植物促生細菌阻控小麥吸收鎘和砷的效應研究

許天宇,夏 濤,王曉菡

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學院 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東 濟南 250353

隨著我國經(jīng)濟的飛速發(fā)展,工業(yè)活動日益頻繁,農(nóng)田重金屬污染狀況加劇,耕地Cd和As污染面積呈現(xiàn)上升的態(tài)勢[1-3]。2014年全國土壤污染調(diào)查報告顯示,我國土壤污染形勢嚴峻,耕地重金屬點位超標率為19.4%,且以輕中度污染為主。重金屬As和Cd作為耕地土壤主要污染物,點位超標率分別為2.7%和7.0%[4]。耕地重(類)金屬污染破壞土壤結構,影響植物生長,造成農(nóng)作物減產(chǎn),品質(zhì)降低。此外,重金屬被植物吸收、富集,進而通過食物鏈威脅人類健康[5-6]。

小麥(Triticumaestivum)是世界主要糧食作物之一,我國是最大的小麥生產(chǎn)國和消費國。土壤重金屬通過小麥根部富集到其體內(nèi),影響小麥正常生長和發(fā)育,造成作物減產(chǎn),并危害人體健康。降低土壤Cd生物有效性、減少小麥As和Cd含量已成為國內(nèi)外研究熱點與難點之一[7-8]。原位鈍化修復技術利用鈍化材料通過對重金屬離子進行吸附沉淀、絡合、離子交換、氧化還原等作用改變重金屬的賦存形態(tài),降低其在環(huán)境中的活性、遷移性及生物可利用性,可以有效阻隔重金屬向植物體內(nèi)的轉移,在不影響作物生產(chǎn)的同時進行修復,是一種針對中輕度重(類)金屬污染土壤的安全有效修復技術。其中植物促生細菌通過成膜作用和分泌胞外聚合物等途徑,賦予植物對重金屬脅迫的抗性。同時,植物促生細菌通過增加土壤pH值、土壤有機質(zhì)含量、提高土壤酶活性等方式減少重金屬含量,改善土壤結構,從而緩解重金屬對農(nóng)作物的毒害,并且還可促進植物生長,改善土壤生態(tài)環(huán)境,環(huán)境友好,因此受到廣泛關注[9-11]。研究發(fā)現(xiàn),NeorhizobiumhuautlenseT1-17能降低辣椒根際水溶態(tài)Cd和Pb含量,從而減少果實中Cd和Pb的含量[12]。KocuriaflavaAB402和BacillusvietnamensisAB403形成生物膜,高效吸附As,減少水稻(OryzasativaIR64)對As的吸收[13]。但目前利用植物促生細菌阻控小麥吸收Cd和As的研究較少,土壤中功能基因和功能微生物的響應機制仍有待深入探討。

本研究以重(類)金屬抗性細菌RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11為實驗材料,通過盆栽試驗,研究Cd和As復合污染下菌株對小麥Cd和As含量的影響,并分析根際土壤中Cd和As的化學形態(tài)、細菌As代謝基因aioA、arsC、arsM和鐵錳氧化細菌Leptothrixspp.豐度的變化,用以闡明菌株Q2-8和Q3-11對土壤Cd和As形態(tài)分布的影響,為實現(xiàn)中輕度重金屬污染農(nóng)田土壤的“邊修復,邊生產(chǎn)”提供理論依據(jù)和有益的技術策略。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為實驗室保存菌株RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11。菌株Q2-8和Q3-11能產(chǎn)IAA(33.0 mg·L-1)和鐵載體,對As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和Cd抗性分別為20～30 mmol·L-1、300～380 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1。選用我國廣泛種植的揚麥16(TriticumaestivumL.cv.Yangmai 16)(YM 16)為供試小麥。

采集齊魯工業(yè)大學溫室基地無重(類)金屬污染的農(nóng)田耕作層土壤作為供試土壤,土壤基本理化性質(zhì)為:有機質(zhì)含量為22.3 g·kg-1,陽離子交換量為146 mmol·kg-1,有效態(tài)P含量為0.35 mg·kg-1,pH 6.85。配置Na3AsO4·12H2O和CdCl2·2.5H2O溶液加入到陰干后的土壤中,模擬Cd+As的復合污染。設置3組處理,分別為:無Cd和As污染,低濃度復合污染(1 mg·kg-1Cd+40 mg·kg-1As),高濃度復合污染(2 mg·kg-1Cd+60 mg·kg-1As)。將土壤混勻,黑暗條件下放置60 d,期間保持土壤溫度為25 ℃,濕度保持為20%。

1.2 盆栽試驗設置

揚麥16種子經(jīng)過表面消毒處理后進行萌芽,選擇長勢一致種苗移栽至裝有5 kg土壤的盆中,每盆6株。每隔一天補充去離子水,保持土壤濕潤,每盆澆水量一致。生長15 d后分別按1%(108cfu mL-1)接種菌株Q2-8或Q3-11,以不接菌作為對照(CK)。每組三個重復處理。培養(yǎng)65 d后,收集分蘗期小麥。

1.3 植物樣品分析

1.3.1 小麥生物量測定

小麥采收后,分成地上和根兩部分并清洗干凈,根部浸泡于0.01 mol/L EDTA-2Na溶液中10 min,去除表面殘存的重金屬離子,去離子水充分沖洗干凈。樣品置于烘箱105 ℃殺青半小時,再80 ℃烘干至恒重,稱量地上部和根部干重。

1.3.2 小麥中Cd和As含量測定

取烘干至恒重的小麥種子研磨,研磨后的樣品置于消解管,以硝酸-高氯酸消解法進行消解,用5% HNO3定容。使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)(Optima 2100 DV,PerkinElmer,USA)測定小麥根、莖葉中Cd含量[14],采用氫化物原子熒光法(HG-AFS)(JiTian SA-20D,China)測定As含量[15]。

1.4 小麥根際土壤樣品分析

1.4.1 Cd和As的形態(tài)及提取方法

這與Nakahara（2012）的（27）式相對應，但在弱衰減的近似計算中，格林函數(shù)要展開到κ／k的一次項為止，而且要取0次貝塞爾函數(shù)與一次紐曼函數(shù)參數(shù)設為零時的極限。利用以上算法，當只剩下κ／k的一次項后，由（20）可導出：

使用Tessier分級提取法稍作修改對土壤中Cd形態(tài)進行分級提取[16]。具體提取方法見表1。

表1 土壤Cd分級提取步驟

每級提取完成后,用去離子水充分洗滌殘留物,在5 000 r/min條件下離心15 min。將上述上清液經(jīng)過濾后與提取液進行混合,測定Cd的含量。如表1所示,第一步得到的是金屬可交換態(tài)Cd;第二步提取后,得到的為碳酸鹽結合態(tài)Cd;第三步獲得的是鐵錳氧化物結合態(tài)Cd;第四步為有機結合態(tài)Cd。

土壤中As的分級提取采用Wenzel等的方法[17]。具體提取方法和步驟見表2。

表2 Wenzel法提取步驟

用0.05 mol/L NaCl清洗上一級的提取物,5 000 r/min離心15 min,將上清液與相對應的提取液混合,測定As含量。根據(jù)提取順序,土壤中As的形態(tài)分別為非專性吸附態(tài)As、專性吸附態(tài)As、無定型鐵鋁氧化物結合態(tài)As和晶質(zhì)合鐵鋁氧化物結合態(tài)As。

1.4.2 細菌As代謝基因相對豐度分析

稱取0.5 g土壤樣品,按照E.Z.N.A.? Soil DNA Kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.) 所提供的操作步驟,提取土壤細菌的總DNA。PCR擴增土壤中細菌代謝As相關基因aioA、arsC和arsM,所使用的引物和退火溫度如表3[18]。采用QuantStudioTM7熒光定量PCR儀(Life Technologies Inc.,Carlsbad,CA,USA)檢測aioA、arsC和arsM的相對豐度。

表3 aioA,arsC,arsM和細菌16S rRNA基因引物序列

1.4.3Leptothrixspp.相對豐度分析

參照Burger等[19]的方法測定Leptothrixspp.相對豐度,所用引物為PSP-6:5’-CAGTAGTGGGGGATAGCC-3’,DSP-6:5’-GATTTCTTCCCTGACAAAAGC-3’。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,各處理差異顯著性分析使用最小顯著性差異法(LSD)分析(p<0.05),使用Microsoft Office 2016軟件制表、作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株對小麥生長的影響

從圖1可以看出,菌株Q2-8和Q3-11在無重金屬污染的情況下可以促進分蘗期揚麥16的生長。與不接菌對照相比,接種菌株Q2-8和Q3-11在低濃度(1 mg·kg-1Cd+40 mg·kg-1As)和高濃度(2 mg·kg-1Cd+60 mg·kg-1As)Cd+As復合污染下都顯著(p<0.05)提高了小麥根部和地上部的生物量,其中根部生物量提升了21%～37%,地上部提升了19%～32%。上述結果表明,在中、低濃度重(類)金屬脅迫下,接種菌株Q2-8和Q3-11能夠促進分蘗期小麥的生長發(fā)育,有效緩解重(類)金屬對植物的損傷,這些菌株具有植物促生菌的特性。

圖1 接菌處理對小麥組織生物量的影響(*,p<0.05)

2.2 菌株對小麥As和Cd含量的影響

由圖2可知,在Cd+As復合污染下,小麥根和莖積累了高濃度的Cd和As,且根部重金屬含量大于莖部的含量。重(類)金屬濃度越高,小麥體內(nèi)所積累的As和Cd含量也越高。在高濃度Cd+As復合污染處理下,與不接菌的對照相比,接種菌株Q2-8和Q3-11的處理,其小麥根部和地上部Cd含量顯著(p<0.05)降低了21%～30%和28%～35%,小麥根部和地上部As含量顯著(p<0.05)降低了29%～35%和25%～38%。研究結果表明,接菌處理可以阻隔分蘗期小麥對Cd和As的吸收。

圖2 接菌處理對小麥組織Cd和As含量的影響(*,p<0.05)

2.3 菌株對小麥根際土壤As和Cd形態(tài)分布的影響

重金屬元素在土壤中的形態(tài)直接影響其生物有效性,其中可交換態(tài)及碳酸鹽結合態(tài)重(類)金屬水溶性強,易遷移,可以通過根部富集在植物體內(nèi),危害生態(tài)環(huán)境。而土壤鐵錳氧化態(tài)和有機結合態(tài)較為穩(wěn)定,不容易被生物體吸收。因此,研究重(類)金屬在土壤中的賦存形態(tài)對于土壤的生態(tài)修復具有重要意義。重金屬Cd在土壤中的主要存在形態(tài)為有效態(tài)Cd,鐵錳氧化態(tài)Cd含量次之。重金屬As在土壤中的賦存形態(tài)以含量計依次為,結晶水合鐵鋁氧化物結合態(tài)As、專性吸附態(tài)As、弱結晶水合鐵鋁氧化物結合態(tài)A、非專性吸附態(tài)As。研究發(fā)現(xiàn),在Cd和As污染條件下,與不接菌對照相比,接種菌株Q2-8和Q3-11的小麥根際土壤中有效態(tài)Cd和As含量顯著(p<0.05)降低,其中土壤有效態(tài)Cd下降了20%～22%,有效態(tài)As下降了22%～27%。同時,根際土壤鐵錳氧化態(tài)Cd和專性吸附態(tài)As含量顯著(p<0.05)上升,分別為34%～46%和38%～39%。

表4 接菌處理對小麥根際土壤中Cd和As形態(tài)分布的影響(*,p<0.05)

2.4 菌株對小麥根際土壤中細菌As代謝基因相對豐度的影響

對小麥根際土壤中細菌As(Ⅲ)氧化酶基因aioA、As(Ⅴ)還原酶基因arsC和As(Ⅲ)的S-腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶基因arsM的相對豐度進行了測定和分析。細菌16S rRNA的基因檢測效率為93.3%,而aioA、arsC和arsM基因檢測效率分別為93.2%,99.2%和100.4%。由圖3可知,aioA基因相對豐度最高,arsM基因相對豐度最低。與不接菌對照相比,接菌處理的As(Ⅲ)氧化酶基因aioA相對豐度無顯著變化。低濃度Cd+As復合污染下,與不接菌對照相比,接種菌株Q2-8和Q3-11處理的arsM基因的相對豐度呈現(xiàn)顯著的上升趨勢。而在高濃度Cd+As復合污染條件下,與不接菌對照相比,接種菌株Q2-8和Q3-11顯著(p<0.05)促進了arsC和arsM基因的上調(diào)。由此推測,接種菌株Q2-8和Q3-11可能促使As的形態(tài)發(fā)生轉化,轉化為生物毒性較低的價態(tài),從而降低了重金屬土壤中有效態(tài)As的含量。

圖3 小麥根際土壤aioA,arsC和arsM基因相對豐度(*,p<0.05)

2.5菌株對小麥根際土壤中Leptothrix spp.相對豐度的影響

Leptothrixspp.16S rRNA基因檢測效率為102.5%。Cd+As復合污染沒有顯著影響Leptothrixspp.相對豐度。與不接菌對照相比,在低濃度Cd+As復合脅迫下,菌株Q3-11顯著(p<0.05)提高了Leptothrixspp.的相對豐度;而在高濃度Cd+As復合污染脅迫條件下,接種菌株Q2-8和Q3-11顯著(p<0.05)提高了Leptothrixspp.的相對豐度。上述結果表明,菌株Q2-8和Q3-11處理通過改變重金屬離子賦存形態(tài),提升土壤中鐵錳氧化物的含量,以加速結合重金屬的能力,從而降低重金屬的遷移性。

圖4 小麥根際土壤Leptothrix spp.相對豐度(*,p<0.05)

土壤中的重(類)金屬通過農(nóng)作物吸附、絡合等作用富集在作物體內(nèi),嚴重威脅食品安全和人體健康。植物促生細菌對促進作物生長和阻隔重(類)金屬轉移有重要影響,是重(類)金屬污染農(nóng)田修復的研究熱點[20-21]。本研究以功能菌株RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11為實驗材料,研究其對生長于Cd和As復合污染土壤的分蘗期揚麥16 Cd和As含量的影響。結果表明,在高濃度(2 mg·kg-1Cd+60 mg·kg-1As)Cd+As復合污染下,菌株Q2-8和Q3-11能顯著降低揚麥16中Cd和As的含量。類似的,已有研究證明植物促生細菌能夠通過分泌胞外多糖聚合物吸附、沉淀重金屬,降低作物體內(nèi)重(類)金屬含量,提高作物品質(zhì)。如Comamonastestosteroni降低了小白菜根際土壤中Ni和Cd的含量,Chryseobacteriumsp.BH1能提高甜高粱地上和地下部分的生物量[22-23]。這些結果均表明,植物促生細菌在土壤重金屬修復和促進植物生長等方面的主要作用。

土壤環(huán)境中As的形態(tài)變化和其生物有效性密切相關,不同形態(tài)的As表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性、遷移性和毒性。土壤微生物通過一系列的氧化、還原和甲基化作用影響As的賦存形態(tài),在As的形態(tài)轉化中發(fā)揮重要作用[18,24]并影響其生物有效性。研究發(fā)現(xiàn),與細菌As代謝相關的基因主要有As(Ⅲ)氧化基因aio(曾命名為aox/aso/aro)、As(Ⅴ)還原基因ars和As(Ⅲ)甲基化基因arsM[25]。研究發(fā)現(xiàn),As(Ⅲ)氧化酶基因aioA在氧化性的土壤中,能夠促使高毒性As(Ⅲ)氧化為低毒和生物利用性較低的As(Ⅴ)。由于As(Ⅴ)本身是陰離子,容易被土壤中的鐵礦石等金屬氧化物吸附,降低了水溶性砷的含量,因此降低了As的遷移性和生物有效性[26-27]。細菌arsC基因編碼As(Ⅴ)還原酶發(fā)現(xiàn)有兩種抵御As脅迫的機制[28],在有氧條件下,進入細胞質(zhì)的As(Ⅴ)被還原為As(Ⅲ),一方面將As(Ⅲ)直接排出體外,另一方面通過加速As(Ⅲ)與巰基化合物的結合而解毒。本試驗采用qPCR技術,對分蘗期揚麥16根際土壤細菌aioAarsC和arsM進行表達水平的測定與分析。結果表明,aioA相對豐度和多樣性顯著高于arsC和arsM,功能菌株Q2-8和Q3-11能夠誘導根際土壤中As(Ⅲ)氧化細菌的形成,說明根際土壤細菌具有較高的As(Ⅲ)氧化能力。雖然在菌株Q2-8和Q3-11中未檢測到arsC的表達,但在Cd+As復合脅迫條件下,菌株Q2-8和Q3-11顯著提高了土壤中arsC的相對豐度,說明接菌處理可有效促進As(Ⅴ)還原細菌的產(chǎn)生,提升了生物體對As的外排能力,提高了其環(huán)境適應能力。同時,細菌將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)排除體內(nèi),并通過后續(xù)的甲基化反應揮發(fā),從而增加了植物抗As的脅迫能力。

在兩株功能菌株中并沒有發(fā)現(xiàn)arsM的顯著表達,但接菌處理提高了根際土壤中arsM的相對豐度,說明菌株Q2-8和Q3-11能夠提升含arsM基因細菌的相對豐度,增強土壤細菌潛在的As(Ⅲ)甲基化能力。在一定條件下,細菌利用轉甲基酶催化土壤中重金屬As發(fā)生甲基化反應,將As(Ⅲ)轉化為甲基砷、二甲基砷和三甲基砷等可揮發(fā)性的含砷化合物,這些化合物釋放至大氣圈層中,從而減輕了重金屬As在土壤中的毒害[23]。以上結果表明,接菌處理能顯著上調(diào)As代謝相關基因,通過氧化還原反應和去甲基反應影響As的賦存形態(tài),降低了As在土壤中的生物有效態(tài)和遷移性,減少了小麥對As的吸收,達到了綠色修復的目的。

Leptothrixspp.是一種好氧嗜中性鐵氧化細菌,在水體和土壤中廣泛分布。Leptothrixspp.不僅可以產(chǎn)生鐵錳氧化物并停留在細菌表面,這種氧化物通過絡合作用與土壤環(huán)境中的重金屬離子結合,達到去除重金屬離子生物毒性的目的。同時,Leptothrixspp.具有很強的氧化性,可以將可溶于水的二價錳離子氧化為穩(wěn)定的四價錳離子,以減輕金屬離子的毒害[29]。本研究發(fā)現(xiàn),在高濃度Cd和As復合污染條件下,功能菌株Q2-8和Q3-11能夠顯著提升根際土壤微生物Leptothrixspp.的相對豐度。在功能菌株的富集作用下,好氧嗜中性鐵氧化細菌將亞鐵離子氧化為三價鐵離子,促進土壤中鐵錳氧化物的產(chǎn)生,有利于改善土壤菌落結構。沉積的鐵錳氧化物通過提升細菌周圍土壤環(huán)境的pH值和提升對于重金屬Cd和As的吸附能力,可以有效控制重金屬離子的遷移和富集。通過研究小麥根際土壤中Cd和As賦存形態(tài),發(fā)現(xiàn)菌株Q2-8和Q3-11能顯著降低小麥根際土壤有效態(tài)Cd和As的含量,顯著提高根際土壤鐵錳氧化態(tài)Cd和專性吸附態(tài)As的含量。而鐵錳氧化物表面可發(fā)生As(Ⅲ)的氧化,從而加強對As的固定作用[30-31]。

3 結 論

(1)Cd+As復合污染下,功能菌株RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11可降低分蘗期揚麥16中Cd和As的含量。

(2)菌株Q2-8和Q3-11可降低小麥根際土壤有效態(tài)Cd和As的含量,并提高根際土壤鐵錳氧化態(tài)Cd和專性吸附態(tài)As的含量。

(3)菌株Q2-8和Q3-11通過提高根際土壤中細菌As還原基因arsC和甲基轉移酶基因arsM的相對豐度,以及提高鐵錳氧化細菌Leptothrixspp.的相對豐度,影響土壤中Cd和As的形態(tài)分布,降低有效態(tài)Cd和As的含量。