盧奎 李福偉 朱麗慧 和笑笑 衛(wèi)利春 朱永豪 嚴(yán)華祥

摘要：為研究飼糧中鎂對(duì)新楊黑羽蛋雞雞蛋暗斑形成和蛋殼微生物組成的影響，選取35周齡、所產(chǎn)雞蛋易發(fā)暗斑的新楊黑羽蛋雞48只，隨機(jī)分成3組，每組16只（單籠飼養(yǎng)），分別飼喂鎂濃度為843.55（A）、2 009.80（B）和3 206.05（ C） mg·kg-1的試驗(yàn)飼糧，為期5周，檢測(cè)雞蛋暗斑、雞蛋品質(zhì)、蛋殼微生物的差異。結(jié)果表明，與B和C處理相比， A處理雞蛋的暗斑等級(jí)極顯著降低（P<0.01），蛋白高度和哈氏單位均顯著提高（P<0.05）。通過(guò)16S rDNA測(cè)序，在蛋殼表面共檢測(cè)到969個(gè)OTUs，其中，A、B、C處理分別檢測(cè)到670、787、848個(gè)OTUs；隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物OTU類(lèi)別數(shù)增加；1級(jí)暗斑等級(jí)的OTU類(lèi)別數(shù)極顯著低于暗斑等級(jí)較高的雞蛋（P<0.01）。綜上述所，飼糧中較低的鎂濃度會(huì)減少雞蛋暗斑，提高蛋白高度和哈氏單位。

關(guān)鍵詞：新楊黑羽蛋雞；鎂；雞蛋暗斑；微生物；蛋殼doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0546

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2023）01019709

雞蛋暗斑是近年來(lái)倍受關(guān)注的質(zhì)量問(wèn)題，改善雞蛋暗斑可以提高經(jīng)濟(jì)效益。研究顯示，暗斑蛋與無(wú)暗斑蛋的蛋殼存在較大差異[1-4]；雞蛋暗斑的存在使蛋殼表面微生物更易于進(jìn)入蛋殼內(nèi)[1-3]；暗斑的嚴(yán)重程度與沙門(mén)氏菌和大腸桿菌對(duì)蛋殼的滲透作用顯著相關(guān)[5]；暗斑不僅受環(huán)境溫度、濕度、飼糧組成、蛋雞品種等因素影響，同時(shí)還有個(gè)體差異[6-10]；且暗斑率隨雞蛋儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[12]。

鎂是生物體必需的常量元素之一，在生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖方面具有重要調(diào)節(jié)作用。蛋殼中鎂含量豐富[11]，鎂在蛋殼形成過(guò)程中具有重要協(xié)同作用[1213]。研究表明，蛋殼形成過(guò)程中ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)依賴(lài)于鎂離子的參與[14]；鎂含量在成殼過(guò)程中先升高后維持穩(wěn)定至蛋殼完全形成[15]；且飼糧中鎂含量會(huì)影響雞蛋的重量、產(chǎn)量以及蛋殼厚度[16]；飼糧中過(guò)量鎂會(huì)導(dǎo)致軟破蛋率上升，蛋殼乳頭間空隙增大[17]；還會(huì)導(dǎo)致蛋雛雞骨質(zhì)疏松，脛骨抗壓能力降低[18]。體外研究發(fā)現(xiàn)，pH 10.5的堿性溶液中鎂離子可促進(jìn)微生物生長(zhǎng)[19]；鎂還可以治療破骨細(xì)胞形成和功能障礙引起的骨溶解相關(guān)疾病[20]。蛋雞飼料原料豆粕（806.05 mg·kg-1）和石粉（0.5%～3%）中鎂含量較高，因此，在配制成蛋雞配合飼料后飼糧中的鎂含量可達(dá)1 000～3 000 mg·kg-1[2122]。但是，高鎂飼糧對(duì)雞蛋暗斑和蛋殼微生物的影響尚不明確。本研究擬通過(guò)飼喂不同鎂含量的飼糧，觀(guān)察雞蛋暗斑率的變化趨勢(shì)，研究飼糧中鎂含量對(duì)蛋殼中微生物組成的影響，探討飼糧中鎂含量對(duì)雞蛋暗斑的影響及其作用機(jī)制，以達(dá)到降低雞蛋暗斑、提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從上海市營(yíng)房蛋雞場(chǎng)選擇35周齡、體重接近、連續(xù)３天產(chǎn)蛋且蛋殼表面有暗斑的新楊黑羽蛋雞48只，隨機(jī)分為3組，每組16只，單雞單籠飼養(yǎng)于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物房，每日飼喂量為95 g·只-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)蛋雞分別飼喂鎂含量為843.55（A）、2 009.80（B）和3 206.05 mg·kg-1（C）3種試驗(yàn)飼糧。各處理飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平詳見(jiàn)表1。其中，貝殼粉來(lái)源于江蘇省連云港興旺貝殼有限公司（鎂0.05%，鈣38.13%）；石粉來(lái)源于廣西賀州智鑫工貿(mào)有限公司（鎂3.05%，鈣38.1%）。試驗(yàn)為期5周，試驗(yàn)期間蛋雞自由采食、飲水。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 雞蛋暗斑檢測(cè) 收集試驗(yàn)蛋雞當(dāng)天雞蛋，統(tǒng)計(jì)蛋數(shù)并舍棄臟蛋，記錄日期、籠號(hào)，雞蛋集中室溫儲(chǔ)存，2 d后檢測(cè)暗斑等級(jí)。暗斑等級(jí)根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。

0級(jí)：初產(chǎn)1 h內(nèi)沒(méi)有任何暗斑的雞蛋，光源照射時(shí)雞蛋透光均勻、無(wú)透光點(diǎn)；室溫放置2 d后，外觀(guān)未有變化，標(biāo)記為0級(jí)。

1級(jí)：不通過(guò)光源照射較難觀(guān)察到雞蛋有暗斑點(diǎn)，在光源下可見(jiàn)零星透光點(diǎn)，1級(jí)暗斑雞蛋定義為非暗斑雞蛋。

2級(jí)：雞蛋表面有較多直徑1 mm左右的暗斑點(diǎn)，不通過(guò)光源照射仔細(xì)觀(guān)察能夠看到暗斑點(diǎn)，光源照射下透光小點(diǎn)遍布雞蛋表面，但是沒(méi)有直徑3 mm以上的透光點(diǎn)。

3級(jí)：雞蛋表面有直徑3 mm以上的暗斑點(diǎn)，在沒(méi)有光源照射時(shí)就能夠直接觀(guān)察到暗斑，光源照射下能夠看到1 mm左右的透光小點(diǎn)和3 mm左右光圈的零星斑點(diǎn)。

4 級(jí)：雞蛋表面有較多直徑3 mm 左右的斑點(diǎn)，沒(méi)有光源照射就能明顯觀(guān)察到密布的暗斑點(diǎn)，在光源照射時(shí)能夠清晰地觀(guān)察到較多的光斑分布在雞蛋表面，但在雞蛋的銳端沒(méi)有或有極少的斑點(diǎn)。

5級(jí)：雞蛋表面暗斑點(diǎn)明顯且密集，光源照射下斑點(diǎn)連綴成片狀，在雞蛋銳端有較多暗斑點(diǎn)。

1.3.2 產(chǎn)蛋率和雞蛋品質(zhì)檢測(cè) 每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)，計(jì)算產(chǎn)蛋率。產(chǎn)蛋率計(jì)算公式如下。

產(chǎn)蛋率=Σ（當(dāng)天產(chǎn)蛋枚數(shù)/存欄蛋雞數(shù)）/統(tǒng)計(jì)天數(shù)（1）

在試驗(yàn)第1、第3 和第5 周，連續(xù)3 d 采集雞蛋，統(tǒng)計(jì)蛋數(shù)并舍棄臟蛋，每組取12枚蛋，集中室溫放置2 d后檢測(cè)雞蛋品質(zhì)。采用全自動(dòng)蛋品質(zhì)測(cè)定儀DET-6000（日本Nabel 公司）測(cè)定雞蛋重量、蛋殼強(qiáng)度、蛋黃顏色、蛋白高度和哈氏單位，利用蛋殼厚度測(cè)定儀測(cè)定蛋殼厚度。

1.3.3 蛋殼微生物分類(lèi)測(cè)序 對(duì)產(chǎn)蛋當(dāng)天未檢測(cè)到暗斑的雞蛋在當(dāng)天（0.5 d）以及集中室溫儲(chǔ)存2、7、14 d后的蛋殼表面微生物進(jìn)行測(cè)序和分析。

取4個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間下3種鎂含量飼糧處理的雞蛋各8枚（共96枚），將蛋殼研碎后，加入50 mL 0.9%氯化鈉溶液于250 mL鹽水瓶，在搖床搖30 min后取出，超凈工作臺(tái)靜置20 min，靜置后抽取上清液1 mL，使用Hipure Bacterial DNA Kit試劑盒（上海邁跟生物科技有限公司）抽提DNA；采用QuawellQ3000超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度和濃度；然后采用16s rDNA引物對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度和完整性；檢測(cè)合格的產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行微生物分類(lèi)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 雞蛋品質(zhì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2010和SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

1.4.2 蛋殼微生物數(shù)據(jù)分析 二代測(cè)序得到的初始 reads首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾；然后進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析?；贠TUs聚類(lèi)分析結(jié)果，對(duì)OTUs進(jìn)行多樣性分析，并檢測(cè)測(cè)序深度；基于分類(lèi)學(xué)信息，在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，對(duì)多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行Beta多樣性分析、分組檢驗(yàn)分析、差異顯著性分析、環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析、關(guān)聯(lián)與模型預(yù)測(cè)分析和功能預(yù)測(cè)等一系列深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧鎂水平對(duì)雞蛋暗斑的影響由圖1可知，在預(yù)試驗(yàn)期間各處理雞蛋的暗斑等級(jí)均集中于2和3級(jí)，處理間無(wú)顯著差異。在試驗(yàn)第2～5周，與B、C處理相比，A處理雞蛋的暗斑等級(jí)明顯降低，暗斑等級(jí)為1級(jí)的雞蛋占比較高；隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理對(duì)雞蛋暗斑的影響趨于穩(wěn)定。

2.2 飼糧中鎂水平對(duì)常規(guī)雞蛋品質(zhì)的影響由表3可知，飼糧中鎂含量顯著影響雞蛋的蛋白高度和哈氏單位（P<0.05），對(duì)產(chǎn)蛋率、蛋黃顏色、蛋重、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度無(wú)顯著影響（P > 0.05）。A處理雞蛋的蛋白高度和哈氏單位顯著高于B和C處理（ P <0.05）；而B(niǎo)、C處理間雞蛋的蛋白高度和哈氏單位無(wú)顯著差異（P > 0.05）。

2.3 飼糧鎂水平對(duì)蛋殼微生物的影響

2.3.1 飼糧鎂水平對(duì)蛋殼微生物物種數(shù)量的影響 比較A、B和C處理雞蛋蛋殼微生物菌群的差異，結(jié)果（圖2）表明，A、B和C處理的蛋殼微生物中分別檢測(cè)到670、787和848個(gè)OTUs；其中，共有的OUT數(shù)量為 567。C處理特有的OUT數(shù)量分別是A和B處理的6.1和2.1倍。在屬水平上，共有334個(gè)屬，其中，A處理有5.28%與其他2組水平不同，B處理有10.96%與其他2組不同，C處理有14.85%與其他2組不同。

2.3.2 飼糧鎂水平對(duì)蛋殼微生物分布的影響 由圖3 可知，各處理的OTUs 指數(shù)差異顯著（P=0.017）； Shannon 指數(shù)差異不顯著。對(duì)于OTUs指數(shù)，A、B處理間差異極顯著（P<0.01）；A、C處理間差異顯著（P<0.05）；B、C處理間差異不顯著。不同處理的Shannon指數(shù)表現(xiàn)為C>B>A。

由圖4可知，蛋殼微生物主要包括厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和藍(lán)藻細(xì)菌。厚壁菌門(mén)在A和B處理中的占比相近；在C 處理中的占比較A 處理提高17.88%。變形菌門(mén)在A和B處理中的占比相近；在C處理中的占比較B處理降低19.54%。藍(lán)藻細(xì)菌在A 處理中的占比最高，分別是B、C 處理的7.75和2.48倍。

2.4 不同儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蛋殼微生物的影響

如圖5所示，隨著雞蛋儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)到的OUTs數(shù)量越多；且隨著飼糧中鎂含量的增加，檢測(cè)到的OUTs數(shù)量越高。在雞蛋儲(chǔ)存2 d以?xún)?nèi)，A處理的蛋殼微生物OUTs數(shù)量最少，B處理次之，C處理最多。在雞蛋儲(chǔ)存2 d以后，C處理蛋殼微生物的OUT數(shù)量降低。雞蛋儲(chǔ)存7 d后，B和C處理蛋殼微生物的OUT數(shù)量均有所降低。

如圖6所示，A處理3個(gè)不同儲(chǔ)存時(shí)間的蛋殼微生物中存在顯著差異的物種共有15種，其中，儲(chǔ)存時(shí)間為0.5 d的顯著差異物種為1種，2 d的為6種，14 d的為8種。

2.5 不同暗斑等級(jí)蛋殼微生物的比較

暗斑等級(jí)為1級(jí)的蛋殼微生物OTU數(shù)量極顯著低于其他等級(jí)；與2～5級(jí)相比，1級(jí)的OUT數(shù)量和特有的OUT均最少， 2～5級(jí)間差異較?。▓D7）。儲(chǔ)存2 d 時(shí)， 1～5 級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物OUT數(shù)量分別為327、477、542、475和428；儲(chǔ)存7 d時(shí)，1～4 級(jí)的蛋殼微生物OUT 數(shù)量分別為198、496、470 和408；儲(chǔ)存14 d 時(shí)， 1～4 級(jí)的蛋殼微生物OUT數(shù)量分別為220、389、557和402。

如圖8所示， 1、2、3、4和5級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物中顯著差異物種的數(shù)量分別為3、5、12、2和12 種。其中，1 級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物中OTU95（布勞特氏菌屬）和OTU25（乳桿菌屬Lactobacillus）的影響作用較強(qiáng)；2級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物中消化鏈球菌科和OTU566（毛螺菌科）的影響作用較強(qiáng)； 3級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物中毛螺菌科和疣微菌科的影響作用較強(qiáng)；4級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物中OTU57、OTU568（乳桿菌屬）的影響作用較強(qiáng)；5級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物中氣球菌科和葡萄球菌科的影響作用較強(qiáng)。

3 討論

3.1 飼糧中鎂濃度對(duì)雞蛋品質(zhì)的影響

鎂元素在蛋雞體內(nèi)的吸收與利用是個(gè)復(fù)雜且嚴(yán)密的過(guò)程，受采食量以及蛋雞體內(nèi)多種激素調(diào)節(jié)等各種因素的影響；飼糧中的鎂含量（207 mg·kg-1）會(huì)影響雞蛋的重量、產(chǎn)量以及蛋殼厚度[16]；飼糧中過(guò)量鎂（6 000 mg·kg-1）會(huì)導(dǎo)致軟破蛋率上升，蛋殼乳頭間空隙增大[17]。本研究結(jié)果表明，飼糧中鎂含量對(duì)產(chǎn)蛋率、蛋重、蛋黃顏色、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度無(wú)顯著影響，對(duì)蛋白高度、哈氏單位有顯著影響；與飼喂鎂含量2 009.80和3 206.05 mg·kg-1的飼糧相比，飼喂843.55 mg·kg-1鎂含量飼糧蛋雞所產(chǎn)雞蛋的蛋白高度顯著增加，哈氏單位顯著提高，與王安等[17]的研究結(jié)果一致。這可能與蛋殼微生物的種類(lèi)及數(shù)量有關(guān)，微生物在蛋殼生長(zhǎng)可能會(huì)破壞蛋殼有機(jī)質(zhì)等。飼喂高鎂含量的飼糧增加了微生物進(jìn)入雞蛋的風(fēng)險(xiǎn)，因此，應(yīng)盡量使用低鎂含量的飼糧飼喂蛋雞。

3.2 飼糧鎂含量、雞蛋暗斑和雞蛋微生物的關(guān)系

本研究顯示，與飼喂鎂含量2 009.80 和3 206.05 mg·kg-1的飼糧相比，飼喂鎂含量843.55mg·kg-1飼糧可明顯降低雞蛋的暗斑程度，減少蛋殼微生物OTUs數(shù)量；隨著飼料中鎂含量的增加，雞蛋暗斑程度增加，蛋殼微生物數(shù)量增多，表明雞蛋暗斑與蛋殼微生物數(shù)量存在一定的關(guān)系，推測(cè)暗斑雞蛋促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)[12，5]。暗斑雞蛋的蛋殼柵欄層致密性較差[1，4]，可能這些位置的一些物質(zhì)含量或分布發(fā)生了變化。本研究顯示，飼喂過(guò)量鎂可導(dǎo)致蛋殼中微生物數(shù)量增加，暗斑蛋的發(fā)生率提高，可能是蛋殼微生物生長(zhǎng)吸收了一部分蛋殼成分，使得蛋殼致密性降低，從而形成暗斑。剛產(chǎn)出的雞蛋表面攜帶糞便微生物，當(dāng)糞便微生物進(jìn)入蛋殼生成菌斑后便形成了蛋殼暗斑，且微生物菌斑的數(shù)量和直徑與暗斑等級(jí)相關(guān)；當(dāng)糞便微生物無(wú)法進(jìn)入蛋殼或進(jìn)入后不能生長(zhǎng)時(shí)，便無(wú)法形成暗斑或暗斑等級(jí)較低[2223]。唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）SNK-6 能降低雞蛋暗斑，蛋雞采食乳酸桿菌可改變腸道微生物種類(lèi)和分布，提高糞便中唾液乳桿菌數(shù)量[21]。本研究表明1級(jí)暗斑等級(jí)的蛋殼微生物的優(yōu)勢(shì)菌之一OTU25為乳桿菌屬，推測(cè)蛋殼表面的優(yōu)勢(shì)菌群未能在蛋殼內(nèi)形成菌斑是雞蛋暗斑等級(jí)較低的原因。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）