張智玉，曹 軍，梁俊波

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

肝臟是重要的代謝調(diào)控和藥物解毒器官,肝細胞是肝臟的主要實質(zhì)細胞,是肝臟功能的主要承擔(dān)者。然而,由于種種原因,胚胎時期肝臟發(fā)育中肝細胞分化的研究仍然有限。

誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)經(jīng)過逐步誘導(dǎo)分化形成類肝細胞及肝臟類器官是目前研究肝臟發(fā)育的經(jīng)典模型。2013年首次將PSCs誘導(dǎo)形成的肝內(nèi)胚層細胞與內(nèi)皮細胞、間充質(zhì)細胞按一定比例混合,在體外聚合形成了3D肝芽結(jié)構(gòu)[1]。隨后,經(jīng)過對該模型的不斷優(yōu)化和改進,最終實現(xiàn)了PSCs向膽管細胞分化以及向肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞共分化[2-4]。然而,該模型誘導(dǎo)分化過程耗時較長、成本較高。成體來源的膽管類器官(intrahepatic cholangiocyte organoid, ICO)能夠在體外長期擴增并保持膽管細胞的特征,同時可經(jīng)一步誘導(dǎo)分化為類肝細胞[5],且培養(yǎng)過程相對簡單,分化時間較短,為體外探究肝臟發(fā)育提供了新的途徑。但膽管類器官對肝臟發(fā)育的模擬潛力仍不明確。

本研究利用小鼠膽管類器官轉(zhuǎn)分化模型,以肝臟發(fā)育過程中已知的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子肝細胞核因子4 α(hepatocyte nuclear factor 4α,Hnf4α)敲除的膽管類器官為例,結(jié)合小鼠胎肝單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),從基因變化趨勢、生物學(xué)功能、regulon調(diào)控關(guān)系三方面,比較了膽管類器官轉(zhuǎn)分化與胎肝發(fā)育中的分化異同,以探究膽管類器官作為研究肝臟發(fā)育模型的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

Advanced DMEM/F12、B27細胞無血清培養(yǎng)添加劑、N2添加劑、GlutaMAX、青霉素/鏈霉素、EGF和TrypLE(Life Technologies公司);N-乙酰半胱氨酸、煙酰胺、forskolin、γ分泌酶抑制劑DAPT、地塞米松和TGF-β受體拮抗劑A83-01(Sigma-Aldrich公司);R-spondin1(R&D公司);FGF10和HGF(Peprotech公司);胃泌素(Tocris Bioscience公司);Matrigel Matrix(BD公司);小鼠膽管類器官由復(fù)旦大學(xué)趙冰實驗室惠贈[6];微量樣品總RNA提取試劑盒(上海天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1Hnf4α敲除膽管類器官的構(gòu)建:利用在線網(wǎng)站設(shè)計針對HNF4α蛋白編碼區(qū)的sgRNA序列:GG GACCGGATCAGCACGCGG,非靶向sgRNA序列:AAGGCGTAAACGAGTACACG。合成相應(yīng)寡核苷酸序列后退火形成雙鏈DNA,連到酶切后的CROP-seq-mCherry載體上。將Hnf4α敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞包裝慢病毒,用慢病毒感染類器官。通過流式細胞分選技術(shù)篩選成功感染的細胞。

1.2.2 小鼠膽管類器官轉(zhuǎn)分化:根據(jù)Hans Clever實驗室的方法對小鼠膽管類器官進行擴增和轉(zhuǎn)分化[7]:首先將非靶向(non-targeting, NT)膽管類器官和Hnf4α敲除膽管類器官在分化培養(yǎng)基1(differentiation medium 1, DM-1)培養(yǎng)4 d,再在DM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d,進行轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo);同時將膽管類器官在擴增培養(yǎng)基(expansion medium, EM)中培養(yǎng)作為對照。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing, RNA-seq)樣品制備及高通量測序:分別收集在EM中培養(yǎng)的類器官(EM組)、在DM中培養(yǎng)的類器官(DM組),以及在DM中培養(yǎng)的Hnf4α敲除的類器官(KO組)樣品,每組設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)。用微量樣品總RNA提取試劑盒收集細胞并提取細胞總RNA,送諾禾致源公司進行轉(zhuǎn)錄組建庫及高通量測序。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析:以Gapdh為內(nèi)參基因計算基因相對表達量。用DESeq2分別對DM組和EM組,KO組和DM組的RNA-seq數(shù)據(jù)進行差異表達分析,篩選差異表達基因的標(biāo)準為|log2FC|>1,且校準后P<0.05。用clusterProfiler軟件中的enrichGO對差異表達基因進行GO分析并去冗余,用gseaKEGG做通路富集分析。在Hnf4α敲除后下調(diào)的差異表達基因中,用Rcistarget基于Motif分析識別與Hnf4α有直接調(diào)控關(guān)系的基因作為候選靶基因。

1.2.5 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析:從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載小鼠胎肝多時間點的scRNA-seq數(shù)據(jù)(GSE90047),每百萬條讀長的轉(zhuǎn)錄本(transcripts per million, TPM)標(biāo)準化后,用prcomp做主成分分析(principal component analysis, PCA),取主成分1(principal component 1, PC1)的loading值前200的基因做后續(xù)分析。GSA數(shù)據(jù)庫(https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/)下載小鼠胎肝多時間點的scRNA-seq數(shù)據(jù)(CRA002445),用Cell Ranger整理fastq數(shù)據(jù)為表達矩陣,Seurat進行聚類、歸一化、降維、分群等處理,根據(jù)標(biāo)記基因注釋細胞類型,每個時間點抽取1 000個肝細胞/肝母細胞用于后續(xù)分析。用pySCENIC預(yù)測胎肝發(fā)育過程中的regulon,從Hnf4α的regulon中提取其下游靶基因作為候選靶基因。

2 結(jié)果

2.1 膽管類器官轉(zhuǎn)分化體系的驗證

經(jīng)過分離培養(yǎng),單個細胞自組織形成3D類器官,該類器官呈現(xiàn)囊性結(jié)構(gòu)(圖1)。EM組類器官表達Lgr5等干細胞標(biāo)志基因(圖2)。

EM.intrahepatic cholangiocyte organoid cultured in expansion medium; KO.intrahepatic cholangiocyte organoid cultured differentiation medium after Hnf4α knockout

EM.intrahepatic cholangiocyte organoid cultured in expansion medium

EM組表達膽管標(biāo)志基因,如Spp1和Cftr,不表達肝細胞標(biāo)志基因,如Apoa1、Ttr和Mup20。相較于EM組,DM組類器官中膽管標(biāo)志基因的表達降低,肝細胞標(biāo)志基因表達升高。KO組類器官中膽管標(biāo)志基因的表達與DM相近,肝細胞標(biāo)志基因的表達低于DM組而高于EM組(圖3)。

DM.intrahepatic cholangiocyte organoid cultured in differentiation medium; EM.intrahepatic cholangiocyte organoid cultured in expansion medium; KO.intrahepatic cholangiocyte organoid cultured differentiation medium after Hnf4α knockout; ICOs.intrahepatic cholangiocyte organoids

2.2 小鼠膽管類器官轉(zhuǎn)分化過程中基因表達的變化趨勢與小鼠胎肝發(fā)育一致

胎肝的主成分分析中,主成分1(PC1)方向與分化方向一致(圖4A)。PC1載荷值(loading)絕對值最大的200個基因的熱圖顯示,在分化過程中,載荷值為負值的基因隨著胎肝發(fā)育表達量下降,而正值的基因隨著胎肝發(fā)育表達量上升(圖4B)。

比較這200個基因在DM組與EM組差異分析中的log2FC值與載荷值的正負方向,84.14% 載荷值為負值的基因,log2FC也為負值,即在膽管類器官的轉(zhuǎn)分化過程中表達量下降(圖4C);83.87%載荷值為正值的基因,log2FC也為正值,即在轉(zhuǎn)分化過程中表達量上升(圖4D)。

A.principal component analysis of hepatocyte/hepatoblastic during fetal liver development; B.heatmap showed the expression of top 200 variable genes; C.log2FC value of the genes whose loading values were negative; D.log2FC value of the gene with positive loading values

2.3 膽管類器官分化過程中的功能變化

DM組與EM組相比篩選出3 382個差異基因,包括1 694個表達下調(diào)的差異基因和1 688個表達上調(diào)的差異基因(圖5)。

圖5 膽管類器官(ICO)分化過程中的差異表達基因Fig 5 Volcano plot of differentially expressed genes during intrahepatic cholangiocyte organoid (ICO) differentiation

DM組與EM組相比,下調(diào)的差異基因主要富集在核分裂、染色體分離、細胞周期和DNA復(fù)制等生物學(xué)過程。上調(diào)的差異基因主要富集在脂肪酸、類固醇、烯烴化合物、不飽和脂肪酸、類二十糖苷、花生四烯酸代謝等與肝實質(zhì)細胞功能密切相關(guān)的生物學(xué)過程(圖6)。

圖6 差異表達基因GO 富集分析結(jié)果Fig 6 GO enrichment analysis for differentially expressed genes

EM組中細胞周期和DNA復(fù)制等相關(guān)通路的基因表達上調(diào),DM組中視黃醇和細胞色素P450代謝等相關(guān)通路的基因表達上調(diào),這與GO通路富集結(jié)果類似(圖7)。

A.up-regulated pathways in EM; B.up-regulated pathways in DM

2.4 Hnf4α敲除對類器官分化的影響

Hnf4α敲除組細胞與DM組細胞相比,共篩選出1 429個差異表達基因,包括864個表達下調(diào)的差異基因和565個表達上調(diào)的差異基因。

Hnf4α敲除后表達下調(diào)的差異基因主要富集在脂肪酸、類二十糖苷和烯烴化合物代謝以及上皮細胞增殖等過程。表達上調(diào)的差異基因主要富集在纖毛組裝和運動等過程(圖8)。

2.5 兩種分化過程中Hnf4α regulon調(diào)控關(guān)系的比較

在膽管類器官和小鼠胎肝中分別預(yù)測到263個和1 386個Hnf4α正調(diào)控的靶基因,其中46個基因為共有靶基因。以小鼠所有基因為背景做顯著性檢驗,共有靶基因P-value為1.8e-16,odds ratio為5,兩個靶基因集有顯著關(guān)聯(lián)。共有靶基因主要富集在小分子代謝調(diào)節(jié)、脂質(zhì)定位、脂肪酸代謝、細胞增殖調(diào)控、類固醇代謝和肝臟發(fā)育等過程(圖9A)。類器官和胎肝中Hnf4α及其共有靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,Zfhx4、Igfbp4和Sec16b在類器官中排名靠前,受調(diào)控影響大;胎肝中Hnf4α調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Nr1h3、Tcf7l1、Ppara和Arnt2,并協(xié)同調(diào)控下游靶基因(圖9B, C)。

將類器官中Hnf4α的263個靶基因按照-log2FC值排序,排名前4的靶基因Zfhx4、Igfbp4、Sec16b和Inhba為胎肝共有靶基因(圖 9D),在胎肝發(fā)育中也隨Hnf4α表達量而發(fā)生變化,提示類器官中Hnf4α敲除后基因表達影響最大的基因和胎肝發(fā)育中的分化一致。以往研究表明,這4個靶基因與增殖發(fā)育有關(guān)[8-10]。

圖 8 Hnf4α敲除后的差異基因GO富集分析Fig 8 GO enrichment analysis for differentially expressed genes upon Hnf4α knockout

A.GO enrichment analysis for overlapped target genes; B.regulatory network of Hnf4α in organoid transdifferentiation; C.regulatory network of Hnf4α in fetal liver development; the thickness of the arrow represents the intensity of regulation (-log2FC); D.the position of overlapped genes in all target genes of organoids, the thickness of the arrow represents the intensity of regulation (importance value)

3 討論

本研究從基因變化趨勢、生物學(xué)功能,以Hnf4α為例的regulon調(diào)控關(guān)系這3個方面,比較了膽管類器官體系和小鼠胎肝發(fā)育中的分化過程。

相較于EM組,DM組類器官中膽管標(biāo)志基因的表達降低,肝細胞標(biāo)志基因表達升高,表明膽管類器官向肝細胞分化。相較于DM組,KO組中肝細胞標(biāo)志基因的表達的降低,表明Hnf4α的敲除影響了膽管類器官向肝細胞的分化。

在膽管類器官向肝細胞轉(zhuǎn)分化的過程中,基因表達的變化方向與胎肝發(fā)育一致。隨胎肝發(fā)育過程表達量發(fā)生變化的基因中包含多個肝細胞標(biāo)志基因,如Alb、Apoa1,Ttr等,在類器官轉(zhuǎn)分化過程中其表達變化趨勢與胎肝發(fā)育總體一致。

在膽管類器官分化前后差異基因的功能富集分析結(jié)果中,膽固醇、脂質(zhì)和細胞色素P450等代謝相關(guān)通路的基因在DM組中表達上調(diào),這與以往研究相符[11],表明該轉(zhuǎn)分化體系能夠?qū)⒛懝茴惼鞴俎D(zhuǎn)分化為類肝細胞;而DM組中細胞周期、DNA復(fù)制等基因的下調(diào),與分化體系中DAPT 的添加有關(guān)[12]。

在類器官分化體系中,Hnf4α敲除后下調(diào)基因富集在與肝細胞功能密切相關(guān)的代謝過程,表明Hnf4α敲除抑制了膽管類器官向肝細胞分化和成熟,這與Hnf4α敲除小鼠肝內(nèi)脂質(zhì)堆積,血清膽固醇和三酰甘油水平降低,脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運紊亂相符[13]。

類器官轉(zhuǎn)分化體系與胎肝發(fā)育過程中Hnf4α的下游靶基因部分重合,特別是類器官中Hnf4α敲除后對下游靶基因影響最大的基因,提示膽管類器官轉(zhuǎn)分化與胎肝發(fā)育中的分化具有一定的相似性。

本研究從全轉(zhuǎn)錄組層面,描繪了小鼠膽管類器官轉(zhuǎn)分化過程中的基因表達、功能變化和調(diào)控關(guān)系,并與小鼠胎肝發(fā)育分化進行比較。結(jié)果表明,膽管類器官轉(zhuǎn)分化可以部分模擬胎肝發(fā)育中肝實質(zhì)細胞的分化過程,為膽管類器官轉(zhuǎn)分化模型用于研究肝發(fā)育過程提供了基礎(chǔ)。