赫 丹, 徐劍宏, 仇劍波, 劉 馨, 高 弢,杜予州, 史建榮*,, LEE Yinwon

(1.揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，南京210014；3.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南京 210014；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；5.Department of Agricultural Biotechnology,Seoul National University, Seoul 08826, South Korea)

玉米穗腐病 (maize ear rot) 是玉米生長(zhǎng)后期的重要病害，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)72.48%[1]。自1946 年美國(guó)首次報(bào)道玉米灰色穗腐病以來，玉米穗腐病已在許多國(guó)家陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[2]。1987 年，我國(guó)首次報(bào)道了玉米穗腐病的主要致病菌為串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme，并于2003 年更名為輪枝鐮刀菌F.verticillioides[3]。迄今已鑒定出玉米穗腐病病原菌40 余種，輪枝鐮刀菌是我國(guó)目前報(bào)道較多的1種[4]。玉米感染穗腐病后會(huì)出現(xiàn)果穗腐爛，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，同時(shí)影響玉米的品質(zhì)[5]。此外，輪枝鐮刀菌侵染玉米后還會(huì)產(chǎn)生一類由不同多氫醇和丙三羧酸組成、結(jié)構(gòu)類似的水溶性雙酯化合物，統(tǒng)稱B 族伏馬毒素 (type B fumonisins，F(xiàn)Bs)，這些真菌毒素具有神經(jīng)毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性和肝毒性，嚴(yán)重威脅人類和其他動(dòng)物的生命健康[3]。其中，伏馬毒素B1(FB1)更是普遍存在于人類日常飲食之中，并已被國(guó)際癌癥研究中心 (International Agency for Research on Cancer，IARC) 評(píng)定為2B 類致癌物[6]。

盡管玉米穗腐病發(fā)生嚴(yán)重，并由此造成了重大經(jīng)濟(jì)損失和安全威脅，但其防治策略仍非常有限。目前生產(chǎn)中對(duì)該病害的防治主要以種植抗病品種和施用化學(xué)藥劑為主[7-8]。噴施化學(xué)殺菌劑可顯著降低玉米穗腐病的發(fā)病率，但目前國(guó)內(nèi)暫未見登記用于玉米穗腐病防治的專用殺菌劑。因此，迫切需要引進(jìn)和開發(fā)有效的化學(xué)藥劑用于防治輪枝鐮刀菌感染，以有效和可持續(xù)地控制玉米穗腐病的發(fā)生。

葉菌唑 (metconazole) 是1986 年由Kureha 公司研發(fā)的一種靶向真菌麥角甾醇生物合成的廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑[9]，具有用量低、活性高且對(duì)非靶標(biāo)生物低毒等優(yōu)點(diǎn)，契合綠色防控要求，已被廣泛用作禾谷類作物上病害的防治，對(duì)禾谷鐮刀菌、玉米大斑病菌和小麥紋枯病菌等多種病原菌表現(xiàn)出良好的防效[10-12]。自2019 年以來，葉菌唑在我國(guó)已被登記用于小麥赤霉病、白粉病及銹病等的防治[13-15]。然而，目前尚未見有關(guān)葉菌唑?qū)喼︾牭毒淖饔靡约捌湓诜乐斡衩姿敫》矫鎽?yīng)用的研究報(bào)道。

因此，本研究評(píng)估了從國(guó)內(nèi)3 個(gè)主要的玉米穗腐病發(fā)生省份 (山東、河南和江蘇) 采集的染病玉米樣品中分離的輪枝鐮刀菌種群對(duì)葉唑菌的敏感性，通過對(duì)菌絲麥角甾醇、甘油、丙二醛 (MDA)含量和電導(dǎo)率等生理生化指標(biāo)的測(cè)定以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 分析，研究了葉菌唑?qū)喼︾牭毒淖饔脵C(jī)制，明確了其對(duì)輪枝鐮刀菌所產(chǎn)真菌毒素的抑制作用，并通過田間試驗(yàn)測(cè)定了葉菌唑?qū)τ衩姿敫〉姆乐涡Ч?，旨在為該藥劑在玉米穗腐病防治方面的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 35 株供試菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所從國(guó)內(nèi)玉米主產(chǎn)區(qū)山東、河南和江蘇3 省采集，經(jīng)分離、鑒定[16]，確定為輪枝鐮刀菌Fusarium verticillioides，所有菌株以“采集地首字母 + 年份 + 序號(hào)”的方式命名，以分生孢子懸浮液的形式于 - 80 ℃保存于30%甘油溶液中，待后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.1.2 藥劑 97%葉菌唑 (metconazole) 原藥由武漢鑫如化工有限公司提供，用丙酮溶解并配制成25 mg/mL 的儲(chǔ)備液，于4 ℃保存，用于病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定試驗(yàn)；田間試驗(yàn)對(duì)照藥劑40%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑 (prothioconazole +tebuconazole 40% SC) 由江蘇省溧陽中南化工有限公司提供。

1.1.3 玉米品種 迪卡1210，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 單端孢霉烯生物合成誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (TBI)：蔗糖30 g，KCl 0.5 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MgSO4? 7H2O 0.5 g，腐胺0.8 g，微量元素混合液 (trace elements) 0.2 mL，用蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH 值至6.5，115 ℃高溫高壓滅菌30 min。其中微量元素混合液配方為：ZnSO4? 7H2O 50 g，檸檬酸50 g，硼酸0.5 g，CuSO4? 5H2O 2.5 g，MnSO4? H2O 0.5 g，Na2MnO4?2H2O 0.5 g，Na4EDTA 50 g。

1.1.5 試劑盒及主要儀器 Trizol RNA 提取試劑盒 (貨號(hào)：15596018)，Ambion-賽默飛世爾科技(中國(guó))；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (貨號(hào)：DRR036A)，TaKaRa 公司；甘油測(cè)定試劑盒 (貨號(hào)：E1012)，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；MDA 檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：G0109W)，蘇州格銳思生物科技有限公司。EVO-LS10 掃描電子顯微鏡，德國(guó)ZEISS 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輪枝鐮刀菌對(duì)葉菌唑的敏感性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[17]。向滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA) 中加入葉菌唑儲(chǔ)備液，使其終濃度 (質(zhì)量濃度，以下同) 分別為0、0.01、0.05、0.1、0.5 和1 μg/mL，以加入等體積的丙酮溶劑作為空白對(duì)照 (以下同)。將35 株輪枝鐮刀菌菌株在PDA 平板上于25 ℃活化培養(yǎng)3 d 后，從菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌絲塊，分別接種于含不同濃度葉菌唑的PDA 平板中央，每濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，于25 ℃培養(yǎng)3 d 后，采用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。通過SPSS 程序?qū)⑸L(zhǎng)抑制率對(duì)藥劑濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸分析，計(jì)算EC50值。

1.2.2 葉菌唑?qū)喼︾牭毒z形態(tài)的影響測(cè)定

根據(jù)35 株輪枝鐮刀菌對(duì)葉菌唑的敏感性測(cè)定結(jié)果，選取敏感性與平均EC50值接近的菌株JS21-32 作為本研究的代表菌株。將JS21-32 菌株分生孢子懸浮液 (濃度為每毫升含105個(gè)孢子，以下同)接種到100 mL 土豆葡萄糖肉湯培養(yǎng)基 (PDB) 中，于25 ℃、180 r/min 下振蕩培養(yǎng)24 h。用雙層紗布過濾，收集菌絲，用無菌水清洗后，分別用0.012和0.06 μg/mL 的葉菌唑處理12 h。收集菌絲，在2.5%戊二醛中固定過夜，根據(jù)Gao 等[18]的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理后，于1500 倍掃描電子顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.3 葉菌唑?qū)Ψ稚咦有纬?、萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的抑制作用測(cè)定 分別將35 株輪枝鐮刀菌的分生孢子懸浮液接種到2 mL 2%的蔗糖溶液中，加入葉菌唑使其終濃度分別為0、0.012 和0.06 μg/mL，每濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，于25 ℃、80 r/min 下振蕩培養(yǎng)6 h，在顯微鏡下觀察其對(duì)菌株分生孢子形成、萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的抑制作用，按公式 (1) 計(jì)算抑制率 (Ri，%)。

式 (1) 中：C為對(duì)照組孢子形成數(shù)、孢子萌發(fā)數(shù)或芽管長(zhǎng)度；T為藥劑處理組孢子形成數(shù)、孢子萌發(fā)數(shù)或芽管長(zhǎng)度。

1.2.4 葉菌唑?qū)喼︾牭毒a(chǎn)毒素能力的影響測(cè)定 將JS21-32 菌株分生孢子懸浮液接種到30 mL TBI 培養(yǎng)液中，加入葉菌唑儲(chǔ)備液，使其終濃度分別為0、0.012 和0.06 μg/mL，每濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，置于28 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)7 d，用于產(chǎn)生伏馬毒素。分別收集濾液和菌絲，經(jīng)液氮速凍后進(jìn)行冷凍干燥。濾液用50%乙腈 (含0.01%的甲酸)復(fù)溶后，采用HPLC-MS/MS 測(cè)定樣品中伏馬毒素B1、B2和B3的含量[19]。菌絲凍干后稱重，用RNA 提取試劑盒提取菌絲RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA 為模板，選取5 對(duì)特異性引物，以微管蛋白抗體基因 (β-tubulin) 為內(nèi)參基因 (表1)，通過熒光定量PCR 技術(shù)測(cè)定伏馬毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[20]。

表1 輪枝鐮刀菌FUM、CYP51 基因擴(kuò)增及熒光定量分析引物Table 1 Primers used for amplifying FUM and CYP51 genes of F.verticillioides and qRT-PCR

1.2.5 葉菌唑?qū)z麥角甾醇含量的影響測(cè)定 將JS21-32 菌株分生孢子懸浮液接種至PDB 培養(yǎng)液中，于25 ℃、180 r/min 下振蕩培養(yǎng)24 h 后，經(jīng)雙層紗布過濾，收集菌絲，用無菌水沖洗。將菌絲放入50 mL PDB 培養(yǎng)液中，加入葉菌唑儲(chǔ)備液使其終濃度分別為0、0.012 和0.06 μg/mL，每濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，于25 ℃、180 r/min 下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h 后取出，菌絲經(jīng)過濾后凍干。取0.1 g菌絲，加入2 mL 無水乙醇，浸提過夜后，超聲提取40 min，靜置分層，取1 mL 上清液過0.22 μm濾膜，采用HPLC-MS/MS 測(cè)定麥角甾醇的含量[21]。

1.2.6 葉菌唑?qū)z甘油和丙二醛含量的影響測(cè)定 同1.2.5 節(jié)方法處理JS21-32 菌株菌絲，分別采用甘油含量試劑盒和MDA 含量試劑盒進(jìn)行測(cè)定。使用紫外分光光度計(jì)在570 nm 下測(cè)量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算菌絲中甘油含量；分別在532 nm 和600 nm 下測(cè)量吸光度值，通過公式(2) 計(jì)算MDA 含量 (CMDA，nmol/g)。

式 (2) 中：A532為532 nm 處的吸光度值；A600為600 nm 處的吸光度值；m為樣本菌絲的質(zhì)量，g。

1.2.7 葉菌唑?qū)z相對(duì)電導(dǎo)率的影響測(cè)定 同

1.2.5 節(jié)方法處理JS21-32 菌株菌絲，將處理后的菌絲懸浮于20 mL 雙蒸水中，分別于0、30、60、90、120、150 和180 min 時(shí)測(cè)量電導(dǎo)率；180 min 后，將菌絲煮沸5 min，測(cè)定最終電導(dǎo)率。按公式 (3)計(jì)算菌絲的相對(duì)電導(dǎo)率 (RC，%)。

式 (3) 中：R1為不同時(shí)間電導(dǎo)率；R2為最終電導(dǎo)率。

1.2.8 葉菌唑?qū)喼︾牭毒鶦YP51基因表達(dá)的影響測(cè)定 同1.2.5 節(jié)方法培養(yǎng)、收集JS21-32 菌株菌絲。將菌絲放入50 mL PDB 培養(yǎng)液中，加入葉菌唑儲(chǔ)備液使其終濃度分別為0、0.0012、0.006 和0.012 μg/mL，每濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)；于25 ℃、180 r/min 下振蕩培養(yǎng)3 h，菌絲過濾后凍干。用RNA 提取試劑盒提取菌絲RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以所得cDNA 為模板，選取3 對(duì)特異性引物，以actin為內(nèi)參基因 (表1)，通過熒光定量PCR 測(cè)定CYP51基因的表達(dá)，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[20]。

1.2.9 葉菌唑?qū)μ镩g玉米穗腐病的防治效果測(cè)定

田間試驗(yàn)玉米品種為迪卡1210，種植密度約5.4 株/m2。試驗(yàn)共設(shè)5 個(gè)處理 (均為有效成分用量)：20%葉菌唑SC 90、135 和180 g/hm2，40%丙硫菌唑 ? 戊唑醇SC 300 g/hm2以及清水空白對(duì)照。每處理3 次重復(fù)，小區(qū)面積16 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。于玉米抽雄期穗部噴霧施藥1 次。待玉米成熟后，每小區(qū)按照對(duì)角線五點(diǎn)法取樣[22]，每點(diǎn)隨機(jī)采集10 穗，每小區(qū)共計(jì)50 穗，參照文獻(xiàn)方法調(diào)查發(fā)病情況，按枯穗面積占調(diào)查穗總面積的百分率分級(jí)[23]，從0 (無明顯癥狀) 到9 (完全壞死損傷) 級(jí)分別記錄各級(jí)病穗數(shù)及總穗數(shù)，計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效。將調(diào)查玉米穗自然曬干，經(jīng)過脫粒、混勻后，測(cè)定千粒重，計(jì)算增產(chǎn)率；隨后參照文獻(xiàn)方法[24]進(jìn)行樣品中FBs 毒素含量測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪枝鐮刀菌對(duì)葉菌唑的敏感性

葉菌唑?qū)┰囕喼︾牭毒z生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用 (圖1A)。通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組菌絲形態(tài)圓潤(rùn)飽滿，呈圓柱形；而葉菌唑處理組菌絲結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)干癟皺縮現(xiàn)象，并且隨著葉菌唑質(zhì)量濃度增加，皺縮現(xiàn)象更加明顯 (圖1B)。2019 至2021 年采自山東、河南和江蘇3 省的35 株輪枝鐮刀菌對(duì)葉菌唑的敏感性測(cè)定結(jié)果見表2，從中可以看出：同一省份中不同菌株對(duì)葉菌唑的敏感性存在差異，其中差異較大的是河南省，而不同省份菌株之間對(duì)葉菌唑的敏感性差異不顯著。供試菌株群體對(duì)葉菌唑的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)的連續(xù)性單峰曲線，EC50值范圍為0.005～0.029 μg/mL，平均值為(0.012 ± 0.006) μg/mL (圖1C)。

表2 不同省份輪枝鐮刀菌對(duì)葉菌唑的敏感性Table 2 Sensitivity of F.verticillioides from different provinces to metconazole

2.2 葉菌唑?qū)喼︾牭毒稚咦由肀硇偷挠绊?/h3>

葉菌唑?qū)喼︾牭毒稚咦有纬?、萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)均有顯著的抑制作用 (圖2)。6 h 后，空白對(duì)照組分生孢子正常萌發(fā)，芽管伸長(zhǎng)，最終形成新的菌絲，而0.012 和0.06 μg/mL 葉菌唑處理組分生孢子形成、萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)均被抑制，且隨著藥劑濃度增加，抑制效果更顯著；12 h 后，藥劑處理組芽管幾乎不再伸長(zhǎng) (圖2A)。0.012 和0.06 μg/mL 葉菌唑?qū)喼︾牭毒稚咦有纬傻囊种坡史秶謩e在7.04%～31.92% 和28.17%～56.15% 之間，平均值為 (20.59 ± 5.75)% 和(40.78 ± 5.88)% (圖2B)；對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制率范圍分別在9.85%～33.22%和37.78%～60.77%之間，平均值為 (24.88 ± 5.15)%和 (46.88 ± 5.59)%(圖2C)；對(duì)芽管伸長(zhǎng)的抑制率范圍分別在34.86%～84.54%和64.76%～93.80%之間，平均值為 (59.98 ±9.11)%和 (82.37 ± 4.93)% (圖2D)。

圖2 葉菌唑?qū)?5 株輪枝鐮刀菌分生孢子形成、萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of metconazole on conidia production, germination and germ tube elongation of 35 strains of F.verticillioides

2.3 葉菌唑?qū)喼︾牭毒R毒素生物合成的影響

利用HPLC-MS/MS 檢測(cè)葉菌唑處理后輪枝鐮刀菌JS21-32 菌株產(chǎn)生FBs 毒素的變化，結(jié)果 (圖3A) 表明：空白對(duì)照組FBs 毒素含量為1252.57 μg/g，而 0.012 和0.06 μg/mL 葉菌唑處理組FBs 毒素含量分別為888.80 和390.72 μg/g，比對(duì)照組分別降低了29.04%和68.81%。表明葉菌唑?qū)喼︾牭毒漠a(chǎn)毒有顯著抑制作用，且隨著葉菌唑濃度增大，其抑制作用增強(qiáng)。

利用qRT-PCR 對(duì)與FBs 毒素生物合成相關(guān)的5 個(gè)FUM基因 (FUM1、FUM3、FUM6、FUM7和FUM8) 進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3B 所示。與空白對(duì)照組相比，0.012 和0.06 μg/mL 葉菌唑處理組5 個(gè)FUM基因相對(duì)表達(dá)水平均顯著下調(diào)，結(jié)合圖3A 的菌絲產(chǎn)毒能力結(jié)果分析，說明葉菌唑能顯著抑制FBs 產(chǎn)毒相關(guān)基因的表達(dá)，最終影響FBs 毒素的產(chǎn)生和積累。

圖3 葉菌唑?qū)喼︾牭毒a(chǎn)毒的抑制作用 (A) 及對(duì)產(chǎn)毒基因表達(dá)的影響 (B)Fig.3 Inhibition of different concentrations of metconazole on FBs production (A) and the expression level of toxigenic genes (B) of F.verticillioides

2.4 葉菌唑?qū)喼︾牭毒?xì)胞膜通透性的影響

通過測(cè)定葉菌唑處理后輪枝鐮刀菌菌絲中麥角甾醇、甘油和MDA 含量以及相對(duì)電導(dǎo)率的變化，可判斷藥劑對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，從而反映細(xì)胞膜的受損情況。利用HPLC-MS/MS 分析菌絲中麥角甾醇的含量，結(jié)果表明：葉菌唑處理顯著抑制了輪枝鐮刀菌菌絲中麥角甾醇的生物合成，且該影響呈劑量依賴性 (圖4A)。根據(jù)甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品在570 nm 下的吸光度值，計(jì)算發(fā)現(xiàn)：經(jīng)不同濃度葉菌唑處理24 h 后，處理組菌絲內(nèi)甘油的含量顯著高于對(duì)照組，且該影響也呈劑量依賴性 (圖4B)。說明葉菌唑可誘導(dǎo)菌絲內(nèi)甘油的積累，使其難以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡。MDA的濃度常被用作評(píng)價(jià)細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)，能夠表明細(xì)胞膜的氧化損傷程度[25]。測(cè)定結(jié)果表明：葉菌唑處理組菌絲內(nèi)MDA 含量顯著高于對(duì)照組 (圖4C)，說明葉菌唑可誘導(dǎo)菌絲內(nèi)MDA 的積累，引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致氧化損傷。此外，經(jīng)不同濃度葉菌唑處理后3 h 內(nèi)，菌絲的胞外電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，且處理組電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組 (圖4D)。以上結(jié)果表明，葉菌唑能夠通過提高菌絲細(xì)胞膜的通透性而使得電解質(zhì)外滲，從而觸發(fā)真菌的滲透脅迫反應(yīng)。

圖4 葉菌唑?qū)喼︾牭毒z麥角甾醇 (A)、甘油 (B) 和丙二醛 (C) 含量以及相對(duì)電導(dǎo)率 (D) 的影響Fig.4 Effects of metconazole on ergosterol (A), glycerol (B), MDA (C) production and the electrical conductivity (D) in mycelia of F.verticillioides

2.5 葉菌唑?qū)喼︾牭毒鶦YP51 基因表達(dá)的影響

利用qRT-PCR 檢測(cè)不同濃度葉菌唑處理輪枝鐮刀菌后參與菌絲麥角甾醇生物合成的3 個(gè)CYP51基因 (CYP51A、CYP51B和CYP51C) 的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明：當(dāng)葉菌唑質(zhì)量濃度分別為 0.0012、0.006 和0.012 μg/mL 時(shí)，CYP51A基因的表達(dá)水平分別上調(diào)了1.26、3.19 和3.48 倍，CYP51B基因的表達(dá)水平分別上調(diào)了6.65、8.28 和7.06 倍，CYP51C基因的表達(dá)水平分別上調(diào)了1.13、2.75和1.19 倍 (圖5)。說明葉菌唑主要作用于靶標(biāo)基因CYP51尤其是CYP51B基因，通過影響病原菌細(xì)胞麥角甾醇的生物合成，進(jìn)而破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

圖5 葉菌唑?qū)喼︾牭毒zCYP51 基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of metconazole on the expression level of CYP51 genes in mycelia of F.verticillioides

2.6 葉菌唑懸浮劑對(duì)田間玉米穗腐病的防治效果

田間試驗(yàn)結(jié)果 (表3) 表明，與空白對(duì)照組相比，葉菌唑噴霧處理顯著降低了玉米穗腐病的發(fā)生，提高了玉米產(chǎn)量。其中，20%葉菌唑SC 有效成分90 和135 g/hm2處理組防效比對(duì)照藥劑40%丙硫菌唑 ? 戊唑醇SC 有效成分300 g/hm2處理組略好，但無顯著性差異；葉菌唑180 g/hm2處理組防效則顯著高于丙硫菌唑 ? 戊唑醇300 g/hm2處理組 (P＜0.05)，且在使用劑量范圍內(nèi)對(duì)玉米安全，肉眼觀察玉米生長(zhǎng)未見明顯藥害。經(jīng)不同劑量葉菌唑SC 處理后，玉米千粒重與空白對(duì)照組相比均存在顯著差異 (P＜0.05)，并且隨著藥劑劑量增加千粒重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；180 g/hm2葉菌唑處理后的增產(chǎn)率 (33.20%) 顯著高于對(duì)照藥劑丙硫菌唑 ?戊唑醇處理組 (3.95%)。

表3 葉菌唑懸浮劑對(duì)玉米穗腐病的田間防治效果Table 3 Field control efficacy of metconazole SC against maize ear rot

此外，經(jīng)葉菌唑SC 處理后，玉米籽粒中B 族伏馬毒素 (FBs) 含量與空白對(duì)照組相比存在顯著差異，且該毒素含量隨藥劑劑量的增加而減少。其中，葉菌唑SC 有效成分135、180 g/hm2處理組FBs 毒素含量和對(duì)照藥劑丙硫菌唑 ? 戊唑醇SC 有效成分300 g/hm2處理組間存在顯著差異，且3 個(gè)藥劑處理組FBs 毒素含量比空白對(duì)照分別降低了48.69%、69.90%和15.56%。

3 結(jié)論與討論

玉米穗腐病是一種禾谷類作物上的真菌病害，在許多干旱和半干旱種植區(qū)均有發(fā)生，可造成世界范圍內(nèi)的糧食減產(chǎn)和重大經(jīng)濟(jì)損失，且由病原菌產(chǎn)生的各種有害真菌毒素還嚴(yán)重威脅著人類及其他動(dòng)物的生命及健康[26-27]。玉米穗腐病的主要致病菌包括鐮刀菌、曲霉及木霉等，其中由鐮刀菌引起的穗腐病分布最為廣泛，又以輪枝鐮刀菌F.verticillioides為最常見的致病菌[4]。

本研究表明，三唑類殺菌劑葉菌唑?qū)σ鹞覈?guó)玉米穗腐病的主要病原菌輪枝鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)以及孢子形成、萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制作用，說明葉菌唑能抑制輪枝鐮刀菌在植物體內(nèi)的定殖和傳播，進(jìn)而有效控制該病害。已有研究表明，在防控病害的同時(shí)，三唑類殺菌劑還能有效抑制真菌毒素的產(chǎn)生[28]，但Audenaert 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的三唑類殺菌劑丙硫菌唑反而可能會(huì)誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌F.graminearum產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素。本研究發(fā)現(xiàn)，在EC50(0.012 μg/mL)和5 倍 EC50(0.06 μg/mL) 質(zhì)量濃度下，葉菌唑處理能顯著抑制液體培養(yǎng)基中輪枝鐮刀菌產(chǎn)生FBs毒素，未出現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的低劑量下刺激真菌產(chǎn)毒的現(xiàn)象。qRT-PCR 分析表明，經(jīng)葉菌唑處理后，與FBs 毒素合成相關(guān)的5 個(gè)基因 (FUM1、FUM3、FUM6、FUM7和FUM8) 的相對(duì)表達(dá)水平均顯著下調(diào)，說明葉菌唑能顯著抑制與FBs 毒素產(chǎn)生相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響毒素的產(chǎn)生和積累。相比其他傳統(tǒng)三唑類殺菌劑，葉菌唑在低劑量下殺菌活性較高、抑制產(chǎn)毒效果明顯，且暫未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)毒現(xiàn)象，符合綠色防控要求。

田間試驗(yàn)表明，有效成分90、135 和180 g/hm2劑量的葉菌唑SC 噴霧處理，對(duì)玉米穗腐病的防效、增產(chǎn)效果以及對(duì)玉米籽粒中FBs 毒素的抑制作用均優(yōu)于對(duì)照藥劑丙硫菌唑 ? 戊唑醇SC 300 g/hm2處理，但后續(xù)還需通過進(jìn)一步的田間試驗(yàn)，以確定葉菌唑在種子處理、葉面噴施以及智能高效熱霧飛防等施藥技術(shù)下對(duì)玉米整個(gè)生育期穗腐病的防治效果及對(duì)毒素產(chǎn)生的控制作用。

三唑類殺菌劑的作用靶標(biāo)是參與麥角甾醇生物合成的CYP51(ERG11) 基因，該基因編碼細(xì)胞色素P450 甾醇C14α-脫甲基化酶，且有3 個(gè)同源基因 (CYP51A、CYP51B和CYP51C)。研究結(jié)果顯示，低濃度葉菌唑可以誘導(dǎo)靶標(biāo)基因CYP51B的表達(dá)，作為病原菌響應(yīng)藥劑誘導(dǎo)及抵御藥劑脅迫的一種機(jī)制，該現(xiàn)象在其他鐮刀菌 (如禾谷鐮刀菌) 中也有類似報(bào)道[30]；隨著葉菌唑濃度升高，藥劑脅迫強(qiáng)度增大，誘導(dǎo)表達(dá)效果逐漸減弱，甚至受到抑制。本研究表明，葉菌唑主要通過作用于CYP51B基因，影響細(xì)胞麥角甾醇的生物合成而發(fā)揮作用，但CYP51基因具體如何介導(dǎo)病原菌對(duì)葉菌唑的敏感性差異以及準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步解析。

經(jīng)葉菌唑處理后，輪枝鐮刀菌菌絲中麥角甾醇的含量顯著降低。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性及完整性均有重要意義，麥角甾醇合成的減少將會(huì)損害細(xì)胞膜的功能[31-32]。丙二醛含量經(jīng)常被用作評(píng)價(jià)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)，表明細(xì)胞質(zhì)膜的氧化損傷情況[33]。與空白對(duì)照組相比，在葉菌唑作用下，輪枝鐮刀菌菌絲中丙二醛含量顯著增加，表明葉菌唑可導(dǎo)致輪枝鐮刀菌細(xì)胞膜的氧化損傷，而細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致的電解質(zhì)外滲會(huì)引發(fā)真菌的滲透脅迫反應(yīng)。胞內(nèi)甘油在真菌對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉菌唑處理后輪枝鐮刀菌菌絲中甘油含量顯著增加，且呈劑量依賴性，表明葉菌唑可誘導(dǎo)菌絲中的甘油積累以維持滲透平衡。與對(duì)照組相比，葉菌唑處理還導(dǎo)致了輪枝鐮刀菌相對(duì)電導(dǎo)率的顯著增加，表明葉菌唑可通過增強(qiáng)菌絲細(xì)胞膜的通透性而誘導(dǎo)電解質(zhì)外滲。

綜上所述，葉菌唑可通過脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞膜損傷和阻礙麥角甾醇生物合成等方式，對(duì)輪枝鐮刀菌表現(xiàn)出潛在的抗真菌活性。這一發(fā)現(xiàn)不僅為葉菌唑的抗真菌作用機(jī)理提供了新的線索，而且為控制由輪枝鐮刀菌引起的玉米穗腐病提供了一種新的防治策略。