張 洋 郭士維 舒 倩 夏 棟 涂璇 許文年,4

(1.三峽大學 生物與制藥學院,湖北 宜昌 443002;2.三峽大學 土木與建筑學院,湖北 宜昌 443002;3.三峽大學 水利與環(huán)境學院,湖北 宜昌 443002;4.水泥基生態(tài)修復技術(shù)湖北省工程研究中心,湖北 宜昌 443002)

利用植被混凝土進行邊坡生態(tài)修復,可同時滿足工程防護及邊坡綠化需求,適用于高陡、硬質(zhì)及受沖刷坡體[1],在國內(nèi)工程領域得到廣泛應用.關(guān)于植被混凝土的研究目前主要包括利用功能菌提高土壤肥力[2]、外加摻料對基材及植物的影響[3]等方面.關(guān)于利用微生物提高植被混凝土植物抗旱性研究較少.在植被混凝土護坡初期,高陡的地形會形成地表徑流,加之基材蒸散效應,易使植物處于干旱脅迫環(huán)境[4];同時在干旱半干旱地區(qū)應用時,存在年降水量少、取水難、氣候干燥、蒸發(fā)強烈等問題,使得植物由于缺水而無法良好的生長[5].近年來許多學者利用微生物的手段來提高植物抗旱性[6-7],能否將微生物技術(shù)引入邊坡修復中以對抗工程上出現(xiàn)的干旱問題是目前研究的重點.

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)作為土壤中廣泛分布的內(nèi)生菌根真菌,可與絕大多數(shù)陸生植物根系形成共生結(jié)構(gòu)[8].AMF 通過根外菌絲直接吸收土壤水分[9]、強化滲透調(diào)節(jié)能力、降低植物氧化損傷[10]、調(diào)節(jié)酶活性及誘導相關(guān)基因表達[11-12]等機制提高植物抗旱性,降低干旱對植物的造成損傷,因此出現(xiàn)越來越多關(guān)于利用AMF 提高礦區(qū)[7]、荒漠化地區(qū)[6]等干旱生態(tài)系統(tǒng)中植物的抗旱性研究.摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae,FM)、根內(nèi)根孢囊霉(Rhizophagus intraradices,RI)在多種土壤類型中廣泛分布,更容易侵染植物根系[13].有研究表明接種FM 和RI有效促進石漠化生境中白槍桿的生長和光合作用[6].

黃花決明(Cassia sulfurea Lam.)由于其根系發(fā)達,保土蓄水能力強,可作為水土保持植物在礦山、鐵路基等貧瘠條件下生長[14],常用于植被混凝土邊坡生態(tài)修復中.然而,關(guān)于干旱條件下AMF 對生長于植被混凝土中黃花決明生長、抗旱性的影響,仍是菌根技術(shù)應用的關(guān)鍵科學問題.因此,本研究通過對干旱脅迫下的黃花決明接種不同AMF菌劑,分析植被混凝土中黃花決明植株生長、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等指標的變化,并通過主成分分析法對黃花決明抗旱性進行綜合評價,篩選出最優(yōu)接種方式,為AMF運用到植被混凝土生態(tài)邊坡修復提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物:挑選外觀均勻一致黃花決明種子,使用5%NaCl O 消毒,無菌水沖洗,浸泡24 h.

供試菌種:摩西斗管囊霉(FM,編號:BGC XJ07A)和根內(nèi)根孢囊霉(RI,編號:BGC BJ09)由青島農(nóng)業(yè)大學菌根生物技術(shù)研究所提供,菌劑包含孢子(20～30個/g)、根段、菌絲和擴繁基質(zhì).

培養(yǎng)基質(zhì):植被混凝土基材按照植被混凝土生態(tài)防護技術(shù)規(guī)程要求配制[1].基質(zhì)基本養(yǎng)分狀況為:p H8.0,有機質(zhì)13.7 g/kg,全氮0.86 g/kg,全磷0.84 g/kg.

1.2 試驗設計

采用雙因素(基材水分×AMF)完全隨機試驗.按土壤含水率/田間最大持水量設置正常水分(WW,70±5%)、中度干旱(MD,50±5%)、重度干旱(SD,35±5%)3個水分梯度;單接種RI、單接種FM 和對照組CK(添加同等質(zhì)量的高溫滅菌菌劑)3種接種方式,每個處理設3個重復,共有27盆.將配置好的植被混凝土基材陽光下暴曬消毒,在75%酒精擦拭消毒后的花盆(規(guī)格:19.5 cm×16 cm×14 cm)中分兩層混合裝盆;基層約10 cm,不含黃花決明種子、AMF菌劑;面層約2 cm,含黃花決明種子、AMF 菌劑60 g(其中FM、RI各30 g,單接種時一種AMF做滅菌處理).播種后正常澆水養(yǎng)護30 d,之后開始不同程度干旱處理.用WET 水分測定儀測定基材水分,并用稱重法控制基材含水量,每2～5 d對花盆進行澆灌補水,以維持設定的水分條件.干旱30 d后進行各項指標的測定.干旱處理30 d后黃花決明狀態(tài)如圖1所示.試驗于湖北省宜昌市三峽大學土木與建筑學院前塑料溫室內(nèi)進行.

圖1 干旱30 d后植物生長狀態(tài)

1.3 指標測定

1.3.1 生長指標測定

每盆選取3株長勢相當?shù)闹仓?每個處理測定9個植株,測量株高,分離地上與地下部分,用根系掃描儀測定根長,測定完成后于105℃烘箱殺青30 min,再于75℃烘干48 h,準確稱取植株總生物量.

1.3.2 抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定

每盆選取3株長勢相當?shù)闹仓?每個處理測定9個重復,選取中上部完全伸展的葉片測量.采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性,氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性;硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量;茚三酮比色法測定脯氨酸(Pro)含量;蒽酮法測定可溶性糖(SS)含量;考馬斯亮藍染色法測定可溶性蛋白(SP)含量[15].

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示.使用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進行整理、統(tǒng)計分析.采用單因素方差分析(One-way ANOVA),不同處理下各指標內(nèi)的差異.雙因素方差(Two-way ANOVA)檢驗交互作用(α=0.05).Pearson法分析各指標間的相關(guān)性,采用主成分分析法分析不同處理下黃花決明抗旱性.使用Origin 2022繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF對干旱脅迫下黃花決明生長指標的影響

由表1可知,相同干旱程度下,接種AMF 均能夠提高黃花決明根長和總生物量,且對總生物量作用顯著,相較于CK 組,接種AMF 對黃花決明根長和總生物量分別提高7.5%～36.7%和10.6%～29.5%,其中各干旱程度下接種RI對根長和總生物量的促進作用最大,但重度干旱下對根長的作用除外,FM 促進作用大于RI.兩種接種方式下,CK 組黃花決明株高均為最大值.各干旱程度下接種AMF對株高都存在一定程度的抑制作用,其中在重度干旱下對株高的抑制程度最低,接種RI降低2.7%,接種FM 降低2.6%.

表1 干旱脅迫下接種AMF對黃花決明生長指標的影響

雙因素方差分析表明,干旱脅迫和AMF 接種方式對根長、生物量和株高均有極顯著影響,但兩者的交互作用僅對根長有顯著影響(見表2).

表2 顯著性檢驗

2.2 AMF對干旱脅迫下黃花決明抗氧化性的影響

相同干旱程度下接種AMF 顯著提高SOD 活性,與CK組相比,SOD活性在接種RI時提高97.2%、105.2%和136.5%,接種FM 時提高39.5%、25.7%和42.7%.重度干旱程度下接種FM 時CAT 活性較高于CK 組,其余組在相同干旱程度下對CAT 活性均有顯著提高,其中接種RI時CAT 活性分別提高78.9%、100.9%和111.6%,接 種FM 時CAT 活 性分別提高31.1%、31.9%和19.3%,以上結(jié)果表明接種RI對提高抗氧化酶活性作用最大.在相同接種方式下SOD 和CAT 活性隨干旱脅迫程度的加深而降低(圖2).雙因素方差分析表明,干旱脅迫和AMF接種方式對SOD 和CAT 活性有獨立的極顯著影響.

除正常水分下接種FM 組外,其它組與CK 組相比,接種AMF 均顯著降低MDA 含量.接種RI組MDA 含量分別降低18.5%、33.7%和34.3%,接種FM 組MDA 含量分別降低4.2%、21.3%和20.8%,結(jié)果表明接種RI更有利于減少葉片內(nèi)MDA 含量(如圖2所示).干旱脅迫,接種方式及干旱脅迫與接種方式的交互作用對MDA 含量均有顯著影響.

圖2 干旱脅迫下接種AMF對黃花決明抗氧化性的影響

2.3 AMF對干旱脅迫下黃花決明滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

如圖3所示,隨著干旱脅迫程度的加深,SS含量不斷增加,重度干旱下FM 組的SS 含量最高,為35.97 mg·g-1.接種RI組SS含量分別增加5.4%、41.8%和19.5%,接種FM 組SS 含量分別增加11.2%、49.5%和29.6%,結(jié)果表明干旱脅迫下接種AMF能顯著增加SS含量,且在中度干旱下接種FM效果最顯著.在正常水分下接種AMF對Pro含量的作用不顯著;在中度和重度干旱下,接種AMF 的黃花決明Pro含量顯著低于CK 組,且RI組作用效果顯著高于FM 組.SP 含量隨干旱脅迫程度的加深不斷降低,在正常水分下FM 組黃花決明SP 含量最高,為1.74 mg·g-1.各干旱脅迫下,FM 組與CK 組存在顯著差異,RI組僅在重度干旱下對葉片中SP含量存在顯著作用.雙因素方差分析表明,干旱脅迫和接種方式及兩者的交互作用對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量均具有極顯著影響.

圖3 干旱脅迫下接種AMF對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.4 不同處理方式下黃花決明的抗旱性評價

2.4.1 干旱脅迫下黃花決明生長生理指標的相關(guān)性分析

為了解黃花決明各生長生理指標間的關(guān)聯(lián)度,對生長、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等9個指標進行相關(guān)性分析,如圖4所示.

圖4 黃花決明生長、抗旱性指標相關(guān)性熱圖

發(fā)現(xiàn)大部分指標間相關(guān)性達到顯著或極顯著水平,尤其是總生物量與所有指標均顯著相關(guān),直接用這些指標進行抗旱性綜合評價,存在指標間信息重疊的問題,難以客觀評價,因此,本研究采用主成分分析法對干旱脅迫下接種AMF 對黃花決明抗旱性的影響進行綜合評價分析.

2.4.2 干旱脅迫下黃花決明生長生理指標的主成分分析

對不同處理方式下黃花決明生長生理指標進行主成分分析(PCA),提取特征值大于1的主成分特征值及方差貢獻率,解釋不同處理對黃花決明生長生理指標的影響(見表3).本研究提取2個主成分,累計貢獻率為81.5%.其中第1主成分(PC1)的貢獻率為63.7%,第2主成分(PC2)的貢獻率為17.8%.

表3 各指標主成分分析的特征值于方差貢獻率

由圖5可知,不同干旱脅迫分布區(qū)域明顯,表明干旱脅迫程度在影響黃花決明生長生理特性方面存在顯著差異.各指標因子載荷反映各指標對主成分的影響,因子載荷越大,在對應主成分中的權(quán)重也越大.與PC1相關(guān)性較大的指標有8 個,其中總生物量、CAT、SP、SOD 和株高與PC1正相關(guān),SS、Pro、MDA與PC1負相關(guān);與PC2相關(guān)性較大的指標有6個,其中SS、SOD、CAT 和根長與PC2正相關(guān),SP 和株高與PC2負相關(guān).綜上說明干旱脅迫下,可以將黃花決明生長、抗氧化酶活和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等指標作為評價黃花決明抗旱性的主要作用因子.

圖5 不同處理下黃花決明生長、抗旱性指標的主成分分析

2.4.3 黃花決明抗旱性綜合評價

根據(jù)主成分得分系數(shù)矩陣和標準化的數(shù)據(jù)分別計算出主成分1(F1)、主成分2(F2)的表達式,再以表中的主成分1、主成分2的貢獻率與累計貢獻率的比值作為權(quán)重,計算得出主成分的綜合得分F.F1、F2和F表達式如下:

根據(jù)上述公式對不同處理的黃花決明抗旱性進行綜合評價(見表4),綜合得分F值越高,黃花決明的抗旱性越強.

表4 不同處理方式下黃花決明抗旱性綜合評價

由表4得,不同處理下黃花決明抗旱性由強到弱依次為:A2>A3>B2>A1>C2>B3>B1>C3>C1.干旱脅迫下,RI組和FM 組的綜合排名均大于CK組,說明接種RI和FM 的黃花決明抗旱性高于CK組,接種AMF能夠提高黃花決明抗旱性;同時,RI組黃花決明抗旱性明顯高于FM 組,表明在植被混凝土中接種RI更有利于提高黃花決明的抗旱性.

3 討論

本試驗中,接種AMF均能增加黃花決明的根長和生物量,原因可能是接種AMF 能擴大根系接觸面積,改善根系在干旱條件下對水分的吸收,提高植物吸收N、P等養(yǎng)分含量,進而促進根長和生物量的增加[7,16].具體而言,與接種FM 相比,接種RI在促進黃花決明根長和生物量方面效果更顯著,可能是因為相較其他AMF而言,RI具有更高的土壤水分吸收效率,更能促進植物的生長[17].本試驗中接種AMF 對植物株高有一定的抑制作用,這與前人研究不同,造成這種現(xiàn)象形成的原因可能是干旱條件下AMF 在形成共生結(jié)構(gòu)時需消耗植物光合作用產(chǎn)物,從而調(diào)節(jié)植株同化物分配,致使植物通過減少地上部分株高來提升根系長度,因而株高會受到抑制[18].

干旱脅迫下植物細胞結(jié)構(gòu)因活性氧(ROS)過度累積而破壞,因而受到嚴重的氧化損傷[15].大量研究表明,接種AMF 會提高植物抗氧化酶活性,增強清除ROS的能力,從而降低ROS對植物的損傷[19-21].本試驗中,SOD 和CAT 的活性隨干旱脅迫的加深而降低;同一干旱脅迫下,接種AMF 的黃花決明SOD和CAT 活性較CK 組相比均有顯著提高.已有研究證實,AMF 通過上調(diào)干旱脅迫下植物葉片超氧化物歧化酶基因(Pt Fe-SOD,Pt Mn-SOD)和過氧化氫酶基因(PtCAT)的相對表達量,促進寄主植物抗氧化酶SOD,CAT 基因的表達[22],使菌根植物具有更強的抗氧化能力.MDA 作為植物氧化損傷產(chǎn)物,可以在干旱脅迫下指示植物受氧化損傷的程度[22].本試驗中,MDA 含量與SOD、CAT 活性負相關(guān),接種AMF后黃花決明的MDA 含量明顯低于CK 組,表明AMF能夠保護植物免受ROS損傷,其中RI的作用效果顯著高于FM,可能是由于不同種屬AMF 對植物有不同的適應性[23],RI在植被混凝土中對黃花決明的適應性大于FM.以上結(jié)果證實在干旱脅迫下AMF對寄主植物的保護作用.

應用于干旱半干旱地區(qū)的植被混凝土技術(shù),會使植物處于干旱和弱堿性脅迫的雙重作用下,因此,植物會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro、SS和SP等含量增加細胞質(zhì)濃度,提高細胞滲透壓,緩解脅迫造成的損傷[24].研究表明,接種AMF的黃花決明葉片中SS含量明顯高于未接種,說明AMF可優(yōu)化干旱環(huán)境下植物的糖代謝水平,增強植物繩頭調(diào)節(jié)能力[12,25].本試驗中SS含量隨干旱脅迫程度的加深而不斷增加,與CK 組相比,接種AMF 顯著提高SS含量.Pro是干旱脅迫下決定蛋白質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)以及清除ROS的重要游離氨基酸[26],可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)滲透勢和氧化還原反應.AMF在正常水分下對Pro作用并不明顯,在中度和重度干旱下Pro含量顯著低于CK 組,這與Wu等[27]在枳、Ahmed等[28]在金合歡上的研究結(jié)果相一致.Zou等[29]研究發(fā)現(xiàn),干旱脅迫下接種AMF 抑制植物Pro合成,同時促進Pro降解,導致Pro積累較少,但對植物的生長性能和生物量存在促進作用.由此得出結(jié)論,在植被混凝土中接種AMF植物能夠以較少的脯氨酸含量減輕干旱脅迫造成的損傷.有研究證實,干旱脅迫下接種FM 和隱類球囊霉(Paraglomus occultum)能顯著增加枳(Citrus trifoliata)葉片中蔗糖、葡萄糖、果糖的含量[27].AMF 通過miRNA下調(diào)編碼蛋白的相應靶基因,進而參與植物葉片和根組織的干旱脅迫反應[30].本實驗中,接種FM 組提高SP含量的作用效果大于RI,可能是由于植被混凝土處于弱堿性狀態(tài),FM 在弱堿性土壤中分布優(yōu)于RI[31],因此可以更好的作用于黃花決明提高SP含量.

本研究利用主成分分析法對不同AMF 接種方式對黃花決明抗旱性進行綜合評價,結(jié)果表明在不同干旱脅迫下接種RI對于提高黃花決明抗旱性效果均高于FM,該結(jié)果與田方等[32]利用AMF提高白刺花抗旱性的研究結(jié)果一致.

4 結(jié)論

干旱脅迫限制黃花決明的生長,降低葉片中抗氧化酶活性,導致氧化損傷產(chǎn)物MDA 含量升高,SS和Pro含量的積累隨干旱的加重而增加,但SP 含量有所降低.接種AMF顯著提高干旱脅迫下黃花決明的根長和總生物量,一定程度上緩解干旱脅迫對植物的抑制作用,但對株高作用不明顯;AMF在黃花決明根系上定殖后通過提高植物SOD、CAT 活性,降低MDA 含量增強抗氧化能力,同時通過增加SS和SP含量,降低Pro含量,提高植物滲透勢以此來提高黃花決明抗旱性.利用主成分分析對不同處理下黃花決明抗旱性進行綜合評價結(jié)果表明,相同干旱程度下接種AMF黃花決明抗旱性排名均為:RI>FM>CK,說明RI對黃花決明抗旱性的促進作用效果優(yōu)于FM.綜上所述,RI更適合應用于植被混凝土邊坡植被恢復中.