李 珍，段昭君，羅云萍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系，北京 100005

在所有惡性腫瘤中,肺癌已經(jīng)成為發(fā)病第二位,死亡第一位的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人們生命健康[1]。隨著肺癌篩查的擴(kuò)大、放射技術(shù)的改進(jìn)以及治療的進(jìn)步,肺癌治療方法發(fā)生了顯著的變化,除了傳統(tǒng)的外科治療、放療和化療之外,還發(fā)展出了分子靶向治療以及免疫治療[2]。然而,肺癌的預(yù)后卻依然不容樂觀,中晚期患者的5年生存期僅為5%[3-4],其中一個關(guān)鍵因素是腫瘤內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞驅(qū)動了癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)是一小群擁有高致瘤性、增殖分化潛能和自我更新能力的腫瘤細(xì)胞亞群,同時也是腫瘤起始、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根本原因[5]。因此,為了改善肺癌患者的長期預(yù)后效果,靶向CSC開發(fā)新的治療策略成為了腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究的熱點。據(jù)文獻(xiàn)報道,已知的肺癌干細(xì)胞(lung cancer stem cells, LCSCs)的細(xì)胞表面標(biāo)記有CD44、EpCAM和CD133等,但這些標(biāo)記分子在正常細(xì)胞上也同樣表達(dá)[6-7],這種特點使得它們在臨床上的應(yīng)用受限。

神經(jīng)節(jié)苷脂GD2是一種含有兩個唾液酸的糖鞘脂,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中合成后被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面,并由限速酶GD3合成酶(GD3 synthase, GD3S)調(diào)控其表達(dá)[8]。GD2僅低密度表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng),周圍神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚黑素細(xì)胞等正常組織,卻在許多種腫瘤中高度表達(dá),因此被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen, TAA)[9]。在腫瘤中,GD2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、運動、遷移、黏附和侵襲[10],并且,GD2已被證實表達(dá)于乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells, BCSCs)[8, 11]。綜上,GD2有望為CSC免疫治療提供有效的靶抗原。所以,本研究檢測了多種肺癌干細(xì)胞上GD2的表達(dá),選取GD2表達(dá)豐度最高的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為細(xì)胞模型,探索GD2作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的可能性,以期為肺癌干細(xì)胞的免疫治療提供靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:人肺癌細(xì)胞系H2170、H446、H1975、H1299和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC)。

1.1.2 實驗動物: SPF級6～8周齡雄性裸鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心)。

1.1.3 試劑:胎牛血清、100×青霉素鏈霉素(Gibco公司);RPMI1640培養(yǎng)基(Biological Industries公司);低吸附6孔板(Corning公司);成球培養(yǎng)基(Stem Cell公司);GD2抗體(LifeSpan生物科技公司);流式抗體:CD44-APC、EpCAM-FITC、Mouse-FITC和Mouse-APC(Biolegend公司);RNA快速提取試劑盒(奕杉生物科技有限公司);RT-qPCR試劑盒和qPCR試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司);一抗Nanog、Oct4和β-actin(Cell Signaling Technology公司);抗體GD3S(Proteintech公司);CCK8檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);結(jié)晶紫染液(索萊寶生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系培養(yǎng):細(xì)胞系H2170、H446、H1975、H1299和A549均使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞增殖至合適密度后以1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞系的成球培養(yǎng):將貼壁培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞消化成單個細(xì)胞,用PBS重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。向低吸附6孔板的每個孔中加入2 000個腫瘤細(xì)胞,并用無血清的成球培養(yǎng)基培養(yǎng)。在37 ℃,5% CO2的孵箱中培養(yǎng)7～10 d后收集所有腫瘤細(xì)胞球。

1.2.3 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞表面分子的表達(dá):將待檢測的腫瘤細(xì)胞制備成細(xì)胞濃度為1×109個/L的單細(xì)胞懸液,加入檢測抗體(抗體∶細(xì)胞懸液=1∶100),4 ℃避光孵育30 min后使用PBS洗滌2次。用PBS重懸細(xì)胞,在2 h之內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞測量術(shù)檢測。所得數(shù)據(jù)均通過BD公司的FlowJo軟件分析。

1.2.4 RT-qPCR檢測干性相關(guān)基因及GD3S基因的mRNA表達(dá):使用RNA提取試劑盒分別提取貼壁細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞球的RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以β-actin為內(nèi)參,利用SYRB Green法進(jìn)行real-time PCR檢測,并且分析相關(guān)基因在RNA水平的相對表達(dá)量。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測干性相關(guān)蛋白及GD3S的表達(dá):收取貼壁細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞球的總蛋白質(zhì),測定蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE,每孔蛋白質(zhì)上樣量為40 μg。電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,封閉后分別孵育一抗Nanog、Oct4、GD3S和β-actin過夜。次日洗膜后孵育二抗1 h,再次洗膜后滴加顯影液并拍攝蛋白條帶。

1.2.6 流式細(xì)胞測量術(shù)分選A549細(xì)胞中GD2-和GD2+細(xì)胞亞群:將待分選的單細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為1×1010個/L,加入抗體(抗體∶細(xì)胞懸液=1∶100),4 ℃避光孵育45 min,PBS洗滌2遍后重懸細(xì)胞,盡快使用MA900流式分選儀分選目標(biāo)細(xì)胞。

1.2.7 CCK8法檢測細(xì)胞體外增殖:將GD2-和GD2+A549細(xì)胞亞群的細(xì)胞濃度調(diào)整為1×109個/L,保證接種至96孔板中每個孔的細(xì)胞數(shù)量相同,接種完成后,十字形搖晃96孔板保證細(xì)胞分布均勻。待細(xì)胞全部貼壁后按照說明書測定0、24、48和72 h時的A值并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 Transwell小室法檢測體外侵襲:用PBS重懸細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),分別將2×105個GD2-A549和GD2+A549細(xì)胞鋪入24孔小室。將小室懸掛于24孔板中,孔板中加入500 mL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)10～12 h后,取出小室輕輕清洗,用多聚甲醛固定,再次清洗后采用結(jié)晶紫染料染色。染色結(jié)束后用蒸餾水清洗并用棉簽擦干,在顯微鏡下觀察并拍下遷移至小室膜外側(cè)的細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 細(xì)胞劃痕愈合實驗檢測體外遷移:分別將3×105個GD2-A549和GD2+A549細(xì)胞鋪入24孔板,待細(xì)胞匯合至90%時,使用黃槍頭在孔板底部沿小孔直徑垂直劃線,劃線后更換新鮮的完全培養(yǎng)基去除脫落的細(xì)胞。0、24和48 h內(nèi)顯微鏡下觀察孔內(nèi)劃痕寬度的變化,分別選取3個獨立視野進(jìn)行拍照并統(tǒng)計分析劃痕愈合比例。

1.2.10 A549肺癌移植瘤模型的建立:將裸鼠隨機(jī)分為2組,每組3只。將分選得到的GD2-和GD2+A549細(xì)胞制備成1×1010個/L的單細(xì)胞懸液。向每只裸鼠的右背側(cè)部皮下接種200 μL細(xì)胞懸液。待腫瘤長出后,每隔2 d測量1次腫瘤大小。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同肺癌細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞中GD2的表達(dá)情況

腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)流程(圖1A),原本貼壁培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過成球培養(yǎng)后,具有干性的腫瘤細(xì)胞會存活并增殖形成漂浮的腫瘤球(圖1B)。相較于貼壁狀態(tài)的肺癌細(xì)胞,H2170和H446細(xì)胞的腫瘤球幾乎不表達(dá)GD2,而H1975,H1299和A549細(xì)胞的腫瘤球展示了不同的GD2表達(dá)水平,其中A549細(xì)胞的腫瘤球中GD2的表達(dá)豐度最高(圖1B)。

A.spheroid culturing; B.morphology of tumor spheres and the expression of GD2 in tumor sphere cells

2.2 A549腫瘤球細(xì)胞中GD2陽性細(xì)胞比例增高

相較于貼壁培養(yǎng)的A549腫瘤細(xì)胞,A549腫瘤球細(xì)胞的干性基因NANOG,SOX2和OCT4在基因水平的表達(dá)分別增加了9.03(P<0.01),1.67(P<0.05)和19.04倍(P<0.001),參與GD2合成過程的關(guān)鍵限速酶GD3S在基因水平的表達(dá)上升了4.58倍(P<0.01)(圖2A)。在蛋白水平上,相比于貼壁狀態(tài)下的A549細(xì)胞,A549腫瘤球中NANOG,OCT4和GD3S蛋白的表達(dá)顯著升高(圖2B)。與Isotype對照相比,貼壁培養(yǎng)的A549細(xì)胞幾乎不表達(dá)GD2,而經(jīng)過腫瘤球培養(yǎng)富集的A549腫瘤干細(xì)胞中GD2的表達(dá)水平從0.57%上升至20.4%(圖2C)。

A.relative gene expression in A549 cells; B.relative protein expression in A549 cells; C.expression of GD2 in A549 cells; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with adherent group

2.3 GD2+ A549細(xì)胞亞群的增殖、侵襲和遷移能力增強

相較于GD2-A549細(xì)胞, GD2+A549細(xì)胞表達(dá)的限速酶GD3S的mRNA是GD2-A549細(xì)胞的9.48倍(P<0.01)(圖3A)。與GD2-A549細(xì)胞相比,GD2+A549細(xì)胞在24 h(P<0.05),48 h(P<0.01)和72 h(P<0.05)時的細(xì)胞增殖均快于GD2-A549細(xì)胞(圖3B)。GD2+A549細(xì)胞侵襲至小室外側(cè)的細(xì)胞顯著增多(圖3C),其結(jié)晶紫染色的覆蓋率是GD2-A549細(xì)胞的1.81倍(P<0.05)。此外, GD2+A549細(xì)胞的劃痕愈合比例要高于GD2-A549細(xì)胞(圖3D),48 h時GD2+A549細(xì)胞的遷移能力是GD2-A549細(xì)胞的1.27倍(P<0.01)。

A.obtaining GD2-/GD2+ A549 cells by flow sorting; B.CCK8 assays of GD2-/GD2+ A549 cells; C.Transwell assays of GD2-/GD2+ A549 cells; D.wound healing assays of GD2-/GD2+ A549 cells; *P<0.05, **P<0.01 compared with GD2- group

2.4 GD2與肺癌干細(xì)胞表型CD44hi和EpCAM+密切聯(lián)系

GD2+和GD2-A549細(xì)胞中CD44hi(CD44 high expression)的細(xì)胞比例分別為79.3%和17.1%,經(jīng)統(tǒng)計,前者是后者的3.43倍(P<0.01)(圖4A)。與此同時,CD44lo(CD44 low expression)A549細(xì)胞中僅有0.57%的細(xì)胞表達(dá)GD2,而CD44hiA549細(xì)胞中GD2+細(xì)胞比例高達(dá)34.4%,統(tǒng)計后是CD44loA549細(xì)胞的40倍(P<0.001)(圖4B)。另外,相較于GD2-A549細(xì)胞,GD2+A549細(xì)胞中EpCAM的表達(dá)從2.67%上升到了11.2%,統(tǒng)計后其EpCAM+細(xì)胞的比例是GD2-A549細(xì)胞的4.13倍(P<0.001)(圖4C)。最后,EpCAM-A549細(xì)胞中有2.67%的細(xì)胞表達(dá)GD2,而EpCAM+A549細(xì)胞的GD2+細(xì)胞比例達(dá)到了11.7%,統(tǒng)計后是EpCAM-A549細(xì)胞的4.13倍(P<0.001)(圖4D)。

CD44hi.CD44 high expression; CD44lw.CD44 low expression; A.expression of CD44hi in GD2-/GD2+ A549 cells; B.expression of GD2 in CD44lo/CD44hi A549 cells; C.expression of EpCAM in GD2-/GD2+ A549 cells; D.expression of GD2 in EpCAM-/EpCAM+ A549 cells; *P<0.01, **P<0.001 compared with GD2- group;#P<0.001 compared with CD44lo group; △P<0.001 compared with EpCAM-group

2.5 GD2+ A549細(xì)胞形成的腫瘤惡性程度更高

相較于接種GD2-A549細(xì)胞,接種GD2+A549細(xì)胞后腫瘤的生長速度顯著提高(P<0.001)(圖5A),腫瘤的體積顯著增大(圖5B), GD2+A549腫瘤的質(zhì)量是GD2-A549腫瘤的3.84倍(P<0.01)(圖5C)。

A.tumor growth curve; B.tumor images; C.tumor weight; *P<0.01, **P<0.001 compared with GD2- group

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因,目前用于肺癌治療的治療手段卻未能根除CSC群體[6],因此,尋求一個特異性高的靶向肺癌干細(xì)胞的靶點可以提供一種更精確、更有效的治療策略以清除CSC。本研究結(jié)果顯示,在眾多肺癌細(xì)胞系中,GD2的表達(dá)水平不盡相同,一方面是由于不同細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞的比例不同,另一方面是基因突變型不同的肺癌干細(xì)胞的細(xì)胞表面分子有所不同[12],提示基于GD2的靶向CSC的治療策略要更加精準(zhǔn)。

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在成球培養(yǎng)后,其干性基因NANOG、SOX2和OCT4的mRNA和蛋白質(zhì)(NANOG和OCT4)的表達(dá)增高證明了腫瘤干細(xì)胞的成功富集。調(diào)控GD2合成的關(guān)鍵限速酶GD3S和GD2在成球培養(yǎng)后的A549細(xì)胞中的上調(diào)表達(dá)與預(yù)期的肺癌干細(xì)胞高表達(dá)GD2一致。從另外一方面看,GD2+A549細(xì)胞相較于GD2-A549細(xì)胞表現(xiàn)出了更強的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等干性特征。這是因為GD2可以通過保持細(xì)胞增殖能力的增加在轉(zhuǎn)移部位的附著和固定中發(fā)揮作用,高水平的GD2表達(dá)會增強細(xì)胞從原發(fā)位點的脫離和細(xì)胞遷移,從而導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13-14]。然而,抗GD2單克隆抗體dinutuximab可以選擇性地識別GD2+腫瘤細(xì)胞,與GD2結(jié)合后顯著降低腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移,抑制腫瘤的生長[11],提示dinutuximab抗體有潛力成為肺癌的新治療方法。

本研究還發(fā)現(xiàn)GD2的表達(dá)水平與另外兩種肺癌干細(xì)胞表型CD44和EpCAM的表達(dá)呈正相關(guān),這證明GD2是具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞子集的標(biāo)志物,GD2可鑒定肺癌干細(xì)胞。與此同時,這還提供了新的用于識別肺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物組合,例如GD2+CD44hi或GD2+EpCAM+,提高了鑒別的特異性和準(zhǔn)確度。A549肺癌移植瘤模型更是展示了GD2+A549細(xì)胞的強致瘤特性,相比GD2-A549細(xì)胞,其惡性程度更高,靶向GD2+腫瘤細(xì)胞或許是肺癌免疫治療成功的關(guān)鍵。

綜上所述,本研究通過分析肺癌球細(xì)胞上GD2的表達(dá)情況以及GD2+腫瘤細(xì)胞的干性表型,初步證明了GD2可作為肺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物以識別腫瘤干細(xì)胞。為將靶向GD2+腫瘤細(xì)胞作為抑制CSC相關(guān)腫瘤生長、化療耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移的新策略,擴(kuò)大抗GD2單克隆抗體的應(yīng)用范圍提供了一定的理論基礎(chǔ)。