魏雪嬌 石松云 毛楚涵 何 婷 劉呈雄 陳劍鋒 賀海波,2 黃文峰 鄒 坤 程 凡

(1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué)),湖北 宜昌 443002;2.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,藥食同源大健康產(chǎn)品開發(fā)利用宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 宜昌 443002;3.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

睡菜(Menyanthes trifoliata L.)為龍膽科單種屬植物,又名綽菜、瞑菜.在本草典籍中首現(xiàn)于《本草綱目》,《嵇含南方草木狀》《段公路北戶錄》以及郭憲《洞冥記》中記載了睡菜的生長(zhǎng)環(huán)境及藥用價(jià)值:春夏生于池沼或田埂間,食之使人思睡,性寒,微苷,味苦[1].傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,睡菜被廣泛應(yīng)用于多類型疾病如燒傷、頭痛、腎炎、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕等的治療[2].近些年研究發(fā)現(xiàn),睡菜具有抗炎[3]、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠[4-5]藥理作用,也可以用于健脾消食、清熱利尿、潤(rùn)肺止咳、消腫、降血壓等[6-7].分析其化學(xué)成分發(fā)現(xiàn),睡菜中的化學(xué)成分豐富多樣,包括萜類、黃酮類、香豆素類以及酚酸、糖類等多種化學(xué)成分[8-9].雖然林芳等[4]對(duì)睡菜醇提物對(duì)小鼠進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)研究,得到最大耐受劑量(maximum tolerated dose,MTD)大于10 g/L,仍無法得到較為準(zhǔn)確的臨床用藥安全范圍.由于臨床主要用睡菜的水煎液,開展其毒性試驗(yàn)研究非常有必要.基于此,本實(shí)驗(yàn)將對(duì)睡菜水提液的短期口服毒性進(jìn)行研究,初步評(píng)估睡菜水提液的毒性,為睡菜安全食用、藥用提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠,雌雄各半,體重(20±2)g,購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證:SCXK(鄂)2022-0012.飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,雌雄分籠,室溫(22±2)℃,濕度(60±5)%,動(dòng)物設(shè)施使用證明:SYXK(鄂)2022-0061.

1.2 試驗(yàn)藥物準(zhǔn)備

睡菜藥材于2018年9月采自湖北省神農(nóng)架大九湖濕地,經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院王玉兵教授鑒定為龍膽科睡菜屬植物睡菜M.thestrifoliateL.的全草.植物標(biāo)本現(xiàn)保存于天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué)).

睡菜干燥全草(800 g)粉碎,用純水回流提取3次(400 m L×3),每次2 h.將水提液減壓濃縮干燥,得到睡菜水提總浸膏160 g,4℃保存?zhèn)溆?

1.3 主要試劑及儀器

生理鹽水、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).Smart-S15UVF實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司),ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門子有限公司),TP1020 自動(dòng)臺(tái)式脫水機(jī)、EG 1150 H 包埋機(jī)(德國(guó)Leica Biosystems公司),YGQ-3128D 切片機(jī)(亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司),DP260 自動(dòng)染色機(jī)(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限股份有限公司),XD30ARFL倒置熒光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠口服藥物準(zhǔn)備

稱取適量睡菜總浸膏,用生理鹽水溶解成大號(hào)灌胃針可吸取最大可溶質(zhì)量濃度1 g/m L,對(duì)浸膏及樣品前后質(zhì)量進(jìn)行稱取計(jì)算得質(zhì)量濃度為491 g/L,生藥質(zhì)量濃度為2455 g/L,4℃保存?zhèn)溆?小鼠灌胃前提前取出,稀釋至適當(dāng)濃度,并使溫度升至室溫.

2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

取昆明小鼠40只,雌雄各半,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后禁食不禁水12 h,隨機(jī)分為5組,以睡菜水提液最大可供灌胃質(zhì)量濃度(2 455 g/L)為起始質(zhì)量濃度,按組距75%遞減,即睡菜水提液以2 455、1 841.25、1 380.94、1 035.70 g/L 的藥物質(zhì)量濃度,以0.4 m L/10 g的灌胃體積,12 h分2次灌胃.灌胃后及時(shí)觀察小鼠狀態(tài)及毒性反應(yīng),若有死亡盡快解剖.末次給藥4 h后常規(guī)飼養(yǎng),連續(xù)觀察7 d.給藥0.5 h后,除了活動(dòng)稍見減少外,未見明顯毒副反應(yīng)或死亡情況,給藥第1和2天睡菜給藥組小鼠進(jìn)食量相比對(duì)照組明顯減少,第3天至第7天兩組進(jìn)食量、體重變化趨勢(shì)無顯著性差異(P>0.05),7 d后解剖發(fā)現(xiàn)臟器肉眼觀察無病變,與空白組無明顯差異.由于睡菜水提液濃度已達(dá)到可供灌胃的最大濃度,仍無法測(cè)出睡菜的半數(shù)致死量,故而采用最大耐受量方法進(jìn)行試驗(yàn).

2.3 MTD實(shí)驗(yàn)

取昆明小鼠40只,雌雄各半,隨機(jī)分兩組且雌雄分開,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,禁食不禁水12 h,以最大灌胃體積0.4 m L/10 g,給藥組以大號(hào)灌胃針可吸取最大可溶質(zhì)量濃度2 455 g/L生藥,12 h分兩次灌胃,空白組用等量生理鹽水灌胃.灌胃后2 h 內(nèi)觀測(cè)小鼠狀態(tài),若有死亡及時(shí)解剖.末次給藥4 h后恢復(fù)飲食,連續(xù)觀察14 d.

2.3.1 小鼠一般狀態(tài)觀察

觀察小鼠14 d內(nèi)活動(dòng)、飲食、體重、大小便情況,以及毛色是否順滑潔凈.觀察各組小鼠是否有毒副反應(yīng),記錄中毒反應(yīng)起始時(shí)間、反應(yīng)嚴(yán)重程度,以及逆轉(zhuǎn)或死亡情況.

2.3.2 血液生化指標(biāo)

給藥后第15天禁食12 h,摘眼球取血,室溫放置2 h,2 000 r/min冷凍離心10 min后小心吸取上清,-20℃保存?zhèn)溆?全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)、尿素(BUN)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL).

2.3.3 解剖及臟器指數(shù)測(cè)定

小鼠取血后脫頸處死,解剖,取小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸,觀察各組織色澤、形態(tài)有無異常.迅速用冷藏過的PBS清洗,剔除脂肪等多余組織后稱重,計(jì)算小鼠臟器指數(shù),臟器指數(shù)(%)=[臟器濕重(g)/體質(zhì)量(g)]×100%[10].

2.3.4 組織病理檢查

組織取出后4%多聚甲醛浸泡室溫固定24 h以上,乙醇梯度脫水,石蠟包埋,切片(厚度4μm),伊紅(HE)染色,多功能顯微鏡下檢查小鼠組織病理情況.

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 睡菜水提液對(duì)小鼠一般狀態(tài)的影響及毒性反應(yīng)

給藥后持續(xù)觀察小鼠狀態(tài),發(fā)現(xiàn)睡菜最大濃度、最大劑量給藥后無小鼠死亡情況,給藥小鼠活動(dòng)明顯減少,表現(xiàn)為蜷縮、反應(yīng)遲鈍、瞇眼抱團(tuán)睡覺,給予聲音刺激有反應(yīng),活動(dòng)狀態(tài)正常,毛色順滑.給藥第2天小鼠狀態(tài)恢復(fù)正常,與空白組無差異,見表1.

表1 最大給藥量實(shí)驗(yàn)睡菜水提液的急性毒性反應(yīng)情況(n=20)

3.2 睡菜水提液對(duì)小鼠體重變化的影響

結(jié)果顯示睡菜給藥組雌性給藥前、給藥后14 d體重與空白組雌性小鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),變化趨勢(shì)相近.睡菜給藥組雄鼠除給藥第10天與空白組雄鼠體重出現(xiàn)差異(P<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),如圖1所示.

圖1 睡菜水提液對(duì)小鼠體重變化的影響(注:*P<0.05)

3.3 睡菜水提液對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

肉眼觀察各組小鼠器官組織形態(tài),未發(fā)現(xiàn)睡菜給藥組與空白組有明顯病變異常情況.睡菜給藥各組小鼠與空白各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃組織的臟器指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表2.

表2 最大給藥量實(shí)驗(yàn)下睡菜水提液對(duì)小鼠臟器的影響)

表2 最大給藥量實(shí)驗(yàn)下睡菜水提液對(duì)小鼠臟器的影響)

3.4 睡菜水提液對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

睡菜給藥♂組小鼠的血液生化指標(biāo)ALT 與空白組相比減小,有顯著性差異(P<0.05),AST、TBIL、ALB、ALP、UREA、CREA 均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表3.

表3 最大給藥量實(shí)驗(yàn)下小鼠血液生化指標(biāo)()

表3 最大給藥量實(shí)驗(yàn)下小鼠血液生化指標(biāo)()

注:與空白組比較,*P<0.05

3.5 睡菜水提液對(duì)小鼠臟器病理形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸進(jìn)行HE 染色,睡菜給藥組心肌細(xì)胞形態(tài)正常,緊密排列,心腔內(nèi)可見較多紅細(xì)胞,無炎性反應(yīng)及病變;肝小葉、門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整清晰,細(xì)胞排列緊密,胞核大小、形態(tài)正常,部分血管可見淤血,未見明顯炎癥,無實(shí)質(zhì)性病變.

圖2 睡菜水提液對(duì)小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、小腸、胃病理形態(tài)的影響(×400)

脾臟可見被膜、白髓、紅髓、小梁結(jié)構(gòu)清晰完整,未見明顯炎癥,無實(shí)質(zhì)性病變,給藥及正常空白組小鼠白髓較多,可見少量紅細(xì)胞,各組無顯著差異,推測(cè)與飼養(yǎng)環(huán)境相關(guān);肺部上皮、管壁細(xì)胞完整,肺泡干凈,結(jié)構(gòu)清晰,無炎性滲出;腎臟無腫脹,被膜、腎小體結(jié)構(gòu)清晰完整,腎小球豐富,無明顯異常;小腸管壁完整,上皮與固有層連接緊密,未見炎癥及異常;胃壁組織結(jié)構(gòu)清晰完整,胃腺排列緊密,數(shù)量豐富,睡菜2455 g/L組小鼠未見明顯炎癥及病變.睡菜2 455 g/L給藥組雌性、雄性小鼠脾臟紅髓較少,白髓較多,與正常空白組相比,無顯著性差異.結(jié)果表明,睡菜2 455 g/L組雌雄小鼠的心臟、脾臟、肺、肝臟、腎臟、小腸及胃組織均沒有病理改變.

4 討論

近年來對(duì)睡菜的抗炎[11]、抗腫瘤[12]及神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]的藥理活性研究較多,其化學(xué)成分的分析也較為全面,萜類、黃酮類、酚酸等主要化學(xué)成分的藥理活性研究[13-14]也十分廣泛.且睡菜生命力強(qiáng),在我國(guó)生長(zhǎng)分布廣泛,黑龍江、吉林、遼寧、四川、云南、貴州、湖南等地區(qū)均有分布.具有一定的發(fā)展?jié)摿?但其安全性方面的研究報(bào)道較少.

本文采用最大給藥量實(shí)驗(yàn),對(duì)睡菜進(jìn)行急性毒性研究.結(jié)果得出,睡菜水提液的提取率在20%左右,小鼠灌胃的最大濃度2 455 g/L相當(dāng)于成人臨床劑量(15 g/70 kg體重)的100.6倍.在14 d的實(shí)驗(yàn)觀察中,小鼠均未出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)或死亡情況.以睡菜最大濃度給藥情況下,睡菜給藥組小鼠14 d內(nèi)一般狀態(tài)良好,體重及進(jìn)食量情況與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

臟器的狀態(tài)也可反映藥物對(duì)小鼠的影響,在解剖過程中,觀察睡菜給藥組小鼠的各組織器官形態(tài)、色澤無病理形態(tài)表現(xiàn),臟器指數(shù)與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

肝臟、腎臟是機(jī)體內(nèi)的主要解毒器官[15],因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)肝臟、腎臟指標(biāo)進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè),探究睡菜對(duì)小鼠肝、腎功能的影響,從而反映睡菜的毒性程度.睡菜給藥組雌性的肝功能(AST、ALT、ALP、ALB、TBIL)、腎功能(CREA、BUN)與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.睡菜給藥組雄性組的ALT 與空白組相比明顯減少且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),其他指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.ALT 與毒性程度有較高的相關(guān)性,其升高程度與肝細(xì)胞受損程度成正相關(guān),因此睡菜給藥組雄性ALT 降低不能表示該組小鼠有肝功能損傷,這與HE染色結(jié)果相符合.

綜上所述,在本實(shí)驗(yàn)條件下,睡菜灌胃給予小鼠的毒性小,最大耐受量大于2455 g/L,安全性高.本實(shí)驗(yàn)為睡菜的臨床應(yīng)用安全性提供一些科學(xué)參考,且為睡菜臨床應(yīng)用的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ).