吳錦蘭，李靜怡，白 云，鞏 僖，盧凱玲，崔 娜，熊建文

（1. 柳州工學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545616；2. 柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點實驗室，廣西 柳州 545616；3. 柳州市特色食品風(fēng)味與品質(zhì)控制工程技術(shù)研究中心，廣西柳州 545616）

酸筍是一種特色的傳統(tǒng)性發(fā)酵食品，在我國南方地區(qū)被普遍應(yīng)用于菜肴烹煮及作為各類食品的調(diào)味料。酸筍是以新鮮竹筍為原材料，通過食鹽進行腌制，經(jīng)過漂水排氣后密封自然發(fā)酵制作而成[1-2]。發(fā)酵后的酸筍風(fēng)味獨特，含有豐富膳食纖維成分與多種人體所必需的氨基酸，有輔助降血脂、提高機體抵抗力等作用[3-4]。酸筍作為柳州螺螄粉的靈魂，近年來受疫情影響，在“宅經(jīng)濟”形勢下，袋裝螺螄粉銷售量迅速增長，對于袋裝酸筍的需求量也日益增加[5]。袋裝酸筍原料水分含量高、營養(yǎng)豐富，在發(fā)酵、生產(chǎn)操作、貯存等過程中易受到微生物污染而腐敗變質(zhì)，發(fā)生脹袋、變色、軟化、腐臭變質(zhì)等現(xiàn)象。部分腐敗微生物在一定適宜條件下，甚至?xí)ㄟ^分泌產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，從而嚴重影響人類健康和生命安全[6]。在微生物污染中，霉菌污染是其中最主要、影響最大、危害也最大的污染[7-8]。目前，有關(guān)食品霉菌污染分析及控制的研究已經(jīng)開展。岳曉禹等人[9]對貯藏玉米中的腐敗霉菌進行了分離，得到一株優(yōu)勢腐敗霉菌M13，進一步鑒定為米曲霉（Aspergillus oryzae），為糧食的科學(xué)貯藏和食品安全控制提供參考。姚衛(wèi)蓉等人[10]對焙烤食品的腐敗霉菌進行了研究，表明導(dǎo)致焙烤食品發(fā)霉的菌種主要是曲霉菌和青霉菌。張容鵠等人[11]對檳榔干果貯藏中優(yōu)勢腐敗霉菌進行了分離和鑒定，得出2 種優(yōu)勢霉菌，分別鑒定為泡盛曲霉（Aspergillus awamori） 和灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）。謝欣等人[12]從已發(fā)霉變質(zhì)的年糕中分離出優(yōu)勢腐敗霉菌，初步鑒定為單端孢霉（Trichothecium）、青霉菌（Penicillium） 和曲霉菌（Aspergillus），并試用多種不同類型的防霉劑，結(jié)果表明脫氫醋酸鈉和肉桂精油結(jié)合使用，可達到抑菌、防腐和延長年糕保質(zhì)期的目的。霉菌的種類和數(shù)量能基本反映食品的安全狀況，有效控制霉菌的生長、繁殖對保持食品的安全與營養(yǎng)非常重要。

目前，關(guān)于袋裝酸筍腐敗霉菌方面的研究甚少，為了預(yù)防和控制酸筍在腌制、生產(chǎn)和貯存中發(fā)生腐敗問題，從腐敗變質(zhì)的袋裝酸筍中分離篩選得到優(yōu)勢腐敗霉菌，并通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)結(jié)合的方法對腐敗霉菌進行鑒定，分析腐敗霉菌的種屬特性，為袋裝酸筍生產(chǎn)工藝中篩選有效的抑菌劑及針對性的滅菌方法和優(yōu)化貯藏條件等方面提供一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

袋裝酸筍，市售，待其自然腐敗。

1.1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA（附加抗菌素）、真菌基因組DNA 提取試劑盒等，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ810C 型自動高壓蒸汽滅菌鍋，上海嵐薈生物科技有限公司產(chǎn)品；LRH-150 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Nikon Eclipse E200 型光學(xué)顯微鏡，上海衡浩儀器有限公司產(chǎn)品；L9800 型基因擴增儀，北京萊普特科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-6D 型電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；GenoSens 1880 型凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 優(yōu)勢腐敗霉菌的分離純化

取已腐敗袋裝酸筍置于裝有適量的無菌生理鹽水的錐形瓶中搖勻后進行10 倍梯度稀釋，取適當(dāng)梯度的菌懸液200 μL 涂布于PDN 培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下培養(yǎng)。待其長出霉菌后，挑取形態(tài)各異的菌株進一步分離純化，直至得到形態(tài)不同的單菌落并編號。

1.3.2 真菌菌株的形態(tài)學(xué)觀察

參考《真菌鑒定手冊》[13]進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.3 菌種分子生物學(xué)鑒定

（1） 菌體的培養(yǎng)與收集。將分離活化的菌株接種到PDA 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下以轉(zhuǎn)速200 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d，得到的菌絲培養(yǎng)液通過抽濾后收集菌絲。

（2） 真菌總DNA 的提取。稱取50～100 mg 真菌菌絲后倒入液氨研磨成粉末，然后按照真菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取總DNA。

（3） PCR 擴增。以提取的霉菌DNA 為模板，進行PCR 擴增待鑒定菌株的rDNA-ITS 區(qū)域，將最后得到的PCR 擴增產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

PCR 引物表見表1，ITS 基因PCR 反應(yīng)程序見表2，ITS 基因PCR 擴增程序見表3。

表1 PCR 引物表

表2 ITS 基因PCR 反應(yīng)程序/μL

表3 ITS 基因PCR 擴增程序/次

（4） rDNA-ITS 堿基序列分析。將檢測合格的擴增產(chǎn)物送至華大基因生物有限公司進行測序，測序結(jié)果通過NCBI 網(wǎng)的BLAST 程序來搜索同源序列。

（5） 系統(tǒng)發(fā)育樹分析。挑選與靶目標列相似性較高的參考序列，采用MEGA7.0 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

（6） 菌種鑒定。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)結(jié)果，對菌株進行鑒定[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗霉菌的分離純化

從腐敗袋裝酸筍中共分離純化出2 種主要的優(yōu)勢腐敗霉菌，分別編號為F1、F2。在PDA 平板上28 ℃下培養(yǎng)7 d 后，菌株F1 菌落正面呈黃綠色，反面呈棕黑色，菌落中心有突起，質(zhì)地緊密，棉絮狀，生長速度較慢，在PDA 平板上28 ℃下培養(yǎng)7 d 后直徑為15～20 mm（見圖1（a） 和（b））；菌株F2 菌落正面呈灰綠色四周呈白色，反面呈灰白色，菌落中心無突起，較平坦，質(zhì)地疏松，絨毛狀，生長速度較快，在PDA 平板上28 ℃下培養(yǎng)7 d 后直徑為40～50 mm（見圖1（c） 和（d））。

在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)7 d 后菌落形態(tài)見表4，二種腐敗霉菌的菌落形態(tài)圖見圖1。

表4 在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)7 d 后菌落形態(tài)

圖1 二種腐敗霉菌的菌落形態(tài)圖

2.2 優(yōu)勢腐敗霉菌的顯微結(jié)構(gòu)

菌株在顯微鏡下的形態(tài)見圖2。

圖2 菌株在顯微鏡下的形態(tài)

將分離得到的2 種目標菌株進行顯微觀察。由圖2 可知，通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株F1 的菌絲有橫隔，分生孢子頭呈分枝根狀，分生孢子鏈生呈寬圓柱或廣橢圓形，壁較平滑；菌株F2 的菌絲有橫隔，分生孢子頭呈球狀，分生孢子近球形或橢圓形，壁稍光滑。

2.3 優(yōu)勢腐敗霉菌的的分子學(xué)鑒定結(jié)果

優(yōu)勢霉菌的PCR 產(chǎn)物電泳圖見圖3。

通過PCR 擴增，得到優(yōu)勢腐敗霉菌的rDNA-ITS片段。由圖3 可知，霉菌F1、F2 的PCR 擴增產(chǎn)物均在500～750 bp 出現(xiàn)明顯目標條帶，ITS 序列分別為525 bp和555 bp，達到PCR 擴增預(yù)期結(jié)果。

圖3 優(yōu)勢霉菌的PCR 產(chǎn)物電泳圖

將目標菌株的rDNA-ITS 片段為模板，通過Blast 檢索進行序列比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株F1 與枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 親緣關(guān)系最近，達99.43%；菌株F2 與煙曲霉（Aspergillus fumigatus） 親緣關(guān)系最近，達99.31%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果可知菌株F1 為枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），菌株F2 為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

圖4 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

主要分離出了袋裝酸筍中的腐敗霉菌，通過傳統(tǒng)的真菌形態(tài)特征和顯微鏡觀察對分離出的菌株作了初步的鑒定，然后對純化菌株進行PCR 擴增rDNA-ITS 序列并測序和構(gòu)建系統(tǒng)進發(fā)育樹，結(jié)合分子生物學(xué)法，最終確定了導(dǎo)致袋裝酸筍腐敗的菌株的種屬。袋裝酸筍中的優(yōu)勢腐敗霉菌主要為枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 與煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。其中，煙曲霉是常見食品腐敗霉菌，嗜高溫，在45 ℃或更高的溫度下生長茂盛，會引起食品的快速腐敗變質(zhì)，使營養(yǎng)物質(zhì)大量損失[14]。袋裝酸筍在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，在不影響食品風(fēng)味的條件下，可以從包裝條件及貯存溫度等方面抑制優(yōu)勢腐敗霉菌的生長，從而達到延長產(chǎn)品保質(zhì)期的目的，為今后防止袋裝酸筍在生產(chǎn)加工及銷售貯藏中腐敗變質(zhì)，選擇適宜的殺菌保鮮方式提供一定參考依據(jù)。