尹大川，孟凡君，張?zhí)鞚?/p>

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽(yáng) 110161）

樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolica）由于其耐寒、抗旱和速生的生長(zhǎng)特性，被引種至我國(guó)科爾沁沙地進(jìn)行防風(fēng)固沙以來(lái)，已成為我國(guó)北方荒漠化地區(qū)的主要造林樹(shù)種[1]。但是自20 世紀(jì)90 年代以來(lái)，樟子松人工固沙林開(kāi)始出現(xiàn)大面積衰退現(xiàn)象，其衰退主要表現(xiàn)在枝梢枯黃、生長(zhǎng)量減少、病蟲(chóng)害發(fā)生、繼而全株死亡且不能天然更新[2-5]。近年來(lái)，隨著全球氣候的變化，干旱日益頻發(fā)，水資源的短缺導(dǎo)致樟子松人工林的衰退加劇[6]。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞代謝過(guò)程中的活性氧（ROS）大量積累，細(xì)胞膜脂化加劇并產(chǎn)生丙二醛（MDA），進(jìn)而對(duì)植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[7-8]。為了解毒活性氧，植物會(huì)通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)植物細(xì)胞的損傷，保護(hù)膜的完整性[9]。

隨著樟子松人工林的衰弱，其病害的發(fā)生也日益嚴(yán)重，其中樟子松枯梢病是最主要的病害之一[10]。樟子松枯梢病是由松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）引起的一種典型的寄主主導(dǎo)型病害，同時(shí)也是一種發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的林木傳染性病害[11]。該病從樟子松幼苗至成林均可發(fā)病，可引起樟子松枯枝、枯針、枯梢、枯芽、根莖腐爛等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致整株枯死[12]。其病原菌可以在健樹(shù)上潛伏，待寄主生長(zhǎng)衰弱時(shí)，便會(huì)侵染寄主引起發(fā)病[13]。對(duì)于該病的防治，目前化學(xué)防治仍占主導(dǎo)地位，但在化學(xué)防治帶來(lái)良好效果的同時(shí)也造成了環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞[14]。

樟子松枯梢病的發(fā)生是寄主植物和病原菌與生態(tài)環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中寄主本身生長(zhǎng)勢(shì)降低是樟子松枯梢病發(fā)生和流行的主要誘因，而干旱脅迫往往會(huì)加重這種誘因[15]。有關(guān)干旱脅迫與枯梢病的關(guān)系已有大量研究報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植株缺水時(shí)，會(huì)更易激活病原菌并引起發(fā)病[16-17]。通過(guò)對(duì)紅松幼苗研究發(fā)現(xiàn)，未澆水的幼苗感染枯梢病的死亡率均較高，而反復(fù)澆水的幼苗受到病原菌感染的死亡率均較低，說(shuō)明病原菌在干旱條件下侵染力明顯加強(qiáng)[18-19]。但關(guān)于干旱下樟子松枯梢病的發(fā)病情況并未見(jiàn)過(guò)多研究，因此，本試驗(yàn)通過(guò)研究干旱脅迫下樟子松幼苗的生長(zhǎng)狀況、部分生理響應(yīng)以及樟子松枯梢病的發(fā)病情況，為進(jìn)一步探討干旱地區(qū)樟子松造林以及水分影響下的樟子松人工林衰退問(wèn)題提供借鑒和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樟子松種子采自遼寧省阜新市章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)。樟子松枯梢病病原菌松球殼孢菌分離自遼寧省固沙造林研究所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)樟子松人工林內(nèi)感病樟子松。

1.2 方法

種子處理：將試驗(yàn)所用的樟子松種子進(jìn)行消毒催芽。出芽后，將萌發(fā)的種子放入裝有無(wú)菌土的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待幼苗出土后，定苗至每盆3株。

病原菌培養(yǎng)與接種：將保存的枯梢病病原菌用PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行活化，待平板長(zhǎng)滿(mǎn)后用打孔器接種于PD 培養(yǎng)液內(nèi)，每300 mL 的PD 培養(yǎng)液內(nèi)放10 塊直徑5 mm 的菌塊，后放入搖床，在25 ℃，150 r·min-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)4天。搖培后拿出將菌塊打碎并放入噴壺中，待樟子松幼苗干旱處理后，將其直接噴霧接種于試驗(yàn)處理中的樟子松幼苗。接種后將幼苗放入23 ℃、光照12 h·d-1的培養(yǎng)室繼續(xù)進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)。

在出苗3個(gè)月后，選取長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定相似的苗木30盆，分為3組，每組10盆，用于樟子松干旱脅迫試驗(yàn)，此試驗(yàn)采取3 種不同的處理：對(duì)照CK（80%FWC）、中度干旱MD（40%FWC）和重度干旱HD（20%FWC）[20]。在出苗后對(duì)每組樟子松進(jìn)行相應(yīng)的處理，土壤的含水量運(yùn)用稱(chēng)重補(bǔ)水法進(jìn)行保持，即每天對(duì)每盆樟子松苗木進(jìn)行稱(chēng)重，補(bǔ)充喪失的水分以保持相應(yīng)土壤含水量穩(wěn)定。幼苗在處理兩個(gè)月后收獲并進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

另同樣選取長(zhǎng)勢(shì)相似樟子松幼苗60 株，分為3 組，每組20 盆，每盆1 株苗木。與上述同樣分為3 組處理（CK、MD和HD）并同時(shí)進(jìn)行干旱脅迫，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。干旱處理結(jié)束后用于病原菌接種試驗(yàn)。3個(gè)處理即為：CK（80%FWC）×接菌組；MD（40%FWC）×接菌組；HD（20%FWC）×接菌組。

1.2.1 樟子松干旱條件下的生存分析 出苗后選取30 株長(zhǎng)勢(shì)相似的樟子松幼苗，對(duì)其進(jìn)行不澆水處理，觀察其生存狀態(tài)并每天記錄其死亡與剩余生存的植株數(shù)，待全部死亡后，將數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并分析。

1.2.2 樟子松針葉相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 從每組處理中隨機(jī)取8 棵樟子松幼苗，每棵樟子松幼苗中隨機(jī)取8 枚針葉，每組處理24枚，共72枚針葉。隨后用去離子水沖洗干凈，從每枚針葉中部切取10 mm，將同一個(gè)處理的24段平均放入3 個(gè)試管中，每管8 段，共9 個(gè)試管，即每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。然后分別在每個(gè)試管中加入12 mL 的去離子水。另外再取3支試管，每管中加入12 mL 水作為空白對(duì)照，對(duì)每個(gè)試管進(jìn)行封口并標(biāo)號(hào)記錄。之后將試管放入搖床（150 r·min-1）中搖22 h。用電導(dǎo)儀測(cè)初始電導(dǎo)值C1和空白對(duì)照組C空白1。測(cè)完后繼續(xù)封口并放入沸水煮沸30 min，之后再放入搖床（150 r·min-1）振蕩22 h，再用電導(dǎo)儀測(cè)出最終電導(dǎo)值C2以及空白組的最終電導(dǎo)值C空白2。用式（1）算出每組相對(duì)電導(dǎo)率（REL）。

1.2.3 樟子松針葉活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取樟子松針葉、莖、主根和側(cè)根各0.1 g，按質(zhì)量體積比加入生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，10 000 r·min-1離心10 min。取上清液待測(cè)。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。過(guò)氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O.ˉ

2）采用南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取樟子松針葉、莖、主根和側(cè)根各0.5 g，用5 mL 蒸餾水研磨4 000 r·min-1離心15 min，留上清液，取上清液1 mL，用容量瓶定容到100 mL，稀釋10倍。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。MDA采用南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 樟子松針葉超氧陰離子及膜透性染色 使用氮藍(lán)四唑（NBT）染色法來(lái)表征樟子松針葉中的O2.-的積累。材料脅迫處理后,取針葉置于離心管中，加入NBT 染色液,室溫染色過(guò)夜。染色結(jié)束后,用脫色液（冰乙酸∶無(wú)水乙醇=3∶1）進(jìn)行脫色[21]。

運(yùn)用伊文思藍(lán)（Evans Blue）染色可指示膜的完整性。材料脅迫處理后,取針葉置于離心管中,加入Evans Blue染色液,室溫染色過(guò)夜。染色結(jié)束后,用脫色液（冰乙酸∶無(wú)水乙醇=3∶1）進(jìn)行脫色[22]。

1.2.5 樟子松針葉抗氧化酶活性測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）粗酶液制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取樟子松針葉、莖、主根和側(cè)根各0.1 g，液氮研磨，按質(zhì)量體積比加入pH 50 mmol·L-1冷磷酸緩沖液10 mL，4 ℃、10 000 r·min-1低溫離心20 min，上清液即為粗酶液[23]。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。SOD活性采用購(gòu)自南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）粗酶液制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取樟子松針葉、莖、主根和側(cè)根各0.1 g，液氮研磨，按質(zhì)量體積比加入pH 值7.0 的50 mmol·L-1冷磷酸緩沖液10 mL，4 ℃、10 000 r·min-1低溫離心20 min，上清液即為粗酶液[24]。采用購(gòu)自南京建成試劑盒進(jìn)行POD、CAT活性的測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 樟子松枯梢病發(fā)病率和病情指數(shù)測(cè)定 樟子松幼苗接種病原菌后，繼續(xù)進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)并每天觀察發(fā)病情況，30 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及發(fā)病指數(shù)[25]。。

表1 樟子松枯梢病發(fā)病等級(jí)劃分Table 1 Classification of the incidence of P.sylvestris var. mongolica shoot blight

1.2.7 樟子松枯梢病的發(fā)生與干旱的關(guān)系 不同干旱處理對(duì)樟子松枯梢病的影響非采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。參照李國(guó)花等[26]的隸屬函數(shù)分析方法，隸屬函數(shù)值的計(jì)算方程為：

式中：R（Xi）代表第i個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xi表示第i個(gè)指標(biāo)值；Xmin表示第i個(gè)指標(biāo)的最小值；Xmax則表示第i個(gè)指標(biāo)的最大值。根據(jù)上述公式分別計(jì)算出各處理的發(fā)病率以及病情指數(shù)的隸屬函數(shù)值，然后再取其算術(shù)平均數(shù)作為平均隸屬函數(shù)值，其數(shù)值越大，說(shuō)明該處理的綜合評(píng)價(jià)越好，越不易感染枯梢病。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），圖表制作運(yùn)用Excel 2010 和GraphPad Prism 7.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下樟子松幼苗的生存分析

樟子松在干旱下的生存曲線如圖1。在持續(xù)干旱下，樟子松幼苗在從第83天開(kāi)始陸續(xù)死亡，并在150天內(nèi)全部死亡。樟子松的生存率隨著干旱時(shí)間的增加而逐漸減小。其中，在不澆水后第100天，30棵幼苗生存率下降到63.33%。在第120 天，生存率下降到30%，并在第145 天所有植株全部死亡，生存率達(dá)到0，中位生存期為111 d?？梢钥闯?，在前82 d內(nèi)植株生長(zhǎng)勢(shì)雖然減弱，但仍存活，說(shuō)明幼苗具有一定的抗旱性。但在持續(xù)干旱條件下，樟子松自身調(diào)節(jié)達(dá)到極限，水分缺失得不到緩解，最終表現(xiàn)為植株死亡。

圖1 干旱脅迫下樟子松幼苗的生存曲線Figure 1 Survival curves of P.sylvestris var. mongolica seedlings under drought stress

2.2 干旱脅迫下樟子松幼苗的針葉相對(duì)電導(dǎo)率變化

干旱脅迫顯著增加了樟子松針葉的相對(duì)電導(dǎo)率（圖2）。由圖2可知，樟子松幼苗針葉無(wú)論是在中度干旱還是在重度干旱下，相對(duì)電導(dǎo)率均有不同程度的上升，且MD 組和HD 組與CK 組相比均有顯著差異（p＜0.05）。在試驗(yàn)結(jié)束后，MD 處理組和HD 處理組分別上升至52.23%和64.27%。與CK 組相比，MD 處理組顯著上升49.06%，HD處理組顯著上升83.42%（p＜0.05）。

圖2 不同干旱脅迫處理后樟子松幼苗針葉的相對(duì)電導(dǎo)率Figure 2 Relative electrical conductivity of needles in P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

2.3 干旱脅迫下樟子松幼苗ROS和MDA含量變化

隨著干旱脅迫程度的加劇，與對(duì)照組相比，樟子松幼苗主根、側(cè)根、莖和葉中的O2.-的含量不斷增加（圖3）。其中在中度干旱脅迫下，樟子松幼苗主根、側(cè)根、莖和針葉中的O.ˉ2的含量與對(duì)照組相比分別增加29.6%、8.81%、5.31%和21.04%，但沒(méi)有顯著差異（p＞0.05）。而在重度干旱脅迫下，與對(duì)照組相比，除了主根外，樟子松幼苗的側(cè)根、莖和葉的O.ˉ2的含量與對(duì)照組相比均有顯著差異，且分別顯著增加5%、33.17%和30.84%（p＜0.05）。

圖3 不同干旱脅迫處理后樟子松幼苗O.ˉ2含量Figure 3 O.ˉ2 content of P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

由圖4可知，干旱脅迫導(dǎo)致了樟子松幼苗各部位中H2O2含量的上升。在中度干旱脅迫下，樟子松幼苗側(cè)根的H2O2含量與對(duì)照組相比提高68.49%，且與對(duì)照組間差異顯著（p＜0.05）。而對(duì)于主根的H2O2含量與對(duì)照組相比也有所提高，但與對(duì)照組相比卻無(wú)顯著差異（p＞0.05）。在重度干旱下，樟子松幼苗的主根和側(cè)根與對(duì)照組相比均顯著增加，且分別增加57.16%和66.83%（p＜0.05）（圖4A）。在樟子松幼苗的莖中，中度干旱處理組與對(duì)照組相比有所上升，而重度干旱下卻稍有下降，但各組間均無(wú)顯著差異（圖4B）。對(duì)于樟子松幼苗針葉中的H2O2含量來(lái)說(shuō)，只有重度干旱脅迫下與對(duì)照組相比具有顯著差異，顯著提高170.23%（p＜0.05）（圖4C）。

在本研究中，樟子松幼苗主根、側(cè)根、莖和針葉的MDA 含量隨著干旱脅迫程度的增加而逐漸增加（圖5）。在中度干旱脅迫下，樟子松幼苗莖中的MDA 含量與對(duì)照組相比顯著上升，且上升48.10%（p＜0.05），而主根、側(cè)根和莖中的MDA 含量與對(duì)照組相比則無(wú)顯著差異（p＞0.05）（圖5A、圖5B 和圖5C）。在重度干旱下，與對(duì)照組相比，樟子松幼苗的主根、側(cè)根、莖和針葉中的MDA 含量均顯著上升，分別上升97.5%、85.71%、88.61%和31.25%（p＜0.05）。而與中度干旱組相比，只有主根和莖中MDA含量具有顯著差異（p＜0.05）（圖5A和圖5B）。

圖5 不同干旱脅迫處理后樟子松幼苗MDA含量Figure 5 MDAcontent of P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

2.4 干旱脅迫下樟子松幼苗的針葉組織化學(xué)染色分析

NBT 能被植物組織中的O.ˉ2氧化成藍(lán)色沉淀。在本研究中，對(duì)照組CK 幾乎沒(méi)有被染上藍(lán)色，而在MD 處理組下，樟子松針葉上已經(jīng)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。在HD 處理下，針葉上的藍(lán)色斑點(diǎn)增多且加深（圖6）。這說(shuō)明干旱脅迫的加劇也增加了對(duì)針葉中的O.ˉ2含量，這也初步表明細(xì)胞膜的氧化程度增加。自身質(zhì)膜完整性的破壞。

Evans blue 染色可以將細(xì)胞膜破損和喪失活性的細(xì)胞染成藍(lán)色，通過(guò)其染色程度來(lái)表明細(xì)胞的受損程度。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，CK 組無(wú)明顯變化，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞膜受損程度較小。隨著干旱程度的加劇，MD 組和HD 組的著色逐漸加深和變大（圖6）。說(shuō)明隨著干旱脅迫的加劇，樟子松幼苗針葉細(xì)胞膜受損程度增加。

圖6 不同干旱脅迫處理后樟子松幼苗針葉NBT和Evans blue染色結(jié)果Figure 6 NBT and Evans blue staining of P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

2.5 干旱脅迫下樟子松幼苗的抗氧化物酶活性變化

由圖7可知，隨著干旱脅迫的程度增加，植物各部位的SOD活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在重度干旱下達(dá)到最大值。就樟子松幼苗的側(cè)根與針葉而言，中度干旱處理組的SOD 活性與對(duì)照組相比均顯著上升，分別上升163.51%和112.17%(p＜0.05)。重度干旱處理組相比中度干旱處理組有顯著下降趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組，而與對(duì)照組相比卻無(wú)顯著差異(p＞0.05)(圖7A、圖7C)。對(duì)于樟子松幼苗的主根和莖而言，中度干旱脅迫處理組與重度干旱脅迫組與對(duì)照組相比均有顯著差異，中度干旱處理組SOD 活性與對(duì)照組相比顯著增加189.68%和85.59%。在重度干旱下SOD活性則稍低于中度干旱，但仍顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)(圖7A、圖7B)。

圖7 不同干旱脅迫處理對(duì)樟子松幼苗SOD活性的影響Figure 7 Effect of different drought stress treatments on SOD activity in P.sylvestris var. mongolica seedlings

隨著干旱脅迫程度的加劇，供試樟子各部位的POD活性都出現(xiàn)了不同程度的變化(圖8)。對(duì)于樟子松幼苗的主根、側(cè)根和莖而言，中度干旱脅迫下的POD 活性與對(duì)照組相比均產(chǎn)生了顯著差異，且分別上升25.05%、12.52%和19.97%(p＜0.05)。而重度干旱處理組則與對(duì)照組相比略有上升，但均無(wú)顯著差異(p＞0.05)(圖8A、圖8B)。而樟子松幼苗的針葉中的POD 活性不管在中度干旱還是在重度干旱下均與對(duì)照組相比顯著升高，且分別增加230.9%和169.74%(p＜0.05)(圖8C)。

圖8 不同干旱脅迫處理對(duì)樟子松幼苗POD活性的影響Figure 8 Effect of different drought stress treatments on POD activity in P.sylvestris var. mongolica seedlings

與對(duì)照組相比，中度干旱脅迫下的樟子松幼苗主根、側(cè)根、莖和針葉的CAT 活性均顯著升高，分別比對(duì)照組增加了30.16%、16.85%、16%和23.64%(p＜0.05)。中度干旱誘導(dǎo)樟子松幼苗各部位的CAT 加速合成，活性升高。而當(dāng)樟子松幼苗處于重度干旱下，只有供測(cè)樟子松幼苗的莖中與對(duì)照組相比具有顯著差異，顯著上升3.95%(p＜0.05)(圖9)。

圖9 不同干旱脅迫處理對(duì)樟子松幼苗CAT活性的影響Figure 9 Effect of different drought stress treatments on CAT activity in P.sylvestris var. mongolica seedlings

2.6 干旱脅迫下樟子松幼苗的發(fā)病率與病情指數(shù)

由表2可知，在接種后第30天，樟子松各處理間的發(fā)病率與病情指數(shù)存在顯著差異（p＜0.05）。從發(fā)病率來(lái)看，在CK組正常澆水的情況下，30 d植株發(fā)病率僅有26%，隨著干旱脅迫的加劇，植株的發(fā)病率逐漸上升，尤其在HD 處理下，枯梢病發(fā)病率則達(dá)到96%。同樣的，在接種后第30 天，CK 組病情指數(shù)為8，而在MD 處理和HD處理下的植株病情指數(shù)則達(dá)到24.25 和65.25，且每組之間均存在顯著差異（p＜0.05）。即干旱脅迫顯著提高了樟子松枯梢病的發(fā)病率與發(fā)病指數(shù)。

表2 樟子松枯梢病發(fā)病率與病情指數(shù)Table 2 The incidence rate and disease index of P.sylvestris var. mongolica shoot blight

2.7 干旱與樟子松枯梢病發(fā)生的隸屬函數(shù)分析

由表3 可知，CK 組的隸屬函數(shù)均值最大達(dá)到0.56，其次是MD 組和HD 組，分別為0.49 和0.46?？芍S著干旱脅迫的加劇，其隸屬函數(shù)值均值逐漸減小，即干旱對(duì)枯梢病發(fā)生的影響隨著其程度的加劇逐漸增大，干旱脅迫致使樟子松更易感染枯梢病。

表3 不同處理對(duì)樟子松枯梢病發(fā)生的綜合評(píng)價(jià)Table 3 The evaluation of the occurrence of P.sylvestris var. mongolica shoot blight by different treatments

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱脅迫對(duì)樟子松幼苗ROS和MDA含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可以促使植物細(xì)胞內(nèi)的ROS積累，同時(shí)細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)進(jìn)而產(chǎn)生MDA，使細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)失活、降低保護(hù)酶活性和破壞膜的完整性，進(jìn)而影響植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，造成膜系統(tǒng)的損傷，進(jìn)而引起代謝紊亂[8,27]。在本研究中，樟子松幼苗的主根、側(cè)根、莖和葉隨著干旱脅迫的加劇，O.ˉ2、H2O2和MDA 含量都出現(xiàn)了不同程度的升高，這與前人的研究結(jié)果一致[28-30]。其中在中度干旱下，樟子松幼苗的主根、側(cè)根和針葉中的MDA 含量與對(duì)照組相比雖有所增高，卻并無(wú)顯著差異（p＞0.05）。而在重度干旱脅迫下，各器官M(fèi)DA 含量與對(duì)照組相比均呈顯著上升（p＜0.05）。這與其他植物在干旱下的MDA 含量變化一致[31-32]。同時(shí)，隨著干旱脅迫的加劇，樟子松幼苗針葉中相對(duì)電導(dǎo)率逐漸升高，針葉NBT 和Evans blue 染色加深，這也與前人報(bào)道結(jié)果一致[33-36]。以上研究結(jié)果說(shuō)明干旱脅迫下樟子松幼苗體內(nèi)ROS 產(chǎn)生和消除平衡受到了影響，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加深。干旱脅迫對(duì)樟子松幼苗細(xì)胞產(chǎn)生了傷害，細(xì)胞膜透性變大，且在重度干旱下，植株體內(nèi)MDA含量大量積累，樟子松幼苗質(zhì)膜受到的傷害最大。而其中在中度干旱脅迫下，主根、側(cè)根和針葉中MDA含量上升幅度相對(duì)較小可能是由于此時(shí)根系和針葉通過(guò)增加脯氨酸含量以及提高抗氧化酶活性在一定程度上緩解了植株的脂膜過(guò)氧化，增加自身對(duì)水分虧缺的適應(yīng)性。

3.2 干旱脅迫對(duì)樟子松幼苗抗氧化酶活性的影響

ROS清除機(jī)制是植物對(duì)抗非生物脅迫的常見(jiàn)的防御反應(yīng)之一。SOD、POD、CAT 作為酶促系統(tǒng)中的主要酶會(huì)通過(guò)增加自身活性來(lái)提高對(duì)氧化脅迫的抗性，減少氧化損傷并保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)植物自身抗旱能力[37]。據(jù)報(bào)道，受到干旱脅迫的耐旱水稻品種葉片中的POD 活性逐漸增加[38]。紫花苜蓿的根和葉中的SOD及葉片中的POD 活性在干旱脅迫下均顯著上升[39]。研究指出，在干旱脅迫下，不同植物保護(hù)酶活性有差異，抗旱性強(qiáng)的植物的SOD、CAT、POD 活性較高，能有效清除活性氧，抑制膜脂過(guò)氧化[40]。在本研究中，樟子松幼苗主根、側(cè)根、莖和針葉中的SOD、POD、CAT 活性隨著干旱脅迫的加劇呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在中度干旱脅迫下，樟子松幼苗各器官的抗氧化酶體系的變化，說(shuō)明其在一定程度上能調(diào)動(dòng)自身膜保護(hù)酶的活性，消除活性氧，減輕膜質(zhì)過(guò)氧化，提高樟子松幼苗的抗旱性。而在重度干旱脅迫下，樟子松幼苗各器官的酶活出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明此時(shí)植株體內(nèi)的酶促系統(tǒng)遭到破壞，樟子松幼苗清除活性氧的能力被嚴(yán)重削弱。根據(jù)研究結(jié)果中不同程度干旱脅迫下不同器官抗氧化酶活性之間的增幅和差異性，也表明了抗氧化酶活性的變化因脅迫程度、供試樟子松幼苗脅迫部位不同而異。

3.3 干旱脅迫對(duì)樟子松枯梢病發(fā)生的影響

樟子松枯梢病作為典型的寄主型主導(dǎo)病害，當(dāng)寄主受到外界環(huán)境影響而生長(zhǎng)勢(shì)降低時(shí)，植株受到病原菌侵染，從而發(fā)病。而當(dāng)寄主本身生長(zhǎng)良好，抗病性強(qiáng)就不易發(fā)病[13]。水分是影響樟子松健康狀況的主要因素[41]，而干旱造成的樟子松本身的水分脅迫更加劇了枯梢病的流行與爆發(fā)[42]。本研究針對(duì)干旱脅迫與樟子松枯梢病的發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了研究。利用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原菌真菌對(duì)不同處理的樟子松進(jìn)行噴霧侵染。結(jié)果表明，中度干旱與重度干旱組植株30 d 發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，這說(shuō)明干旱脅迫顯著增加了樟子松枯梢病的發(fā)病率與病情指數(shù)，這與前人報(bào)道的結(jié)果一致[17,19,43]。這可能是由于干旱脅迫降低了植株體內(nèi)的酶活性和一些固有的抗菌物質(zhì)，增加了樟子松的質(zhì)膜透性，使植株本身的生理生化活動(dòng)受到影響，從而造成病害發(fā)生和加重。

樟子松在不同干旱脅迫下的對(duì)枯梢病抗性通過(guò)隸屬函數(shù)來(lái)綜合評(píng)價(jià)，隸屬函數(shù)是基于模糊數(shù)學(xué)原理用于表征模糊集合的數(shù)學(xué)工具[44]。隸屬函數(shù)分析是在多指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)上，對(duì)各植物特性進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)的一種分析方法，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于植株抗逆性評(píng)價(jià)[45-46]。本研究運(yùn)用模糊隸屬函數(shù)法，利用發(fā)病率和病情指數(shù)兩個(gè)指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值來(lái)綜合評(píng)價(jià)3 個(gè)處理對(duì)樟子松枯梢病發(fā)病的影響。隸屬函數(shù)值越小，植株受病原菌影響較小，其抗病性越強(qiáng)；值越大，植株受病原菌影響較大，其抗病性越弱。試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著干旱脅迫程度的加劇，其隸屬函數(shù)均值也隨之下降，由此證明干旱在影響樟子松生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)也減弱了樟子松對(duì)枯梢病的抗性。這與前人的研究結(jié)果一致[47]。究其原因，主要是由于樟子松枯梢病是一種由弱寄生菌引起的病害，干旱引起的水分脅迫降低了植株的生長(zhǎng)勢(shì)并導(dǎo)致植株抗病性降低，病原菌侵染能力加強(qiáng)，因而致使病害更易發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)樟子松幼苗活性氧積累，并導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化。而同時(shí)樟子松幼苗能通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性減輕干旱致使的氧化脅迫損傷，但在嚴(yán)重干旱脅迫下時(shí)，自由基產(chǎn)生和消除平衡徹底遭到破壞，活性氧大量積累，植株膜系統(tǒng)受損且抗氧化酶系統(tǒng)不能有效緩解，最終導(dǎo)致植株細(xì)胞加速衰老以及植物組織受損，嚴(yán)重影響了樟子松幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，并致使樟子松生長(zhǎng)衰弱。這也造成了樟子松本身對(duì)枯梢病的抗性的減弱，增加了樟子松枯梢病的發(fā)病率和病情指數(shù)，更進(jìn)一步加劇了樟子松枯梢?。ㄋネ瞬。┑陌l(fā)生。