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      響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取藍(lán)莓果渣多酚工藝研究

      2023-05-05 08:15:12王大全王俊穎翟立公時志軍曹雙雙楊劍婷
      安徽科技學(xué)院學(xué)報 2023年1期
      關(guān)鍵詞:果渣藍(lán)莓用量

      王大全,王俊穎,翟立公,時志軍,曹雙雙,楊劍婷*

      (1.安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;2.安徽省鳳陽縣健民藍(lán)莓農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,安徽 鳳陽 233100)

      藍(lán)莓又稱越橘,為多年生落葉常綠灌木[1],藍(lán)莓果實為紅色、紫色或藍(lán)黑色的小漿果,形狀接近圓形[2]。其果實中含有較多的人體營養(yǎng)成分,具有良好的養(yǎng)生功效,如保護(hù)視力,強(qiáng)健心臟,以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力,延緩神經(jīng)衰老等功能[3]。目前,藍(lán)莓以其豐富的營養(yǎng)價值和良好的生物功效,引起了人們的廣泛關(guān)注,從而促進(jìn)了藍(lán)莓制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。利用藍(lán)莓為原料,已經(jīng)生產(chǎn)出了不同種類的產(chǎn)品,如藍(lán)莓粉、藍(lán)莓果凍、藍(lán)莓果醬以及藍(lán)莓味飲料等[4]。多酚是分子中具有多種羥基酚的總稱,為次生代謝產(chǎn)物,是由植物中的酚類物質(zhì)所產(chǎn)生的,主要存在于皮、根、葉和果實中。藍(lán)莓中有多種富含多酚的物質(zhì),如花色苷類、單寧類、黃酮類等,多酚還具有抗氧化以及抗炎作用,可有效預(yù)防心血管病、癌癥等[5]。

      由于對藍(lán)莓多酚需求的逐漸增加,藍(lán)莓多酚提取工藝技術(shù)的研究不斷發(fā)展。目前,提取多酚的方法有多種,如溶劑提取法、超聲波輔助法、微波提取法等[6-8],而采用酶法提取果渣多酚的報道并不多。在果渣中多酚多以聚合物的形式存在,通常以糖苷鍵、氫鍵或疏水鍵與糖類、蛋白質(zhì)、纖維素以及淀粉等結(jié)合,形成穩(wěn)定的復(fù)合物[9]。纖維素酶可以破壞和降解細(xì)胞壁中的纖維素和果膠,使藍(lán)莓果渣中的植物細(xì)胞的原生質(zhì)體和液泡由于細(xì)胞壁損失而被破壞,釋放出多酚和其它活性物質(zhì),從而達(dá)到提取藍(lán)莓果渣中多酚的目的。酶法提取不僅具有試驗操作簡單、提取條件溫和的特點,還具有安全環(huán)保、營養(yǎng)素?fù)p失小的特點,從而可以有效降低提取溫度、縮短提取時間,提高產(chǎn)物得率[10-12]。本研究利用纖維素酶較高的選擇性和較強(qiáng)的特異性提取藍(lán)莓果渣中的多酚,顯著提高多酚的提取率,為藍(lán)莓果渣的綜合利用和加工開辟新的途徑[13-15]。因此,本試驗采用纖維素酶法提取藍(lán)莓果渣中的多酚,對纖維素酶用量、提取初始pH、料液比、提取時間、溫度等因素進(jìn)行探究,并且采用響應(yīng)面分析法對各因素進(jìn)行優(yōu)化研究,以此確定最佳提取工藝條件。

      1 材料與方法

      1.1 供試材料

      干制藍(lán)莓果渣(實驗室自制);福林酚(上海藍(lán)季生物技術(shù)有限公司);沒食子酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);纖維素酶(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水碳酸鈉,鹽酸(AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

      1.2 試驗儀器

      UV-5100型可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);DL-5-B型低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);FE22型pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

      1.3 測定項目及分析方法

      1.3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 在0~1.2 mL范圍(0.2 mL的體積梯度)內(nèi)準(zhǔn)確吸收沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入1 mL福林酚試劑,混勻,室溫靜置5 min,加入3 mL 10% Na2CO3溶液后定容搖勻,室溫暗處放置2 h后,在波長760 nm下,以沒加標(biāo)準(zhǔn)液的溶液作為空白對照,測定吸光度[16]。

      1.3.2 多酚含量測定 將藍(lán)莓果渣離心后得到的上清液,測其體積并稀釋,取0.2 mL樣品溶液置于體積為10 mL的容量瓶中,每組做3個平行試驗,測定樣品中的吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品溶液中的多酚含量和多酚得率[17]。

      1.3.3 提取藍(lán)莓果渣多酚的工藝流程 將藍(lán)莓渣60 ℃烘干,粉碎過篩保存。稱取一定量的藍(lán)莓渣粉,蒸餾水溶解加入纖維素酶恒溫水浴,離心取上清液。

      1.3.4 多酚提取工藝的單因素試驗 稱取藍(lán)莓果渣10 g,置于250 mL三角瓶中,考察提取時間(2、4、6、8、10 h)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、酶用量(0、2、5、10、15 mg/g)、初始pH(4.0、4.4、4.8、5.2、5.6)和溫度(40、45、50、55、60 ℃)等5種因素的影響,分別進(jìn)行單因素試驗,測定多酚的得率。

      1.3.5 多酚提取工藝的響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,利用響應(yīng)面分析軟件設(shè)計以料液比、pH、酶用量作為考察因素,進(jìn)行藍(lán)莓果渣多酚提取的優(yōu)化組合[18]。各因素水平的設(shè)計見表1。

      表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Response surface test factors

      2 結(jié)果與分析

      2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

      以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.133 7x+0.045 1,R2=0.997 8。

      圖1 多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polyphenols content

      2.2 提取時間對多酚得率的影響

      由圖2所示,在2~6 h內(nèi),隨著提取時間的延長,多酚得率逐漸上升;當(dāng)提取時間達(dá)到6 h時,多酚得率得到最大值,為(8.07±0.24) mg/g;當(dāng)提取時間超過6 h,多酚得率開始緩慢下降,因為提取時間過長,溫度會對多酚的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞,促使多酚發(fā)生氧化或者降解等不可逆的化學(xué)反應(yīng)[19],導(dǎo)致其含量降低。由圖2可知,當(dāng)提取時間超過6 h,藍(lán)莓多酚含量沒有明顯的降低,可知提取時間對多酚提取的影響較小,因此提取時間不作為考察因素,在響應(yīng)面試驗中固定提取時間為6 h。

      圖2 提取時間對多酚得率的影響Fig.2 Effects of time on the yield of polyphenols

      2.3 料液比對多酚得率的影響

      由圖3所示,當(dāng)料液比在1∶5~1∶20時,藍(lán)莓果渣中的多酚含量逐漸增多;當(dāng)料液比為1∶20時,多酚的得率最大,為(8.04±0.16) mg/g;這是當(dāng)在溶劑用量達(dá)一定程度時,多酚的溶出接近飽和,提取量不會隨料液比的增大而增加;當(dāng)料液比大于1∶20時,多酚得率逐漸下降,因為當(dāng)溶劑的用大時,體系在振蕩過程中會增加溶劑的含氧量,導(dǎo)致多酚被氧化,同時擴(kuò)散到溶劑里的多酚類化合物越多,吸附作用增強(qiáng)導(dǎo)致多酚含量降低,而且從經(jīng)濟(jì)角度考慮料液比增大會提高提取劑成本[20]。

      圖3 料液比對多酚得率的影響Fig.3 Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols

      2.4 酶用量對多酚得率的影響

      由圖4所示,纖維素酶用量逐步增加,藍(lán)莓渣中的多酚得率先增加至最大值后緩慢降低,當(dāng)纖維素酶用量為5 mg/g時,多酚得率達(dá)到最高,為(8.10±0.13) mg/g;當(dāng)纖維素酶用量大于5 mg/g時,多酚得率開始下降。這是因為纖維素酶的作用,會加快破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),從而促進(jìn)了藍(lán)莓果渣中細(xì)胞內(nèi)多酚類物質(zhì)的釋放,但是當(dāng)纖維素酶的數(shù)量達(dá)到一定數(shù)值后,酶水解的底物達(dá)到飽和,過量的酶分子會聚集在細(xì)胞周圍,進(jìn)而影響多酚類物質(zhì)的擴(kuò)散,造成多酚得率的降低。因此,纖維素酶最佳用量為5 mg/g。

      圖4 酶用量對多酚得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on polyphenol yield

      2.5 初始pH對多酚得率的影響

      由圖5所示,當(dāng)初始pH位于4.0~4.8時,藍(lán)莓果渣中的多酚得率隨著pH的增大而顯著提高,當(dāng)初始pH為4.8時,藍(lán)莓果渣中的多酚得率最大,為(8.06±0.13) mg/g;當(dāng)初始pH大于4.8時,隨著pH的增加,藍(lán)莓渣中多酚的含量開始下降。這主要是由于初始pH為4.8時纖維素酶的活性大,當(dāng)初始pH較高或較低時,酶活性會受到影響,降低纖維素酶的酶解效率,從而造成藍(lán)莓果渣中多酚含量的下降。因此,得出試驗中初始pH為4.8為宜。

      圖5 初始pH對多酚得率的影響Fig.5 Effects of initial pH on the yield of polyphenols

      2.6 提取溫度對多酚得率的影響

      由圖6所示,當(dāng)提取溫度在40~50 ℃下,藍(lán)莓果渣中的多酚得率逐漸升高;當(dāng)提取溫度達(dá)到50 ℃時,藍(lán)莓果渣多酚得率達(dá)到最高,為(8.08±0.1) mg/g;當(dāng)提取溫度超過50 ℃時,藍(lán)莓果渣中的多酚得率呈緩慢下降趨勢??紤]到纖維素酶的最佳溫度和試驗成本,選擇提取溫度為50 ℃比較適宜。當(dāng)溫度超過50 ℃,藍(lán)莓多酚含量沒有明顯的降低,因此提取溫度不作為考察因素,在響應(yīng)面試驗中固定提取溫度為50 ℃。

      圖6 提取溫度對多酚得率的影響Fig.6 Effects of temperature on the yield of polyphenols

      2.7 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

      2.7.1 響應(yīng)面設(shè)計 采用Design-Expert 8.0.6軟件,利用Box-Behnken中心設(shè)計原理,以藍(lán)莓果渣中的多酚得率作為響應(yīng)值,在單因素試驗的基礎(chǔ)上選擇對多酚含量影響較大的3個因素A(液料比)、B(pH)、C(酶用量)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計,進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計,結(jié)果如表2所示。

      表2 響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Response surface design and test results

      2.7.2 回歸方程的確定和方差分析 通過響應(yīng)面分析軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到藍(lán)莓果渣多酚得率(Y)的二次多項擬合方程:Y=8.11-0.051A+0.019B+0.21C-0.12AB+0.12AC+0.19BC-0.39A2-0.42B2-0.54C2。

      對回歸模擬進(jìn)行方差分析,由表3可知,F=165.34,P<0.000 1說明試驗中采用的回歸模擬是極其顯著的。失擬項P=0.059 0大于0.05,即失擬項是不顯著的,說明方程擬合的較好。因此,可以用該模型代替試驗實際操作對試驗結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。

      由表3可以看出,其中C(酶用量)在試驗研究過程中對多酚得率的影響是極顯著的,A(液料比)對多酚得率的影響是顯著的,只有B(pH)是不顯著的,而在交互項和二次項中的各項均是極顯著的。另外由各因素的F值大小可以看出,對響應(yīng)值多酚得率影響最大的是纖維素酶的用量,其次是料液比,最后是pH。

      表3 響應(yīng)面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of response surface test

      2.7.3 響應(yīng)面最佳工藝條件的確定 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇合適的試驗數(shù)據(jù),分析料液比(A)、pH(B)、酶用量(C)對藍(lán)莓果渣中多酚得率的影響,并作出AB、AC、BC的響應(yīng)面分析圖及等高圖。由圖7~8可以看出,藍(lán)莓果渣中多酚得率在料液比為1∶20、初始pH為4.8時達(dá)到最大值。從響應(yīng)面三維圖可以看出,料液比的曲面變化比較大,說明料液比對多酚得率的影響比pH大,這與方差分析結(jié)果相一致。由圖9~10可知,響應(yīng)面三維圖中藍(lán)莓果渣中多酚的得率隨料液比和酶用量的變化都是先增加后降低,在料液比為1∶20,酶用量為6 mg/g時,藍(lán)莓果渣中多酚的得率達(dá)到最高,分析等高線圖可以發(fā)現(xiàn),酶用量所在軸向的等高線較為密集,而料液比所在軸向的等高線較為稀疏,二者相比較,說明酶用量對多酚得率的影響更大。由圖11~12可知,響應(yīng)面三維圖中藍(lán)莓果渣中多酚的得率隨著pH和酶用量的變化都是先升高然后再降低。在初始pH為4.8,酶用量為6 mg/g時藍(lán)莓多酚得率達(dá)到最大。從等高線圖可以發(fā)現(xiàn),酶用量所在軸向的等高線更為密集,說明酶用量對多酚得率的影響較大,而pH所在軸向的等高線相對稀疏,說明pH對多酚得率的影響較小,這與方差分析的結(jié)果一致。而二者的等高線圖的形狀呈橢圓形,說明酶用量和pH之間有顯著交互作用。綜上,果渣多酚提取的最佳工藝條件是料液比為1∶19.77、pH為4.83、酶用量為6.80 mg/g,在此條件下,藍(lán)莓果渣中多酚得率達(dá)到最高,為8.130 6 mg/g。

      圖7 A與B對多酚得率影響的響應(yīng)面三維圖Fig.7 Response surface three-dimensional diagram of the effect of A and B on the yield of polyphenols

      圖8 A與B對多酚得率影響的響應(yīng)面等高線Fig.8 Response surface contour of the effect of A and B on the yield of polyphenols

      圖9 A與C對多酚得率影響的響應(yīng)面三維圖Fig.9 Response surface three-dimensional diagram of the influence of A and C on the yield of polyphenols

      圖10 A與C對多酚得率影響的響應(yīng)面等高線Fig.10 Response surface contours of the effect of A and C on the yield of polyphenols

      圖11 B與C對多酚得率影響的響應(yīng)面三維圖Fig.11 Response surface three-dimensional diagram of the effect of B and C on the yield of polyphenols

      圖12 B與C對多酚得率影響的響應(yīng)面等高線Fig.12 Response surface contours of the effect of B and C on the yield of polyphenols

      3 結(jié)論

      本研究獲得藍(lán)莓果渣中多酚最佳提取工藝(料液比為1∶19.77、pH為4.83、酶用量為6.8 mg/g),藍(lán)莓果渣多酚得率為8.130 6 mg/g。目前,提取藍(lán)莓多酚的常用方法包括有機(jī)溶劑法、超聲波輔助法、微波輔助提取法,有機(jī)溶劑法存在試劑殘留、安全隱患問題,超聲波輔助浸提和微波輔助浸提所用的設(shè)備技術(shù)和經(jīng)濟(jì)成本高,采用酶法提取的最大優(yōu)勢是反應(yīng)條件溫和,藍(lán)莓多酚在提取過程中幾乎不損失,有效成分的提取量高;同時所得產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性、活性均較高,且無污染。此外,酶法還具有縮短提取時間、降低能耗、降低生產(chǎn)成本等優(yōu)勢??紤]到實際操作過程的準(zhǔn)確性,對此工藝進(jìn)行進(jìn)一步修改,修改后的工藝條件為:液料比為1∶20,pH為4.8,酶用量為6.8 mg/g,浸提溫度為50 ℃,浸提時間為6 h。在該工藝條件下,測得藍(lán)莓果渣中多酚的得率為8.130 6 mg/g。該工藝過程操作簡單,得率較高,適合藍(lán)莓果渣多酚提取的實際生產(chǎn),可以提高藍(lán)莓副產(chǎn)物的利用率。

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