株TBSV 毒株進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鑒定TBSV 基因中PQS的保守性，然后綜合保守性分析、序列特征和所處基因組位置等信息，選取兩條位于gp1和gp2區(qū)域的PQS 進(jìn)行進(jìn)一步研究，通過生物物理試驗證明該序列可折疊成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，而小分子卟啉可調(diào)節(jié)G-四鏈體的穩(wěn)定性，并呈現(xiàn)抗病毒活性。卟啉衍生物是廣泛存在于自然界中的天然產(chǎn)物，天然產(chǎn)物衍生物具有高效、低風(fēng)險特性，克服了常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥普遍存在的高毒、高殘留和對其他非靶標(biāo)生物的毒害。對其進(jìn)行修飾改造，使其有望成為良好的生態(tài)友好型農(nóng)藥。

1 材料與方法

1.1 供試材料和儀器

本研究所用的寡核苷酸均購自TSINGKE (中國武漢)，形成寡核苷酸的G-四鏈體在緩沖液(20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4pH 7.0 和100 mmol/L KCl) 或10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)、100 mmol/L KCl 和0.1 mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸，pH 7.5)中退火，95 ℃孵育5 min 后逐漸冷卻至室溫，置于4 ℃?zhèn)溆??；衔颪-甲基中卟啉IX (NMM)、端粒酶抑制劑Braco 19 和Pyridostatin (PDS)，購自北京大學(xué)國家化合物庫 (PKU-CNCL)。8%寧南霉素水劑 (ningnanmycin AS，CAS:156410-09-2)，購于德強(qiáng)生物股份有限公司 (PD20097122)。利福平(Rif)、壯觀霉素(Spec)、乙酰丁香酮和2-(N-嗎啡啉) 乙基磺酸(MES)，純度 ＞ 95%，均購自索萊寶(Solarbio)；含有綠色熒光蛋白 (GFP) 的TBSV病毒克隆載體，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李峰課題組提供。

LB (Luria-Bertani) 液體培養(yǎng)基：將10 g 胰蛋白胨(tryptone)、5 g 酵母浸出物(yeast extract)、5 g NaCl，完全溶于適量 ddH2O 中，并定容至 1 L，121 ℃高壓蒸氣滅菌 15 min，室溫保存。

Chirascan V100 圓二色光譜儀 (英國應(yīng)用光物理公司)；MOS-500 分光光度計(bio-logic，法國)；RF-5301PC 熒光光譜儀 (日本島津)。

1.2 生物信息學(xué)分析

綜合利用QGRS Mapper、Quadparser、Quadfinder 和G4 Hunter 等G-四鏈體預(yù)測軟件對病毒基因組序列中具有(G2+N1-7)3G2+特征的G-四鏈體可形成序列進(jìn)行分析。從NCBI 的Genome 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載5 條病毒毒株的全基因組序列。利用MEGA 6 軟件的Alignment-ClustalW 功能，將不同病毒毒株的研究序列進(jìn)行序列比對，并通過DNAMAN 6.0 進(jìn)行作圖。每條PQS 的保守性為具有相同PQS 序列的毒株數(shù)目除以參與比較的總毒株數(shù)目 (若存在多個位置相同的序列，則取不同位置的平均值)[13]。

1.3 工作曲線Job Plot

在G-四鏈體和化合物NMM 的濃度之和保持在3 μmol/L 不變的情況下，通過連續(xù)改變化合物與G-四鏈體之間的比例，評估TBSV G-四鏈體和NMM 之間的結(jié)合比例[14]。將含有適量NMM 的樣品與相應(yīng)量退火后的G-四鏈體混合，在30 ℃下孵育10 min 后測定熒光信號。在激發(fā)波長405 nm處，溶液的熒光強(qiáng)度隨加入的NMM 摩爾分?jǐn)?shù)的變化而變化。當(dāng)比例等于化合物與核酸的計量比時，化合物的熒光響應(yīng)最強(qiáng)。

1.4 CD 光譜分析

將TBSV-PQS2 (20 μmol/L) 與TBSV-PQS4(20 μmol/L) 分別溶于10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)和 0.1 mmol/L EDTA (pH 7.5) 或10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)、100 mmol/L KCl 和0.1 mmol/L EDTA (pH 7.5) 溶液中。在室溫下使用1 mm 徑長的石英比色皿進(jìn)行CD 光譜分析。光譜采集范圍為360～220 nm，掃描速度為50 nm/min。帶寬為1.0 nm，響應(yīng)時間為2.0 s。CD 熔融實驗中波長固定為260 nm，溫度從4 ℃以1 ℃/min 升至95 ℃，每攝氏度掃描一次，將溫度與對應(yīng)CD 光譜信號值進(jìn)行擬合得到熔融曲線。每一組CD 光譜信號都會采集一組緩沖液的數(shù)據(jù)作為背景扣除[15]。

1.5 紫外光譜與熒光光譜

通過紫外吸收光譜確定化合物NMM 的紫外吸收波長，并以此波長為參照，綜合熒光光譜結(jié)果確定NMM 的激發(fā)波長。儀器參數(shù)設(shè)置為：掃描波長為200～600 nm，速度為中速。光徑為1 cm的石英比色皿，樣品體積為100 μL。

熒光光譜數(shù)據(jù)用熒光光譜儀在室溫下采集。10.0 μmol/L 退火后的RNA 樣品與3.0 μmol/L 的NMM 在緩沖液(20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4pH 7.0、100 mmol/L KCl 和0.1 mmol/L EDTA pH 7.5)中混合，30 ℃下孵育10 min 后采集光譜數(shù)據(jù)。

為了測定NMM 隨RNA 樣品的熒光變化，控制NMM 的濃度恒定為3 μmol/L，0～10 μmol/L 退火后的RNA 分別與NMM 在緩沖液20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4pH 7.0, 0.1 mmol/L EDTA (pH 7.5) 中混勻，在30 ℃下孵育10 min 后進(jìn)行熒光光譜測量。激發(fā)波長為405 nm，發(fā)射狹縫寬度和激發(fā)狹縫寬度均為5 nm，掃描范圍為415～800 nm，所有的熒光測量試驗均在室溫下進(jìn)行。利用TBSVPQS2 滴定NMM 的熒光變化，按 (1) 式計算KD值。

式中：Fmin表示游離配體NMM 在最大發(fā)射波長611nm 處的熒光發(fā)射強(qiáng)度；Fmax表示飽和時的最大熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示存在不同濃度RNA 時的熒光強(qiáng)度，M表示TBSV-PQS2 的濃度。

1.6 農(nóng)桿菌侵染性克隆

將病毒基因組克隆到載體，再通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒RNA，是制備RNA 病毒侵染性克隆的常用方法。本研究用綠色熒光蛋白基因 (GFP) 代替TBSV 病毒的外殼蛋白基因 (CP) 構(gòu)建的表達(dá)載體，通過檢測熒光強(qiáng)度，篩選抑制病毒活性的小分子配體。農(nóng)桿菌在含有10 mg/L Rif 和10 mg/L Spec 的LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)條件為28 ℃，搖床參數(shù)220 r/min；1 L LB 培養(yǎng)基中含酵母抽提物5 g、氯化鈉10 g 和色氨酸10 g，用氫氧化鈉調(diào)整pH 值至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。將培養(yǎng)菌液與LB 培養(yǎng)基按體積比1 : 100 的比例誘導(dǎo)。誘導(dǎo)液中加入40 μmol/L 的乙酰丁香酮、4.5 mmol/L 的MES 和適量的抗生素Rif 和Spec；侵染前，將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌懸浮液置于懸浮緩沖液(含有150 μmol/L 乙酰丁香酮和10 mmol/L 氯化鎂) 中，調(diào)節(jié)OD600值至0.01～0.1，室溫靜置2～4 h。注射方式為葉背注射，每株煙草注射3 片葉片，每片葉片主葉脈兩側(cè)各注射一個點，每點注射范圍約1 cm2。注射24 h 后將煙草置于自動轉(zhuǎn)盤上，每小時拍照記錄1 次，連續(xù)觀察7 d。

2 結(jié)果與討論

2.1 TBSV- PQS 序列的生物信息學(xué)分析

NCBI 中有5 條完整的TBSV 的基因組序列。通過Quadpaser 程序?qū)BSV (NC_001554.1，見表S1) 的正鏈及負(fù)鏈進(jìn)行PQS 搜索，發(fā)現(xiàn)了16 條G2-PQS，不存在G3-PQS。除了TBSVPQS14、TBSV-PQS15 和TBSV-PQS16 這3 條分布在TBSV 基因組的負(fù)鏈，其余均分布在TBSV基因組的正鏈 (表1，圖2)。由表1 可以看出：12條G2-PQS 單獨存在于基因中，4 條存在于G-四鏈體簇中；僅有一條TBSV-PQS13 存在于非編碼區(qū)，其他序列在CDS 區(qū)域。通過MEGA 6 及DNAMAN 6.0 軟件對5 株TBSV 毒株中每個PQS 的序列保守性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的G2-PQS 除3 條序列 (TBSV-PQS7、TBSV-PQS14 和TBSV-PQS15) 外，其他G2-PQS 序列的保守性均為100% (表1，圖2)，其中G2-PQS、G3-PQS 和G-四鏈體簇結(jié)構(gòu)如圖3 所示。

圖2 G2-PQS 在TBSV 基因組的分布及保守性Fig.2 Distribution and conservation of PQS in TBSV genome

圖3 G2-四鏈體(A)、G3-四鏈體(B)和G-四鏈體簇(C)的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Schematic diagrams of the G2-quadruplex (A),G3-quadruplex (B), and G-quadruplex clusters (C)

表1 TBSV 中PQS 的序列信息及所在基因組的位置Table 1 Sequence information and the location of the genome of PQS in TBSV

與其他正單鏈RNA 病毒類似，TBSV 的復(fù)制也涉及多步反應(yīng)。復(fù)制相關(guān)蛋白p33 和p92 的正確翻譯是病毒基因組復(fù)制的第1 步，也是最關(guān)鍵的一步。在TBSV 病毒基因組序列中，只有近5′端的ORF (如p33 和p92) 才可以被直接翻譯，位于3′端的ORF (如p41、p22 和p19) 則不能被直接翻譯表達(dá)。p92 蛋白的N 端包含著完整的p33 的序列，TBSV 的gp1基因 (編碼p92 蛋白的基因) 是通過通讀gp2基因 (編碼p33 蛋白的基因)的終止密碼子的方式而得來的。在宿主細(xì)胞中，通讀產(chǎn)物p92 的含量僅為p33 的5%。TBSV 病毒復(fù)制需要這兩個蛋白的共同參與，暗示著p92 中的p33 區(qū)域與獨立的p33 在復(fù)制中的功能可能不同。病毒復(fù)制的第2 步需要形成復(fù)制酶-RNA 復(fù)合體，其中包含p33、p92、病毒RNA 模板以及其他宿主因子。所以，p33 與復(fù)制酶-RNA 復(fù)合體的組裝及定位有關(guān)，p92 具有3 個RNA 結(jié)合域，可以與病毒基因組RNA 結(jié)合，與子代病毒RNA 合成直接相關(guān)。TBSV 亞基因組的轉(zhuǎn)錄與p41、p22和p19 的表達(dá)相關(guān)，多種RNA 順式作用元件和病毒蛋白參與了這一過程。在轉(zhuǎn)錄過程中，病毒編碼的p33 和p92 蛋白參與了整個轉(zhuǎn)錄過程，并對病毒RNA 和sg mRNAs 間的表達(dá)比例起著重要的調(diào)節(jié)作用[5,9]。因此，本研究重點關(guān)注gp1基因和gp2基因中的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

根據(jù)loop 長度選擇合適的G4 序列：G-四分體數(shù)目、loop 長度及l(fā)oop 組成等因素對DNA 及RNA G-四鏈體的穩(wěn)定性及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)均會產(chǎn)生一定的影響。本研究中，按照 (G2+N1-7)3G2+特征的序列來預(yù)測G-四鏈體，但過長的loop 并不利于G2-PQS 結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定[16-17]。Qin 等[18]發(fā)現(xiàn)，所有測試的loop 長度為1 nt 的DNA G2-PQS 均形成了平行構(gòu)象，而loop 長度為3 nt 的序列均形成了反平行構(gòu)象。其原因可能是loop 長度為1 nt 或3 nt的G-四鏈體具有很高的熱穩(wěn)定性，可以克服loop組成改變的影響[18]。在人類的基因組中，loop 長度為1～3 nt 是G2-PQS 最常見的序列，并且loop 長度為{1、1、1}的集合約占所有G2-PQS 的4.6%[19-20]。

因此，綜合考慮序列保守性、PQS 所在基因的功能和PQS 序列特征3 個方面，本研究選擇了表1中紅色的序列作為進(jìn)一步研究對象：TBSV-PQS2(5′-GGAUGGAGUGGAGG-3′) 和TBSV-PQS4 (5′-GGCGGUUGGAAGAUGG-3′)。

2.2 TBSV-PQS 的體外結(jié)構(gòu)鑒定

采用CD 光譜分析TBSV-PQS2 和TBSVPQS4 序列能否折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA G-四鏈體幾乎全部采取平行構(gòu)象，CD 特征峰在240 nm 附近顯示負(fù)峰，在265 nm 附近顯示正峰。因此，在CD 光譜中，RNA G-四鏈體比DNA G-四鏈體呈現(xiàn)的拓?fù)涠鄻有愿賉21]。如圖4A，TBSV-PQS2 在不含 K+條件下，G-四鏈體結(jié)構(gòu)的特征峰很弱；而在緩沖溶液 (10 mmol/L Tris-HCL(pH 7.0)和 100 mmol/L KCl ) 中，TBSV-PQS2 的CD 光譜在240 nm 附近顯示負(fù)峰，在265 nm 附近顯示正峰，證明其形成了典型的平行RNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)。在近生理濃度鉀離子條件下更容易形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，說明G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有在體內(nèi)形成的潛力。

與TBSV-PQS2 一樣，在不含鉀離子的溶液中，TBSV-PQS4 G-四鏈體CD 特征信號很低，而在高K+濃度溶液條件下，TBSV-PQS4 的CD 特征信號在265 nm 附近出現(xiàn)了一個正峰，在240 nm附近出現(xiàn)負(fù)峰，也是一個平行的RNA G-四鏈體體結(jié)構(gòu) (如圖4B)。說明K+濃度同樣影響TBSVPQS4 G-四鏈體的形成。

圖4 TBSV-PQS2 與TBSV-PQS4 的圓二色光譜圖Fig.4 Circular dichroism (CD) spectra of TBSV-PQS2 and TBSV-PQS4

2.3 與TBSV-PQS2 和TBSV-PQS4 互作的G-四鏈體配體篩選

為了篩選能夠與TBSV-PQS 相互作用的小分子配體，選擇幾種已經(jīng)被廣泛研究可以與G-四鏈體結(jié)合且抑制病毒增殖的小分子配體，包括卟啉類化合物NMM[22]、吖啶類化合物Braco 19[23-24]和喹啉類化合物PDS[25-26](結(jié)構(gòu)式見圖式1)進(jìn)行初步的配體篩選研究，發(fā)現(xiàn)典型的G-四鏈體配體NMM與TBSV-PQS2 和TBSV-PQS4 存在較強(qiáng)的相互作用 (如圖式1 和圖S1 所示)。

圖式 1 3 種配體的分子結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Molecular structural formulas of three ligands

G-四鏈體配體對不同的G-四鏈體結(jié)構(gòu)可能具有選擇性，研究發(fā)現(xiàn)，NMM 可以穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)，調(diào)控病毒的增殖過程。NMM 結(jié)合G-四鏈體后，為了有效地進(jìn)行π-π 堆疊，可以調(diào)整其空間構(gòu)象以匹配G-四鏈體結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度[27]。這種特殊性質(zhì)使其成為適用于G-四鏈體的特異性熒光探針。

本研究首先通過紫外熒光法測定了TBSVPQS2 和TBSV-PQS4 與NMM 的相互作用。結(jié)果表明，加入TBSV-PQS 后NMM 的紫外吸收峰發(fā)生了紅移 (圖5A)，這是由于卟啉化合物插入核酸后，卟啉大環(huán)的電子云密度受核酸堿基上電子云的影響而發(fā)生了改變，說明NMM 能夠很好的結(jié)合TBSV-PQS。NMM 本身具有很弱的熒光[28]，單獨檢測發(fā)現(xiàn)，其在最大發(fā)射波長611 nm 僅顯示出微弱的熒光信號 (圖5B)；而當(dāng)加入G-四鏈體后，熒光會增強(qiáng)，TBSV-PQS2 與NMM 有熒光響應(yīng)，且最大熒光強(qiáng)度與不加入G-四鏈體時的比值為：FINMM+TBSV-PQS2/FINMM= 40 (cTBSV-PQS2/cNMM= 3)。在NMM 溶液中加入TBSV-PQS4 后，熒光強(qiáng)度也會增強(qiáng)，且最大熒光強(qiáng)度與不加入G-四鏈體時的比值為：FINMM+TBSV-PQS4/FINMM= 27 (cTBSV-PQS4/cNMM= 3)，說明相比于TBSV-PQS2，TBSVPQS4 與NMM 的結(jié)合較弱。

圖5 NMM 與TBSV-PQS 互作的紫外光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.5 UV (A) and fluorescence spectra (B) of the interaction between NMM and TBSV-PQS

CD 研究發(fā)現(xiàn)，加入NMM 后，TBSV-PQS2和TBSV-PQS4 在265 nm 處的CD 信號明顯增強(qiáng)，也證明了NMM 可以穩(wěn)定TBSV-PQS 結(jié)構(gòu)(cTBSV-PQS2/cNMM= 1.5)。相同濃度下，TBSVPQS2 與NMM 結(jié)合后，呈現(xiàn)的CD 峰強(qiáng)于TBSVPQS4 與NMM 結(jié)合后呈現(xiàn)的CD 峰 (圖6A，6B)，這與紫外熒光光譜的檢測結(jié)果相一致。

圖6 TBSV-PQS2 (A)和TBSV-PQS4 (B)與NMM 的CD 光譜圖Fig.6 CD spectra of TBSV-PQS2 (A) and TBSV-PQS4 (B) with NMM

CD 熔融實驗是一種考察G-四鏈體穩(wěn)定性的方法，在不加入化合物NMM 的條件下，TBSVPQS2 的熔融溫度顯著高于TBSV-PQS4，說明TBSV-PQS2 的穩(wěn)定性顯著高于TBSV-PQS4 (圖7A)，TBSV-PQS2 在自然條件下穩(wěn)定存在的可能較大；加入化合物NMM 后，TBSV-PQS2 的穩(wěn)定性進(jìn)一步提高 (Δtm= 9.2 ℃) (圖7B)，說明NMM 可以顯著穩(wěn)定TBSV-PQS2 的結(jié)構(gòu)。因此選取TBSVPQS2 作為進(jìn)一步研究的對象。

圖7 TBSV-PQS2 與TBSV-PQS4 的熱熔解曲線(A)和TBSV-PQS2 在存在/不存在NMM 時的熱熔解曲線(B)Fig.7 Thermal melting curve of TBSV-PQS2 and TBSV-PQS4(A), and thermal melting curve of TBSV-PQS2 in the presence/absence of NMM(B)

熒光滴定分析用于測量NMM 與TBSV-PQS2的結(jié)合強(qiáng)度。如圖8A 所示，TBSV-PQS2 誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性增加。根據(jù)熒光滴定數(shù)據(jù)及Benesi-Hilde brand 方程擬合，確定NMM 與TBSV-PQS2 之間的解離常數(shù)(KD)為3.81 μmol/L(圖8B)。

圖8 NMM 與不同濃度TBSV-PQS2 的熒光滴定光譜(A)和使用線性擬合方程測定NMM 與TBSV-PQS2 的結(jié)合常數(shù)(B)Fig.8 Fluorescence titration spectra of NMM with different concentrations of TBSV-PQS2 (A) and determination of binding constants of NMM to TBSV-PQS2 using a linear fitted equation (B)

為了進(jìn)一步確定TBSV-PQS2 與NMM 的結(jié)合比，以NMM 占樣品總濃度的比例為橫坐標(biāo)，相對熒光強(qiáng)度（△FI = 實際熒光值 - 對應(yīng)濃度下NMM 熒光值）為縱坐標(biāo)繪制Job Plot 工作曲線，用Origin 8.0 軟件擬合相對熒光值，發(fā)現(xiàn)擬合交點為0.56，表明NMM 與TBSV-PQS2 的結(jié)合比為1 : 1(圖9)，說明兩者之間只存在一個結(jié)合位點。

2.4 卟啉衍生物NMM 對TBSV 病毒增殖的抑制作用

TBSV-PQS2 和NMM 的CD 熔融實驗結(jié)果表明，NMM 可以穩(wěn)定這個G-四鏈體結(jié)構(gòu)，但TBSV-PQS4 與NMM 的結(jié)合不如TBSV-PQS2 與NMM 的結(jié)合穩(wěn)定，因此，選擇穩(wěn)定性更好的TBSV-PQS2 進(jìn)行TBSV-GFP 侵染性克隆，用于篩選抑制TBSV 病毒的小分子化合物。

以商品化植物病毒抑制劑寧南霉素作為陽性參照，選取不同濃度的G-四鏈體配體，如Braco19、PDS 和NMM 進(jìn)行抗病毒活性試驗。結(jié)果(圖10)發(fā)現(xiàn)，與PDS、Braco19 相比，NMM在低濃度 (20 μmol/L) 時即可顯著降低熒光蛋白的表達(dá)，抑制病毒增殖，即使5 μmol/L 的NMM 也呈現(xiàn)出了抑制效果 (圖S2)。

圖10 體內(nèi)篩選抑制TBSV 病毒增殖的小分子化合物Fig.10 In vivo screening of small molecule compounds that inhibit the proliferation of TBSV virus

3 結(jié)論

本研究基于對5 株TBSV 毒株的生物信息學(xué)分析，在TBSV 毒株基因組中預(yù)測出16 條PQS本研究序列。綜合考慮序列保守性、PQS 所在基因組的功能和PQS 序列特征3 個方面，選擇TBSV-PQS2 和TBSV-PQS4 作為進(jìn)一步研究對象。CD 光譜結(jié)果表明，PQS2 和PQS4 在近生理濃度鉀離子條件下均能夠形成平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)。通過紫外光譜和熒光光譜篩選出經(jīng)典的G-四鏈體配體卟啉衍生物NMM 與TBSV-PQS2 和TBSV-PQS4 存在較強(qiáng)的相互作用。G-四鏈體的穩(wěn)定性除了取決于序列本身G 堿基的含量、Loop 的長度之外，還與溶液環(huán)境和所結(jié)合的配體密切相關(guān)。植物病毒中PQS 的loop 一般比較長[29]，這直接導(dǎo)致植物病毒中的G-四鏈體的穩(wěn)定性可能相對較差。結(jié)合CD 熔融實驗結(jié)果，進(jìn)一步選擇結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更強(qiáng)、更容易在生物體內(nèi)存在的TBSVPQS2 作為研究對象，證明了NMM 可以穩(wěn)定TBSV-PQS2 的結(jié)構(gòu)，并通過Job Plot 曲線法驗證了TBSV-PQS2 G-四鏈體與NMM 的結(jié)合比為1 : 1。為了探究G-四鏈體配體抗植物病毒的潛力，針對TBSV-PQS2 進(jìn)行抗病毒活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)卟啉衍生物NMM 可以顯著降低熒光蛋白的表達(dá)，顯示出很好的抗TBSV 活性，可能延遲病毒的復(fù)制。G-四鏈體在TBSV 中的結(jié)構(gòu)與功能的研究為理解病毒復(fù)制機(jī)制、設(shè)計防治TBSV 的農(nóng)用藥物或培育抗病品種提供理論基礎(chǔ)，對設(shè)計高效、低風(fēng)險的生態(tài)農(nóng)用藥物具有廣泛的參考價值。