劉永杰，湯姜楊，朱麗麗，李洪林

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海市新藥設(shè)計重點實驗室, 上海 200237）

胞外5′-核苷酸酶(e5NT，又稱CD73)，由NT5E基因編碼，蛋白分子量為70 kDa，被糖基磷脂酰肌醇(GPI)固定在細(xì)胞表面[1-3]。CD73 與CD39 共同參與嘌呤能信號的調(diào)控，在嘌呤能信號通路中，三磷酸腺苷（ATP）/二磷酸腺苷（ADP）被CD39 水解為單磷酸腺苷（AMP），AMP 被CD73 水解為腺苷和磷酸，AMP轉(zhuǎn)化為腺苷在細(xì)胞外不可逆[4]。在腫瘤微環(huán)境中，CD73 的過表達與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸有關(guān)。CD73 在腫瘤細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)、調(diào)節(jié)性T (T reg)細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)、自然殺傷細(xì)胞(NK)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)的細(xì)胞表面均有表達[5]。CD73 的表達受缺氧誘導(dǎo)因子-1 (HIF-1)、TGF-β、EGFR、AKT、β-catenin等分子的調(diào)控，特別是受HIF-1[6-10]的調(diào)控尤為突出。缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個重要特征，缺氧誘導(dǎo)HIF-1 上調(diào)，進而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中CD73 的廣泛表達。放化療引起的缺氧或ATP 富集會促進CD39-CD73-腺苷信號的級聯(lián)反應(yīng)，有利于增強腫瘤細(xì)胞的增殖和功能，促進腫瘤免疫逃逸[11]。因此，CD73 被認(rèn)為是一個重要的腫瘤免疫治療潛在靶點。

由于CD73 與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及擴散之間的關(guān)系，全球眾多醫(yī)藥企業(yè)和科研單位都在積極開發(fā)靶向CD73 的單克隆抗體和小分子抑制劑。目前，代謝穩(wěn)定的核苷酸類似物是CD73 小分子抑制劑研發(fā)的主流[12]。1970 年，核苷酸類似物AMPCP (抑制常數(shù)Ki=88.4 nmol/L)首次被報道具有強效的CD73 抑制活性[13]。文獻[14-16]報道了活性更強的核酸類似物PSB-12379 (Ki=2.2 nmol/L)、PSB-12489 (Ki=0.31 nmol/L)，處于臨床研究中的CD73 抑制劑AB680 (Ki=5 pmol/L)也屬于核酸類似物[17]。雖然這類化合物具有強效的CD73 抑制活性，但是由于酸性太大，影響其成藥性。此外，一些非核苷酸類CD73抑制劑也被報道，主要包括黃酮類化合物[18]、磺胺類化合物[19]、蒽醌類化合物[20]和苯并噻嗪類化合物[21]，但這些化合物表現(xiàn)出比較弱的活性或潛在的代謝問題。2020 年文獻[22]報道了一類新型高活性、具有選擇性的CD73非核苷酸抑制劑，這類化合物因避免了CD73 核苷類抑制劑酸度大、透膜性低等缺點，從而性能得以提高。

本文對實驗室保存的876 個已經(jīng)上市的藥物開展靶向CD73 的篩選，發(fā)現(xiàn)順苯磺酸阿曲庫銨（51w89）可以抑制CD73 的酶活性，為研發(fā)CD73 小分子抑制劑提供了新的苗頭化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蛋白與細(xì)胞 CD73 蛋白由本實驗室根據(jù)文獻[2]純化得到，MDA-MB-231、MCF-7、Wi-38 細(xì)胞來源于ATCC 細(xì)胞庫。

1.1.2試劑 孔雀綠試劑盒購自BioAssaySystems（POMG-25H）；CD73siRNA 購自廣州銳博生物科技有限公司（siG000004907A）；Lipo6000轉(zhuǎn)染試劑購自Beyotime（C0526）；CD73 抗體（CD73RabbitPolyclonal antibody）購自Proteintech（12231-1-AP）；GAPDH 抗體（GAPDH Mouse mAb）購自Abclonal（AC002）；Goat-anti-MouseSecondaryantibody 購自SAB 抗體公司（L3032）；Goat-anti-RabbitSecondaryantibody 購自SAB 抗體公司（L3042）；氨基偶聯(lián)試劑盒、醋酸鈉緩沖液（pH4.5）和CM5 芯片購自GEHealthcare；RIPA裂解液購自武漢塞維爾生物科技有限公司（G2002）；BCA（BicinchoninicAcidAssary）試劑盒購自BioSharp（BL521A）；BSA 購自源葉生物（9048-46-8）；結(jié)晶紫染色液購自Beyotime（C0121）；Matrigel 基質(zhì)膠購自康寧公司（354248）；T 細(xì)胞擴增培養(yǎng)基購自Sigma 公司（S1694）；CD3/CD28 抗體購自Stemcell（10971）；IFN-γELISA檢測試劑盒購自聯(lián)科生物（EK180-48）；CD8+T 細(xì)胞磁珠分選試劑盒購自Biolegend（480011）；腺苷5′-(α,β-亞甲基)二磷酸APCP（CAS號:3768-14-7）、51w89（CAS 號：96946-42-8）以及AMP（CAS 號：130-49-4）購自Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1分子水平CD73 活性測試 將重組CD73 蛋白用測活緩沖液（1mmol/LCaCl2,1mmol/LMgCl2,200mmol/L NaCl,10mmol/LKCl,100mmol/LTris-HCl,pH=8.0）稀釋至10ng/mL，在96 孔板中加入70μLCD73 蛋白稀釋液，然后加入化合物二甲基亞砜（DMSO，體積分?jǐn)?shù)控制在0.5%），吹打均勻后室溫孵育10min，加入AMP 使其終濃度為15μmol/L，然后放至37℃烘箱中孵育30min 后，加入孔雀綠試劑置于室溫顯色30min，待顏色穩(wěn)定后使用酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，Synergy2）檢測630nm 的吸光度值。每個實驗條件設(shè)3 個復(fù)孔，使用GraphPadPrism7.0 軟件擬合化合物的IC50值。

1.2.251w89 與CD73 蛋白結(jié)合親和力的測定 采用表面等離子體共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）技術(shù)測定化合物51w89 與CD73 蛋白之間的結(jié)合親和力。SPR 實驗是在Cytiva（思拓凡）公司的BIAcore T200 儀器上進行。首先將純化后的CD73蛋白用pH 4.5 的醋酸鈉溶液稀釋至75 μg/mL，再用偶聯(lián)試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）將CD73 蛋白偶聯(lián)在CM5 芯片上，流速為10 μL/min，結(jié)合時間為600 s，最后用乙醇胺封閉，最終CD73 偶聯(lián)量約為4946 RU。偶聯(lián)完成后，利用運行緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）,2.7 mmol/L KCl, 137 mmol/L NaCl 和φ=0.005%表面活性劑P20, pH 7.4）沖洗芯片表面直至基線平穩(wěn)，之后將51w89 用運行緩沖液溶解，并且成倍稀釋成一系列濃度梯度（1.563、3.125、6.250、12.500、25.000 μmol/L），以30 μL/min 的流速，結(jié)合90 s，解離120 s。實驗結(jié)果利用BIAcore T200 Evaluation 1.0 軟件進行穩(wěn)態(tài)擬合。

1.2.3Westernblot 檢測CD73 在腫瘤細(xì)胞中的表達選取兩株人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231、MCF-7）以及一株人胚肺細(xì)胞（Wi-38）以每毫升5×104個細(xì)胞的密度鋪于6 孔板中，待密度和活力均達到90%以上時，用PBS 刮取清洗細(xì)胞并于放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液中孵育30min，離心去上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。樣品與5×loading 上樣緩沖液混勻，在100℃金屬浴中煮5min，接著對其進行10%SDS-PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，將目的條帶剪下用5%BSA封閉1h 后，用CD73 抗體孵育并置于4℃過夜。用含TBST 緩沖液（Tris-HCl,NaCl，Tween 20）清洗3 遍，于室溫下孵育二抗2h，隨后用化學(xué)發(fā)光儀曝光條帶。

1.2.4細(xì)胞水平CD73 活性測試 當(dāng)MDA-MB-231 的細(xì)胞密度達到90%、細(xì)胞活力達到95%及以上時，加入胰酶消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL無菌離心管中，在1000r/min 轉(zhuǎn)速下離心3min，棄去培養(yǎng)基，加入活性測試液（2mmol/LMgCl2，125mmol/LNaCl，1mmol/L KCl，10mmol/L葡萄糖，10mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）緩沖液,pH7.2）重懸細(xì)胞，然后在1000r/min轉(zhuǎn)速下離心3min，重復(fù)上述操作3 次。細(xì)胞計數(shù)后，用活性測試液稀釋細(xì)胞，在96 孔板中每孔加入70μL（約2500 個細(xì)胞）細(xì)胞懸液，然后加入化合物吹打均勻（DMSO 的體積分?jǐn)?shù)控制在0.5%），置于37℃烘箱中孵育10min，加入底物AMP 使其終濃度為15μmol/L，然后加入孔雀綠試劑室溫顯色30min，待顏色穩(wěn)定后使用BioTek 酶標(biāo)儀檢測630nm 處的吸光度值。每個實驗條件下設(shè)3 個復(fù)孔，使用GraphPadPrism7.0軟件擬合化合物的IC50值。

1.2.5siRNA 干擾腫瘤細(xì)胞CD73 表達 將生長狀態(tài)良好的MDA-MB-231 消化后重懸，以每孔1×105個的細(xì)胞密度均勻鋪于6 孔板中，待6 孔板中的細(xì)胞生長融匯達50%以后，將CD73 siRNA 通過Lipo6000轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231 細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后，通過Western blot 檢測CD73 表達情況。

1.2.6Transwell 實驗 設(shè)置空白組、陰性對照組（CD73-siRNA 組，敲除了CD73 的MDA-MB-231 細(xì)胞）以及加藥組（10μmol/L51w89），在Transwell 上室加入100μL 與上述對應(yīng)的細(xì)胞及化合物，細(xì)胞密度為每毫升5×104個細(xì)胞，同時在下室加入φ=10%的胎牛血清培養(yǎng)基600μL。孵育24h 后，丟棄上室細(xì)胞，通過膜向下表面遷移的細(xì)胞用甲醇室溫固定15min，結(jié)晶紫染色15min，然后用PBS 清洗上室3遍。將小室放在載玻片上，選取至少3 個不同的視野，在顯微鏡（德國Leica 公司，LeicaDMil 型）下觀察并拍照。

1.2.7細(xì)胞劃痕實驗 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞MDAMB-231 正常消化后重懸，以每孔5×105個的細(xì)胞密度均勻鋪于6 孔板中，設(shè)置對照組、51w89 組(51w89濃度分別為5、10、50μmol/L)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待6 孔板中的細(xì)胞生長融匯達到95%后，用10μL 的移液器吸頭垂直于底部劃痕，然后棄去原來的培養(yǎng)基，用PBS 漂洗3 次，洗去漂浮的細(xì)胞碎片。用無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基將51w89依次稀釋為50、10、5μmol/L，并加入到相應(yīng)的孔中，對照孔中只加入無血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基。劃痕0、12、24、36h 后，選取至少3 個不同的視野，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8ELISA 法檢測T 細(xì)胞中IFN-γ的分泌水平收集健康志愿者的外周血，用磁珠分選試劑盒分出CD8+T 細(xì)胞，將CD8+T 細(xì)胞在完全生長培養(yǎng)基（1 mmol/L 谷氨酰胺，30 IU/mL IL-2 和25 μL/mL的CD3/CD28T 細(xì)胞激活劑）中培養(yǎng)24h，然后收集細(xì)胞，重懸在不含T 細(xì)胞激活劑的細(xì)胞擴增培養(yǎng)基中。將細(xì)胞以每孔8×104個細(xì)胞（90 μL）接種于96 孔板上，加入待測化合物，以1 μmol/L 腺苷5'-(α,β-亞甲基)二磷酸（APCP）作為對照，于37 ℃孵育15 min 后，除了空白對照組外均加入終濃度為25 μmol/L的 AMP，在37 ℃，φ=5% CO2條件下孵育96 h。每個實驗條件設(shè)3 個復(fù)孔。將96 孔板于300g條件下離心10 min，取上清，用ELISA 法檢測細(xì)胞因子含量。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 51w89 抑制重組蛋白CD73 的酶活性

以100 μmol/L 的化合物濃度對本課題組的老藥庫（包含876 個已經(jīng)上市的藥物）進行初篩，可得到100 μmol/L 51w89 對重組蛋白CD73 的抑制率為93.30% (圖1(a)中紅色球)，然后設(shè)置不同濃度的51w89 測試其對CD73 的抑制活性，測得其分子水平的IC50為(13.30±0.34) μmol/L（圖1(b)）。

圖1 51w89 抑制重組蛋白CD73 的酶活性Fig.1 Inhibition activity of 51w89 against recombinant CD73

2.2 SPR 評價51w89 與重組蛋白CD73 的結(jié)合親和力

為了進一步驗證51w89 靶向結(jié)合CD73，采用SPR 技術(shù)評價51w89 與重組蛋白CD73 的結(jié)合親和力，得到其結(jié)合親和力系數(shù)（KD）為20.45 μmol/L（圖2）。

圖2 51w89 與重組CD73 蛋白結(jié)合的SPR 結(jié)果Fig.2 SPR results for the binding affinity between 51w89 and CD73

2.3 51w89 抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 中CD73 的酶活性

51w89 對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的細(xì)胞毒性?。↖C50= （71.43±1.19）μmol/L），且高表達CD73（圖3（a）），因此本文選擇MDA-MB-231 細(xì)胞用于后續(xù)細(xì)胞實驗。用孔雀綠試劑盒測試在MDA-MB-231 細(xì)胞中51w89 對CD73 的酶抑制活性，得到IC50為（17.70±0.98）μmol/L（圖3（b））。

2.4 Transwell 實驗測試51w89 抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力

將CD73 siRNA 轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231 細(xì)胞（即CD73-SiRNA 中后，通過Western blot 分析CD73 表達情況(圖4(a))，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CD73 siRNA 后，CD73 的表達量明顯降低。Transwell 實驗結(jié)果顯示，加入51w89 或siRNA下調(diào)CD73 表達后，穿膜細(xì)胞數(shù)少于對照組，即抑制了MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移(圖4(b))。

圖4 51w89 或CD73-siRNA 對MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力的抑制效果Fig.4 Inhibitory effects of 51w89 or CD73-siRNA on the migration of MDA-MB-231 cells

2.5 劃痕實驗顯示51w89 抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移能力

劃痕實驗結(jié)果如圖5 所示，在沒有添加51w89的情況下（控制組），從0～36 h，劃痕隨著時間在逐漸修復(fù)，說明MDA-MB-231 細(xì)胞進行了遷移；而添加51w89的處理組，細(xì)胞的愈合能力較對照組減弱，而且隨著51w89濃度的增加，劃痕的愈合面積隨之減小，說明MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移能力也逐漸受到抑制。該實驗結(jié)果表明51w89 抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移活性。

圖5 51w89 抑制MDA-MB-231 細(xì)胞遷移的劃痕實驗Fig.5 Inhibitory effects of 51w89 on the migration of MDA-MB-231 cells by scratch tests

2.6 51w89 可以逆轉(zhuǎn)AMP 對CD8+T 細(xì)胞的抑制作用

腺苷信號傳導(dǎo)與免疫調(diào)節(jié)息息相關(guān)，腺苷濃度過高時會產(chǎn)生免疫抑制。AMP 可被CD73 水解為腺苷和磷酸，因此CD73 是腺苷產(chǎn)生過程中的限速分子。加入25 μmol/L 的 AMP 后，CD8+T 細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子IFN-γ水平降低，而CD73 抑制劑APCP或51w89 可在一定程度上逆轉(zhuǎn)AMP 對CD8+T 細(xì)胞分泌IFN-γ的抑制作用（圖6）。

圖6 ELISA 法測定CD8+T 細(xì)胞分泌IFN-γ 的水平Fig.6 Measurements of IFN-γ secretion in CD8+T cells by ELISA

3 結(jié) 論

在腫瘤微環(huán)境中，腺苷是ATP 的代謝產(chǎn)物，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)因子。CD73 在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞上的過表達導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中腺苷的濃度升高，高濃度的腺苷抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成。CD73 是腺苷生成過程中的限速分子，因此，抗CD73 治療有望成為一種新的腫瘤免疫治療方法。

本文篩選發(fā)現(xiàn)51w89 對CD73 具有酶抑制活性，通過表面等離子體共振實驗驗證51w89 可靶向結(jié)合CD73。通過劃痕實驗、Transwell 實驗和siRNA實驗證明CD73 在腫瘤細(xì)胞遷移過程中的作用，表明51w89 可抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移能力。另外，證實51w89 可逆轉(zhuǎn)AMP 對CD8+T 細(xì)胞的抑制作用。因此，51w89 可被作為CD73 抑制劑苗頭化合物并用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及抗腫瘤研究。