番瀉葉致小鼠急性腹瀉模型的建立

藍(lán)咫林，劉倩影，俞泳兒，陳淳，劉錚輝，徐軍

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300392）

腹瀉是仔豬生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常見的疾病之一，也是小動物如犬貓臨床中常見的消化道疾病。引起仔豬及犬貓腹瀉的病因復(fù)雜多樣，其中之一是斷奶營養(yǎng)性腹瀉，主要是因?yàn)樽胸i消化系統(tǒng)及消化酶沒有發(fā)育完全，腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不能被及時(shí)消化吸收，存積于腸道內(nèi)，形成滲透性腹瀉。番瀉葉腹瀉模型是急性腹瀉，也是分泌性腹瀉，其腹瀉機(jī)制是刺激腸黏膜而引起的電解質(zhì)吸收受阻或分泌旺盛及腸蠕動頻率過快[1-3]。關(guān)于番瀉葉誘導(dǎo)腹瀉的研究文獻(xiàn)很多，但文獻(xiàn)中番瀉葉的用量、濃度、用藥時(shí)長及試驗(yàn)動物各不相同[4-6]。本研究旨在用番瀉葉誘導(dǎo)建立小鼠急性腹瀉模型，通過觀察、分析飼喂番瀉葉后腹瀉小鼠的血糖血脂變化、腸道變化、腹瀉指數(shù)變化，對急性腹瀉模型進(jìn)行評價(jià)，為進(jìn)一步研究斷奶仔豬腹瀉奠定前期試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

30只健康昆明雄性小白鼠，體重20 g左右。

1.2 藥物

番瀉葉（太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司）100 g，加水熬制30 min，制成1 g/mL番瀉葉水煎液。葡萄糖測定試劑盒和甘油三酯測定試劑盒均購于中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 番瀉葉致小鼠急性腹瀉模型制備

30只昆明小鼠，隨機(jī)分為3組，分別為空白對照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組，每只每次分別灌服生理鹽水0.2 mL、番瀉葉水煎液0.2 mL、番瀉葉水煎液0.3 mL。各組每天各處理2次。連續(xù)處理5 d，停藥后觀察2 d。

1.4 樣本采集

記錄每組小鼠日采食量和體重。記錄小鼠精神狀態(tài)和腹瀉情況。第5 d灌胃后，小鼠分籠放置，籠底鋪上定性濾紙，觀察每只小鼠的腹瀉次數(shù)及總便數(shù)，記錄稀便污染濾紙的直徑。分為4個(gè)等級。每個(gè)小時(shí)換一次濾紙，連續(xù)觀察 5 h。稀便率＝稀便數(shù)/總便數(shù)，平均稀便級＝所有稀便級數(shù)/稀便次數(shù)[7]。

采樣前斷食不斷水12 h。給藥后第6天，每組隨機(jī)抽取5只小鼠毛細(xì)管眼眶采血，3 500 r/min離心制備血清；于-20 ℃冰箱凍存。隨即處死采血小鼠，采集小鼠距回盲口1 cm處的回腸1 cm、盲腸（生理鹽水沖洗內(nèi)容物），置于 4%甲醛溶液中固定保存。

1.5 檢測指標(biāo)

自動生化分析儀測定血清中葡萄糖和甘油三酯濃度；小鼠腹瀉指數(shù)＝稀便率×平均稀便級；制作回腸、盲腸的蘇木精－伊紅（HE）染色病理切片。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用Duncan氏方法，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 不同用量番瀉葉對小鼠腹瀉的影響

從表1可以看出，兩個(gè)模型組的稀便率、稀便級、腹瀉指數(shù)與對照組比較均差異顯著（P＜0.05），兩個(gè)模型組之間稀便率與稀便級差異不顯著（P＞0.05），而兩個(gè)模型組之間的腹瀉指數(shù)差異極顯著（P＜0.01）。說明番瀉葉對小鼠造成了明顯的腹瀉影響。

表1 不同濃度番瀉葉對小鼠腹瀉的影響

2.2 不同用量番瀉葉對小鼠體重的影響

從表2可以看出，小鼠初始體重?zé)o差異，給藥造模后，模型組和對照組比較差異極顯著（P＜0.01），模型組之間比較差異不顯著（P＞0.05）。停藥后模型組體重仍然增長緩慢，兩組間比較差異不顯著（P＞0.05），與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。

2.3 不同用量番瀉葉對小鼠血清指標(biāo)的影響

從表3可以看出，血糖值各組之間差異不顯著（P＞0.05）。模型組 1與對照組的甘油三酯差異不顯著（P＞0.05）。模型組 2與模型組1及對照組甘油三酯差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 不同濃度番瀉葉對小鼠臨床表態(tài)的影響

對照組小鼠活潑好動，食欲好，糞便為表面光滑的長粒或圓粒狀。模型組小鼠，給藥一天后，即出現(xiàn)稀便，肛門周圍有糞便污染。毛色無光澤，不喜動。模型組小鼠飲水增加，食欲不如對照組，體重不增反而降低。給藥5 d后，停藥兩天期間，模型組小鼠腹瀉緩解，便數(shù)仍比對照組多，稀便少，軟便多。2個(gè)模型組小鼠體重較用藥第5天均有所增加，提示番瀉葉誘導(dǎo)小鼠腹瀉有潛在自愈傾向。

2.5 不同用量番瀉葉對小鼠腸道病理切片的影響

圖1顯示，對照組和模型組腸組織結(jié)構(gòu)緊密，可見黏膜層、肌層及漿膜層，黏膜層腸腺豐富，絨毛上皮完整，細(xì)胞形態(tài)正常，組織未見明顯壞死或炎癥反應(yīng)。圖2顯示，模型組2黏膜下層間隙增寬，肌層肌纖維排列疏松，著色變淺，絨毛上皮細(xì)胞少量脫落，未見明顯壞死或炎癥反應(yīng)。

圖1 不同濃度番瀉葉對小鼠回腸黏膜的影響（HE×400）

圖2 不同濃度番瀉葉對小鼠盲腸黏膜的影響（HE×400）

3 結(jié)果分析

3.1 番瀉葉急性腹瀉模型評定

番瀉葉主要化學(xué)成分是番瀉總苷類，在大腸進(jìn)一步分解，影響大腸尤其是結(jié)腸對水吸收，使腸腔容積增大，刺激腸壁反射性加劇小腸和結(jié)腸蠕動，促進(jìn)腸黏膜釋放前列腺素，在保護(hù)腸黏膜的同時(shí)，炎性介質(zhì)致使腸細(xì)胞通透性增加，最終導(dǎo)致腹瀉[3，8]。研究表明，驗(yàn)證腹瀉模型可通過觀察小鼠糞便情況進(jìn)行。糞便呈濕便、瀉下清水、便溏、黏液便都屬于腹瀉發(fā)生。而腹瀉癥狀、體征表現(xiàn)及腹瀉指數(shù)是評價(jià)腹瀉的標(biāo)志性指標(biāo)[3]。黃嘉璐用1 g/mL番瀉葉水煎液每天1次0.4 mL/20 g灌胃小鼠，連續(xù)作用7 d，喜杰等用0.5 g/mL番瀉葉水煎液0.02 mL/（g·d）連續(xù)給藥大鼠7 d，均得試驗(yàn)腹瀉模型[9-10]。而蘇萍等灌服0.2/mL番瀉葉0.5 mL/只，連續(xù)5 d，也得腹瀉模型[11]。本試驗(yàn)使用相同濃度的番瀉葉，分別每只0.2 mL和0.3 mL灌胃小鼠相同濃度不同數(shù)量的番瀉葉，每天1次制作小鼠急性腹瀉模型。作用5 d后，癥狀、體征和腹瀉指數(shù)變化明顯。試驗(yàn)期間無死亡現(xiàn)象發(fā)生。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可認(rèn)定小鼠急性腹瀉模型成立[3-4]。本試驗(yàn)停藥2 d后，兩個(gè)模型組小鼠體重較用藥最后一天有緩慢增加。提示，本研究1 g/mL番瀉葉分別0.2、0.3 mL灌服小鼠，連續(xù)作用5 d，停藥后小鼠急性腹瀉模型有退化的可能。這與趙妍等的研究，0.2 g/mL番瀉葉＋束縛1 h和0.2 g/mL番瀉葉＋束縛1.5 h作用的大鼠，體重在7 d后均有不同程度增加[12]有相似之處。而趙妍等研究發(fā)現(xiàn)0.3 g/mL番瀉葉＋束縛1 h番瀉葉作用的大鼠在14 d的試驗(yàn)過程中體重一直在下降[12]。說明番瀉葉致小鼠腹瀉模型的穩(wěn)定性與番瀉葉的濃度和劑量有密切關(guān)聯(lián)。

3.2 番瀉葉對小鼠回腸及盲腸黏膜結(jié)構(gòu)影響

王楊等研究發(fā)現(xiàn)灌胃番瀉葉水煎液（20 mL/kg），給藥2周。大鼠排水樣稀便，小腸絨毛表皮細(xì)胞明顯凋亡與壞死，固有層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血明顯，間質(zhì)有少量中性粒細(xì)胞浸潤[13]。趙妍等研究發(fā)現(xiàn)番瀉葉＋束縛致大鼠腹瀉，14 d時(shí)各組腸道黏膜層、黏膜下層和肌層結(jié)構(gòu)完整，未見有病理學(xué)改變[12]。本研究各組回腸及結(jié)腸雖黏膜下層間隙增寬，肌纖維排列松弛，絨毛上皮細(xì)胞少量脫落，但均未見明顯壞死和炎癥反應(yīng)。這可能是因?yàn)榉瑸a葉能促進(jìn)腸黏膜釋放一定量的前列腺素，保護(hù)了腸黏膜[8]。同時(shí)說明本研究所致小鼠腹瀉并不嚴(yán)重，未引起腸道黏膜組織形態(tài)學(xué)上明顯變化，也說明腹瀉模型腹瀉程度和所用番瀉葉濃度、劑量及作用天數(shù)有關(guān)聯(lián)。

3.3 番瀉葉對小鼠生化指標(biāo)影響

從試驗(yàn)的生化指標(biāo)來看，腹瀉對血糖沒有明顯影響，而模型組1與對照組的甘油三酯差異顯著，模型組2與模型組1及對照組的甘油三酯差異極顯著（P＜0.01）。說明腹瀉會影響小鼠甘油三酯的血液水平，并且隨著番瀉葉用量增加，腹瀉指數(shù)增加，甘油三酯血液水平明顯下降。黃嘉璐通過非靶向代謝組學(xué)對尿液血清代謝物分析發(fā)現(xiàn)，番瀉葉致瀉過程可以導(dǎo)致機(jī)體氨基酸代謝紊亂，三羧酸循環(huán)失調(diào)、多巴胺降解紊亂，產(chǎn)生一系列炎癥物質(zhì)包括前列腺素[9]。姚萬玲通過構(gòu)建大鼠大腸濕熱證模型，使用代謝組學(xué)分析方法，發(fā)現(xiàn)治療藥物可以通過作用在脂肪分解、脂肪酸氧化分解的代謝通路來緩解腹瀉[14]。以上文獻(xiàn)均表明腹瀉會影響體內(nèi)糖、脂類及氨基酸代謝。由此推測本研究結(jié)果番瀉葉腹瀉導(dǎo)致體重下降，是因?yàn)闄C(jī)體為了維持血糖水平恒定，使脂肪分解加快，肌肉分解加快，糖異生原料增加，糖異生加快，從而消耗了血液中的脂類，導(dǎo)致造模期間小鼠體重下降[15]。