陳瀅如,路士華,王 震,程 艷

心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是以在正常心肌組織中的細胞增殖、細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)過度堆積為主要表現(xiàn)的疾病。心肌纖維化破壞心肌結(jié)構(gòu)進而導(dǎo)致心肌紊亂,引起心臟電、機械和血管舒縮功能的不良變化,還可加劇心臟疾病事件的發(fā)生率[1]。目前心血管疾病仍是全球最常見的死亡原因[2],冠心病、主動脈瓣狹窄和高血壓是心肌纖維化最常見的病因[3],心肌纖維化可出現(xiàn)在多種心臟疾病的過程中[4]。西醫(yī)主要以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、醛固酮拮抗劑、β受體阻滯劑、他汀類等藥物治療。心肌纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“胸痹”“怔忡”等范疇,中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多途徑的治療特點。

養(yǎng)心氏片為周次清教授的臨床經(jīng)驗方,由黃芪、人參、丹參、延胡索、山楂、黨參、靈芝、葛根、當歸、淫羊藿、地黃、黃連、炙甘草13味藥物組成,具有益氣活血、行脈止痛之效。研究表明,養(yǎng)心氏片具有改善血流動力學(xué)、保護心肌、調(diào)節(jié)代謝、抗動脈粥樣硬化、改善抑郁等作用,廣泛應(yīng)用于冠心病的臨床治療且效果顯著[5],但是作用于心肌纖維化的機制研究較少。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討?zhàn)B心氏片治療心肌纖維化的潛在作用機制,并利用分子對接技術(shù)對養(yǎng)心氏片的有效活性成分和受體蛋白分子進行虛擬結(jié)合,以挖掘其作用靶點和結(jié)合位點。

1 資料與方法

1.1 養(yǎng)心氏片活性成分檢索及相關(guān)靶點篩選 通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP,https://tcmspw.com)檢索黃芪、黨參、丹參、葛根、淫羊藿、山楂、地黃、當歸、黃連、延胡索、靈芝、人參、甘草13味中藥的活性成分,由于中藥進入體內(nèi)多通過有效成分入血發(fā)揮作用,故根據(jù)口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18對活性成分信息進行初步篩選[6],以獲得活性成分及作用靶點,根據(jù)文獻報道補充預(yù)測到的活性成分的已知靶點。在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)對活性成分作用靶點進行統(tǒng)一規(guī)范。

1.2 心肌纖維化相關(guān)靶點篩選 運用基因名片數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org)、藥物遺傳學(xué)與藥物基因組學(xué)知識庫(PharmGKB,Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM,http://omim.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)及治療靶點數(shù)據(jù)庫(TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)分別以“cardiac fibrosis”或“myocardial fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索獲得心肌纖維化相關(guān)靶點。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將養(yǎng)心氏片的活性成分靶點和疾病靶點上傳至Venny圖網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集作為養(yǎng)心氏片抗心肌纖維化的共有靶點,獲得交集靶點,利用 Cytoscape 3.8.0 軟件進行可視化分析。

1.4 養(yǎng)心氏片“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)格構(gòu)建 通過軟件Cytoscape 3.8.0進行養(yǎng)心氏片“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析。圖中以“節(jié)點”表示藥物,以“邊”表示活性成分與靶點之間的關(guān)系。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 利用R語言軟件通過GO和KEGG對核心靶點進行生物學(xué)過程及作用通路分析,并將結(jié)果以條形圖、氣泡圖形式呈現(xiàn)。

1.6 關(guān)鍵靶點的分子對接驗證 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值(Degree)較高的靶點,在PDB數(shù)據(jù)庫獲取靶蛋白及配體結(jié)構(gòu),利用Pymol軟件對蛋白進行脫水,清除配體,再將處理好的蛋白利用AutoDock vina軟件進行加清等操作后轉(zhuǎn)為＊pdbqt格式,進行分子對接并計算最低結(jié)合效能,評價養(yǎng)心氏片主要活性成分與核心靶點的結(jié)合活性。

2 結(jié) 果

2.1 養(yǎng)心氏片活性成分及靶點 通過篩選并去除重復(fù)成分后獲得符合條件的活性化合物269個、中藥預(yù)測靶點4 787個。養(yǎng)心氏片各中藥化學(xué)成分及預(yù)測靶點信息見表1。

表1 養(yǎng)心氏片各中藥化學(xué)成分及預(yù)測靶點信息

2.2 心肌纖維化相關(guān)靶點 將GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank、TTD數(shù)據(jù)庫中獲得的心肌纖維化疾病相關(guān)靶點合并,并剔除重復(fù)項,最終獲得候選疾病靶點5 537個。將疾病靶點與活性成分靶點取交集獲得224個重復(fù)基因,運用Venny 2.1制作韋恩圖(見圖1)。

圖1 養(yǎng)心氏片中藥活性成分與心肌纖維化基因數(shù)據(jù)庫韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將224個疾病與活性成分靶點導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中,將數(shù)據(jù)初步篩選后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。詳見圖2、圖3。

圖2 心肌纖維化與中藥活性成分靶點交集圖

圖3 心肌纖維化與中藥活性成分靶點交集PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖分析 將養(yǎng)心氏片中13味中藥的有效成分整理編號,并篩選出共有成分,統(tǒng)一編號如“MOL000392=A1”,并將整理好的活性成分和靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中,構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4),圖中包括521個節(jié)點和5 086條邊,通過Cytoscape 3.8.0軟件中“Network Analyzer”的功能計算出不同節(jié)點的Degree值,Degree值越大,節(jié)點面積越大,表示該節(jié)點的生物功能越重要。

圖4 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 關(guān)鍵靶點基因的GO與KEGG富集分析

2.5.1 關(guān)鍵靶點基因的GO富集分析 對核心靶點進行GO分析,運用R軟件分析后獲得生物過程(biological process,BP)2 043個、細胞組分(cellular component,CC)29個、分子功能(molecular function,MF)74個。排名前10位靶點基因的GO富集分析結(jié)果詳見圖5。

圖5 養(yǎng)心氏片和心肌纖維化“交集靶點”的GO富集分析

2.5.2 關(guān)鍵靶點基因的KEGG富集分析 KEGG富集分析獲得165條結(jié)果,將富集顯著性最大的20條結(jié)果以氣泡圖輸出。詳見圖6。

2.6 分子對接分析 利用AutoDock vina軟件,選取PPI網(wǎng)絡(luò)Degree值排名前8位的蛋白與養(yǎng)心氏片作用心肌纖維化Degree值排名前8位的活性成分進行分子對接,以最低結(jié)合效能表示分子與靶點的結(jié)合性,將結(jié)果以熱圖形式展示,見圖7。靶點蛋白與藥物成分之間的結(jié)合活性度越高,結(jié)合能則越小,表示對接性越好,以≤-5.0 kJ/mol表示分子與靶點結(jié)合性較好[7]。對接結(jié)合效能最小的4個模型的相互作用見圖8。

圖7 分子對接結(jié)合熱圖

圖8 核心成分與靶點分子對接結(jié)合較好的4個結(jié)果圖

3 討 論

心肌纖維化在心血管疾病中普遍存在,心肌纖維化可引起心肌舒縮、傳導(dǎo)功能及代謝異常,并在心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,造成心力衰竭、各種心律失常等心血管疾病的發(fā)生,心肌纖維化是導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要因素之一,但其發(fā)病機制尚不清楚[8]。中醫(yī)根據(jù)辨證選方進行個體化用藥,具有副作用小、耐藥性低、能有效緩解病人臨床癥狀等優(yōu)勢[9]。因此,中醫(yī)藥在治療心肌纖維化方面隱藏著巨大潛力。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)并結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、計算機技術(shù)和醫(yī)學(xué)信息等多學(xué)科知識進行探討,正契合了中醫(yī)學(xué)整體觀和辨證論治的治療原則。

3.1 養(yǎng)心氏片關(guān)鍵靶點分析 本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的潛在作用機制,獲得養(yǎng)心氏片活性成分269個,其作用于心肌纖維化的潛在靶點4 787個;通過疾病數(shù)據(jù)庫獲得心肌纖維化相關(guān)靶點5 537個,養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化潛在靶點224個。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示,養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的靶點主要有表皮生長因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、白細胞介素-1B(IL-1B)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細胞介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1 (JUN)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤蛋白p53(TP53)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)等;結(jié)合文獻分析,其中AKT1信號傳導(dǎo)可抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及改善壓力過載引起的心臟重塑,參與心肌肥厚和重塑過程,進而改善心功能[10]。TNF是免疫中樞的調(diào)節(jié)因子,有促炎作用,研究表明腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)和腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)對組織重塑、肥大、炎癥和細胞死亡產(chǎn)生相反的作用,TNFR1激活會加劇左心室重構(gòu),而TNFR2會改善左心室重構(gòu)[11]。TP53是2個轉(zhuǎn)錄因子,在心肌損傷后TP53蛋白水平短暫降低,TP53表達或活性的潛在調(diào)節(jié)劑多存在于心肌損傷部位,包括大分子損傷、炎癥和缺氧等,其在細胞分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用[12]。EGFR是一種跨膜糖蛋白,是表皮生長因子受體家族中的一員,屬于受體酪氨酸激酶家族。EGFR作為細胞表面蛋白可與配體如表皮生長因子(EGF)結(jié)合,EGFR被激活后可再磷酸化下游蛋白,調(diào)節(jié)存活的信號通路[13]。綜上所述,養(yǎng)心氏片關(guān)鍵靶點可通過改善炎癥反應(yīng)、調(diào)控細胞的凋亡、改善心室重塑、改善心功能等不同角度來抗心肌纖維化,達到治療目的。

3.2 養(yǎng)心氏片活性成分分析 在“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析中,活性成分Degree值排名較前的活性成分為β-谷甾醇、異黃酮、芒柄花黃素、金英花堿、異鼠李素、山柰酚、槲皮素等,與疾病靶點關(guān)聯(lián)密切,可能是養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的核心活性成分。其中β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗抑郁等生物活性,其通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體/核因子激活的B細胞的κ-輕鏈(PPARγ/NF-κB)增強信號來延緩心肌損傷,以減少心肌梗死面積和心肌細胞凋亡程度[14]。槲皮素作用于一氧化氮合成酶抑制劑直接對體內(nèi)的一氧化氮發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,可減輕心肌損傷[15]。異黃酮可降低心臟病的發(fā)病率,減少血清總膽固醇濃度,抑制氧自由基產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化;還可通過介導(dǎo)一氧化氮合酶的激活促進一氧化氮生成并釋放,起到保護血管內(nèi)皮的作用;研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮富含的雌激素受體(β-ER)是異黃酮首選的結(jié)合點[16-17]。異鼠李素對過氧化氫(H2O2)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用,其以濃度依賴性方式抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細胞增殖和膠原合成,從而達到預(yù)防心肌纖維化的作用[18]。山柰酚則可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心室重構(gòu),下調(diào)心肌組織成纖維化程度[19]。以上均表明養(yǎng)心氏片有效成分可能通過抗炎、抗氧化、減少心肌內(nèi)皮細胞損傷,從而達到抗心肌纖維化的作用。

3.3 活性成分與關(guān)鍵靶點作用分析 GO分析結(jié)果顯示,在生物學(xué)過程中主要通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、對脂多糖的反應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、上皮細胞增殖、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等來調(diào)控;在細胞組分方面則有膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等核心基因富集;在分子功能上則有轉(zhuǎn)錄因子、配體激活等核心基因富集,表明養(yǎng)心氏片可能通過上述富集結(jié)果發(fā)揮作用。

KEGG富集結(jié)果表明,交集靶點主要富集在心肌纖維化晚期糖基化終末產(chǎn)物/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE/RAGE)信號通路、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號通路、TNF信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、松弛素信號通路、C型凝集素受體信號通路。這些通路可能是養(yǎng)心氏片抗心肌纖維化的主要通路。AGE/RAGE信號通路已被證明與增加的肌成纖維細胞形成和間質(zhì)纖維化獨立相關(guān),可重塑激活的心肌細胞[20]。HIF-1是維持氧平衡的重要調(diào)節(jié)因子,通過調(diào)節(jié)血管生成和血管重塑來控制氧氣的輸送,還可在代償肥大階段刺激適應(yīng)性血管生成發(fā)揮保護作用,但下調(diào)心臟微血管內(nèi)皮細胞中HIF-1表達,可抑制內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,改善心肌纖維化[21-22]。TNF信號通路可逆轉(zhuǎn)心血管結(jié)構(gòu)和功能,其中,TNF-α是TNF信號通路的一種促炎細胞因子,TNF-α中的B細胞還參與抗心肌纖維化[23]。研究表明,IL-17及相關(guān)細胞因子可導(dǎo)致間質(zhì)纖維化和微血管內(nèi)皮功能障礙,其在促心肌纖維化和不可逆左心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,充分表明其是心肌纖維化的危險因素[24]。松弛素是胰島素-松弛素超家族中的一種6 kDa肽,通過G蛋白偶聯(lián)受體、松弛素家族肽受體1進而激活多個信號通路,達到抑制心律失常、抗炎、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用[25]。除C型凝集素受體信號通路未查到相關(guān)報道外,其余文獻報道與本研究結(jié)果一致,分子對接結(jié)果也佐證了主要活性成分與關(guān)鍵靶點均具有較強的結(jié)合活性。

綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù),對養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的活性成分、作用靶點和信號通路進行闡述,結(jié)果顯示養(yǎng)心氏片抗心肌纖維化具有多靶點、多成分、多通路的作用,為臨床應(yīng)用提供依據(jù),但是上述核心靶點和通路有待進一步的動物實驗和細胞實驗驗證,為臨床實踐和基礎(chǔ)研究提供更強有力的支持。