丁 琳,劉 新,龔 宇,吳 芳,戴 涌,羅定強(qiáng)

陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院,西安 710065

骨折挫傷膠囊現(xiàn)收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部;處方主要由豬骨、炒黃瓜子、煅自然銅、紅花、大黃、當(dāng)歸、醋乳香、醋沒(méi)藥、血竭、土鱉蟲(chóng)組成;具有舒筋活絡(luò)、消腫散瘀、接骨止痛的作用,用于治療跌打損傷、扭腰岔氣、筋傷骨折屬于瘀血阻絡(luò)者[1]。

在2021年作為國(guó)家抽驗(yàn)品種前,該品種于2013年曾作為國(guó)家抽驗(yàn)品種,并有多個(gè)單位及學(xué)者對(duì)其進(jìn)行過(guò)質(zhì)量評(píng)價(jià),其中主要包括整體質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究[2-3],大黃、乳香、血竭、紅花、揮發(fā)油等主要成分的含量測(cè)定[4-12],溶出度和臨床應(yīng)用方面的研究[13-16],還有重金屬元素的檢測(cè)和非法染色劑添加等安全性研究[17-20]。

骨折挫傷膠囊除豬骨外,均以生藥粉投料,并且含有動(dòng)物類藥材土鱉蟲(chóng),土鱉蟲(chóng)富含揮發(fā)油、蛋白質(zhì),易受黃曲霉毒素污染[21]。按照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則真菌毒素測(cè)定指導(dǎo)原則項(xiàng)下說(shuō)明:“處方中含有易污染的藥材以及生粉投料的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的檢測(cè)”[22-23]。黃曲霉毒素是二氫呋喃香豆素的衍生物,主要是由黃曲霉寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素,它的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。其中以B1毒性最大,其毒性和致癌性也最強(qiáng),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥的毒性。2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)部分中藥飲片中黃曲霉毒素限量做出明確規(guī)定,但迄今未有標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中成藥中的黃曲霉毒素作出限度要求。目前尚無(wú)骨折挫傷膠囊中黃曲霉毒素研究的報(bào)道,有必要關(guān)注骨折挫傷膠囊中黃曲霉毒素的污染情況,以保證其用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695高效液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測(cè)器均購(gòu)自美國(guó)Waters公司;KRC光化學(xué)柱后衍生器(青島普瑞邦生物工程有限公司);BS224S電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司);AUegra X-30離心機(jī)(美國(guó)Backman公司);KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);Aflatoxin B1、B2、G1、G2免疫親和柱[月旭科技(上海)股份有限公司]。

1.2 試藥

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純),均購(gòu)自Honeywell公司;高純水由四川優(yōu)普超純科技有限公司UPH-11-10T超純水機(jī)制備;甲醇、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純,購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;吐溫 20(化學(xué)純);氯化鉀(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;自制純化水;黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液(批號(hào)為61001-202006,含B11.04 μg·mL-1、B20.38 μg·mL-1、 G11.08 μg·mL-1、G20.38 μg·mL-1,中國(guó)食品藥品檢定研究院);骨折挫傷膠囊138批,購(gòu)自a、b、c、d、e、f、g、h共8個(gè)企業(yè);土鱉蟲(chóng)3批(自行購(gòu)買1批,其余2批由廠家b、c提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Persuit 5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水(27∶12∶61)(A)-甲醇(B)梯度洗脫(洗脫梯度詳見(jiàn)表1);流速為0.8 mL·min-1;檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器;激發(fā)波長(zhǎng)λex=360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)λem=450 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣體積為10 μL。

表1 洗脫梯度程序

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液1 mL,置于100 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、3、4、5 mL分別置于10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,作為系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度

2.2.3供試品溶液的制備 取供試品約15 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入氯化鈉3 g,精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液75 mL,超聲處理(功率為500 W,頻率為40 kHz)45 min,離心5 min(轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1),精密量取上清液15 mL,置于50 mL量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,離心10 min(轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1),精密量取上清液20 mL,通過(guò)免疫親合柱,流速為3 mL·min-1,用10 mL·L-1吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液(10 mL·L-1吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液的制備:稱取氯化鈉8.0 g、磷酸氫二鈉1.2 g、磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鉀0.2 g,用900 mL水溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.1,加水稀釋至1 000 mL,得磷酸鹽緩沖溶液。取10 mL吐溫-20,加入磷酸鹽緩沖溶液稀釋至1 000 mL[24-25])20 mL洗脫,再用水20 mL洗脫,使空氣進(jìn)入柱子,將水?dāng)D出柱子,再用適量甲醇洗脫,收集洗脫液,置于2 mL量瓶中,并用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.4陰性樣品溶液的制備 選擇在黃曲霉毒素出峰位置處無(wú)干擾的陰性樣品,按2.2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

按上述色譜條件將標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL。色譜見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,陰性樣品色譜峰無(wú)干擾,對(duì)照品、供試品各峰間分離度良好。

注:A.陰性樣品色譜圖;B.對(duì)照品色譜圖;C.供試品色譜圖;a.a企業(yè)供試品色譜圖;b.b企業(yè)供試品色譜圖;c.c企業(yè)供試品色譜圖;d.d企業(yè)供試品色譜圖;e.e企業(yè)供試品色譜圖;f.f企業(yè)供試品色譜圖;g.g企業(yè)供試品色譜圖;h.h企業(yè)供試品色譜圖;1.黃曲霉毒素G2;2.黃曲霉毒素G1;3.黃曲霉毒素B2;4.黃曲霉毒素B1。

2.4 線性關(guān)系考察

將2.2.2項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL,收集色譜圖,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2線性回歸結(jié)果

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2質(zhì)量濃度分別為0.28、0.76、2.16、0.76 ng·mL-1)10 μL,按上述色譜條件重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2峰面積的RSD值分別為0.51%、0.39%、1.16%、0.43%,表明方法精密度良好。

2.6 黃曲霉毒素B1、G1重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取本品(批號(hào)20200601,e企業(yè))15 g,精密稱定,按2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,測(cè)定峰面積,計(jì)算含量。結(jié)果顯示,黃曲霉毒素B1、G1含量的RSD值分別為2.25%、2.60%,表明樣品重復(fù)性良好。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

取陰性樣品(批號(hào)200904,a企業(yè))15 g,精密稱定,分別置于編號(hào)為1～9的具塞錐形瓶中;分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2、3、4 mL各3份,分別加入編號(hào)為1～9的樣品中,按上述供試品制備方法制備供試品溶液,按擬定色譜條件測(cè)定含量,計(jì)算回收率。結(jié)果表明,本方法回收率結(jié)果滿意。結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 方法檢出限

取陰性樣品(批號(hào)200904,a企業(yè))15 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,再精密加入2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液(黃曲霉毒素B1:3.12 ng·mL-1、B2:1.14 ng·mL-1、G1:3.24 ng·mL-1、G2:1.14 ng·mL-1)2 mL,按2.2.3項(xiàng)下方法制備檢出限溶液。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢出限分別為0.42、0.16、0.43、0.16 μg·kg-1,均符合要求。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

對(duì)138批骨折挫傷膠囊和3批土鱉蟲(chóng)飲片進(jìn)行含量測(cè)定。7批骨折挫傷膠囊檢出黃曲霉毒素B1、G1,但均未超出限度,其余檢品均未檢出黃曲霉毒素。另外2批土鱉蟲(chóng)藥材檢出黃曲霉毒素B1、G1,其中1批超出限度要求。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 骨折挫傷膠囊中黃曲霉毒素含量測(cè)定結(jié)果

2.10 擬定限度及結(jié)果

2020年版《中國(guó)藥典》黃曲霉毒素限量要求:“每1 000g含黃曲霉毒素B1不得過(guò)5 μg,含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得過(guò)10 μg”。根據(jù)此要求擬定骨折挫傷膠囊限度同《中國(guó)藥典》2020年版四部要求。由以上結(jié)果可得,所有樣品中黃曲霉毒素含量均小于規(guī)定限度,符合要求。

3 討論

3.1 色譜條件的考察

流動(dòng)相分別用甲醇-乙腈-水(27∶12∶61)、甲醇-乙腈-水(27∶12∶61)(A)-甲醇(B)梯度洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)流動(dòng)相用等度洗脫時(shí)供試品溶液在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)未完全出峰,造成對(duì)隨后供試品色譜圖的干擾,而用梯度洗脫時(shí),供試品可在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)全部出峰,避免干擾,因此色譜條件選擇梯度洗脫程序。結(jié)果見(jiàn)圖2。

注:A.等度洗脫色譜圖;B.梯度洗脫色譜圖;C.水洗脫色譜圖;D.10 mL·L-1吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液-水洗脫色譜圖;a.供試品色譜圖;b.對(duì)照品色譜圖;1.黃曲霉毒素G2;2.黃曲霉毒素G1;3.黃曲霉毒素B2;4.黃曲霉毒素B1。

3.2 免疫親和柱洗脫條件的考察

分別用水20 mL、10 mL·L-1吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液10 mL和水10 mL進(jìn)行洗脫,結(jié)果顯示,用20 mL水進(jìn)行洗脫時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾,改用10 mL·L-1吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液10 mL和水10 mL進(jìn)行洗脫時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。因此免疫親和柱洗脫劑選用10 mL·L-1吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液-水。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)138批骨折挫傷膠囊檢測(cè)發(fā)現(xiàn),部分檢品中雖存在黃曲霉毒素B1和G1,但均符合要求,可確定所有樣品中的黃曲霉毒素對(duì)人體不會(huì)造成威脅。

根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》和以往檢驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)對(duì)處方進(jìn)行分析,推測(cè)黃曲霉毒素可能是由土鱉蟲(chóng)引入的。通過(guò)檢測(cè)3批土鱉蟲(chóng)結(jié)果發(fā)現(xiàn),自行購(gòu)買的土鱉蟲(chóng)中黃曲霉毒素超出了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的限度要求。該結(jié)果為樣品中黃曲霉毒素的來(lái)源提供了數(shù)據(jù)支持。另外,以上結(jié)果表明黃曲霉毒素B1、G1在飲片和樣品中存在較多,而黃曲霉毒素B1的毒性和致癌性最強(qiáng)。由此可見(jiàn),控制中藥飲片中的黃曲霉毒素是保證用藥安全的關(guān)鍵。因此,有關(guān)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)中藥材質(zhì)量、加工與儲(chǔ)存、成藥生產(chǎn)工藝及存放條件等一系列環(huán)節(jié)的重視,以更好地控制樣品中黃曲霉毒素的含量。

理論上,企業(yè)使用檢驗(yàn)合格的原料生產(chǎn)中成藥,其產(chǎn)品中的黃曲霉毒素限量應(yīng)符合要求,從而可以有效改善中成藥的安全性問(wèn)題。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分樣品中黃曲霉毒素污染情況不容樂(lè)觀,建議企業(yè)或檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)等相關(guān)部門(mén)可開(kāi)展含高風(fēng)險(xiǎn)品種的中成藥篩查工作,掌握中成藥高危品種黃曲霉毒素的含量情況,采取相應(yīng)措施保障中成藥的臨床用藥安全。