孫立權(quán)，滕茂浩，叢勇，羅愛(ài)芹

（1.北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081；2.北京理工大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程公共實(shí)驗(yàn)中心，北京 100081）

柴胡藥用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，在中國(guó)應(yīng)用歷史悠久，是常用中藥材之一.柴胡味辛、苦，性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有解表和里、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣的功效，臨床常用于治療久病發(fā)熱、陽(yáng)虛潮熱、感冒高熱、黃疸肝炎、月經(jīng)不調(diào)等疾病[1].《中華人民共和國(guó)藥典》收載北柴胡Bupleurum chinense DC.和狹葉柴胡B.scorzonerifolium Willd 的干燥根為中藥柴胡的植物來(lái)源[2].柴胡中的主要有效成分為柴胡皂苷、揮發(fā)油、和多糖等物質(zhì)[3].

通常，提取揮發(fā)油后的柴胡藥材作為藥渣廢物處理.最近研究發(fā)現(xiàn)作為廢物的柴胡藥渣中仍然含有大量的柴胡皂苷[4]，該藥渣仍具有較高的利用價(jià)值，這為柴胡藥材的充分利用提出了新課題.本實(shí)驗(yàn)以水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油后的柴胡藥渣為研究對(duì)象，深入探索了柴胡藥材的綜合利用工藝.由于微波輔助提取法與溶劑提取法、超聲輔助萃取法、超臨界流體萃取法等相比效率更高、提取時(shí)間更短，設(shè)備操作更簡(jiǎn)單，適用范圍更廣泛；因此，本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助常壓加熱回流提取柴胡皂苷，研究了甲醇體積百分比、微波提取時(shí)間、微波提取溫度、料液比與提取率的關(guān)系，并用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝參數(shù)[5-6]，確定了最佳提取工藝條件，進(jìn)而為中藥提取提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

柴胡皂苷的分析檢測(cè)在2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》中以柴胡皂苷a 和d 為主[2].也有文獻(xiàn)報(bào)道，柴胡皂苷a 與b1、柴胡皂苷d 與b2能夠在加熱提取過(guò)程中出現(xiàn)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[7]，因此，本研究把柴胡皂苷a、b1、b2和d 作為提取皂苷指標(biāo)，其中柴胡皂苷b1的量非常少，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響極小，最終以柴胡皂苷a、b2、d 作為定量指標(biāo).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

BRAVE 高效液相色譜儀（常州磐諾儀器有限公司）；臺(tái)式連續(xù)投料粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；MAS-3 微波反應(yīng)器（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器制造有限公司）.

柴胡藥材由河南利欣制藥有限公司提供，經(jīng)北京理工大學(xué)生命學(xué)院李玉娟教授鑒定為北柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根；柴胡藥渣為提取柴胡揮發(fā)油之后的剩余渣料，也由河南利欣制藥有限公司提供；柴胡皂苷a、b2、d 對(duì)照品購(gòu)自成都德斯特生物（HPLC 純度>98%），甲醇(分析純)購(gòu)自北京市通廣精細(xì)化工公司，乙腈(色譜純)購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司；超純水為自制.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC 色譜條件

Welch ultimate HPLC XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和水（B），梯度洗脫（0～15 min：30%→40%A，15～25 min：40%→50%A，25～35 min：50%→100%A，35～38 min：100%A，38～42 min：100%→30%A，42～45 min：30%A）；每次進(jìn)樣前平衡10 min；流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL，柱溫為30 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm.

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定對(duì)照品柴胡皂苷a 為 7.8 mg、柴胡皂苷b2為6.0 mg、柴胡皂苷d 為7.8 mg、用 50%甲醇水溶液超聲使其溶解，置于10 ml 容量瓶中，并補(bǔ)足至刻度線，即得對(duì)照品溶液.對(duì)其進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組分在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見(jiàn)表1.

表1 對(duì)照品曲線方程Tab.1 Reference curve equation

1.2.3 樣品溶液的制備

精密稱取柴胡藥渣粉末（過(guò)4 號(hào)篩）1.00 g，置于250 mL 具塞兩口圓底燒瓶中，加入一定體積比的甲醇水溶液適量，將其放入微波加熱器中，設(shè)置微波提取時(shí)間和溫度，常壓提取.提取完畢后，趁熱過(guò)濾，用甲醇洗滌抽濾瓶，補(bǔ)足體積，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，用HPLC 檢測(cè).

1.2.4 總皂苷的定量方法

將樣品溶液進(jìn)行HPLC 分析，得到色譜圖，將對(duì)相應(yīng)的柴胡皂苷a、b2、d 的峰面積帶入對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算相應(yīng)的濃度c；

柴胡皂苷提取量=c×提取液的體積；

總柴胡皂苷提取量=柴胡皂苷a 提取量+柴胡皂苷b2提取量+柴胡皂苷d 提取量；

總柴胡皂苷得率=(總柴胡皂苷提取量/柴胡藥渣樣品量)×100%.

1.2.5 單因素提取實(shí)驗(yàn)

選擇柴胡皂苷提取過(guò)程中的4 個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).參數(shù)分別選擇：甲醇體積百分比（50%、60%、70%、80%、90%）、微波提取溫度（50 °C、60 °C、70 °C、80 °C、90 °C）、微 波 提 取 時(shí) 間（10、20、30、40、50 min）、料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL）.甲醇水溶液的沸點(diǎn)隨著甲醇體積百分比的升高而逐漸降低，在甲醇體積百分比為80%甲醇水時(shí)沸點(diǎn)為70 °C，且兩者之間不共沸，在常壓下的設(shè)定溫度范圍內(nèi)宜采用回流提取.以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供數(shù)據(jù).

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以微波提取溫度、料液比、提取時(shí)間、甲醇體積百分比設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，每個(gè)影響因素選取三個(gè)水平分別為微波提取溫度：60 °C、70 °C、80 °C，料液比：1∶50、1∶60、1∶70 g/mL，提取時(shí)間：20、30、40 min，甲醇體積百分比50%、60%、70%，用-1、0、1 表示，通過(guò)回歸方程擬合分析最佳提取條件.實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2.

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)影響因素和水平Tab.2 Influencing factors and levels of BBD experimental design

1.3 方法學(xué)考察

采用加樣回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)HPLC 檢測(cè)方法進(jìn)行考察.精密稱取已知含量的柴胡藥渣粉末樣品9 份，每份1.00 g，按照“1.2.2”下樣品溶液提取方法，采用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取工藝進(jìn)行提取，每組精密加入柴胡皂苷a、b2、d 對(duì)照品的量，計(jì)算每組中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d 的加樣回收率及其RSD.

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 13.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，采用Microsoft Excel 和Design-Expert 13.0 作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

采用微波輔助加熱回流的方式，以甲醇水作為提取溶劑，以柴胡皂苷a、b2、d 總和為指標(biāo)，進(jìn)行單因素考察.分析了不同甲醇體積百分比、微波提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)柴胡皂苷提取率的影響.

2.1.1 甲醇體積百分比對(duì)提取率的影響

在微波提取時(shí)間為40 min、提取溫度為70 °C、料液比為1∶60 g/mL 的條件下，甲醇體積百分比從50%增加到90%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)甲醇體積百分比從50%升高到70%時(shí)，隨著甲醇體積百分比的提高皂苷提取率增加；當(dāng)甲醇體積百分比超過(guò)70%以后，皂苷提取率隨著甲醇體積百分比提高而下降；提取液的沸點(diǎn)隨著甲醇體積百分比的改變而改變，在常壓70 °C 下濃度為70%、80%、90%的甲醇水溶液已經(jīng)沸騰，而50%、60%濃度的甲醇溶液還沒(méi)有沸騰，因此提取效果不佳；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在70%甲醇水體積百分比下的皂苷提取率最大，因此選擇70%的甲醇體積百分比.

2.1.2 微波提取溫度對(duì)提取率的影響

在甲醇體積百分比為70%、料液比為1:60g/mL、微波提取時(shí)間為40 min 的條件下，微波提取溫度從50 °C 上升到90 °C.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度從50 °C上升到70 °C 時(shí)，隨著微波提取溫度的上升皂苷提取率上升，當(dāng)溫度高于70 °C 之后，隨著微波提取溫度的上升皂苷提取率開(kāi)始下降.溫度作為影響滲透的一個(gè)重要參數(shù)，它影響細(xì)胞膜的滲透性，使溶質(zhì)通過(guò)失去選擇性而滲透.隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)了皂苷的提取；而在70 °C 之后隨著溫度的升高會(huì)導(dǎo)致部分柴胡皂苷a 和d 的分解導(dǎo)致提取率的下降降[8].因此，選擇70 °C 的微波提取溫度條件.

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在甲醇體積百分比為70%、料液比為1∶60 g/mL、微波提取溫度為70 °C 的條件下，隨著提取時(shí)間從10 min 延長(zhǎng)到50 min.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間從10 min 延長(zhǎng)到30 min 時(shí)，柴胡皂苷提取率逐步上升，在30 min 皂苷提取率最大，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，皂苷提取率開(kāi)始下降.提取時(shí)間的延長(zhǎng)，一方面通過(guò)增大細(xì)胞的破碎程度、細(xì)胞膜膨脹和塑化來(lái)提高提取率，另一方面隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)期處于高溫環(huán)境中的皂苷會(huì)發(fā)生部分的分解和轉(zhuǎn)化[8]，當(dāng)延長(zhǎng)到一定時(shí)間后提取率會(huì)下降.因此，選用30 min 為提取時(shí)間.

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

在甲醇體積百分比為70%、微波提取溫度為70 °C、提取時(shí)間為30 min 的條件下，隨著料液比從1∶40 g/mL改變到1∶80 g/mL.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)料液比從1∶40 g/mL 改變到1∶60 g/mL，柴胡皂苷的提取率逐漸上升，當(dāng)料液比低于1∶60 g/mL 時(shí)，料液比增加但提取率降低；柴胡皂苷有最大的溶解量，當(dāng)料液比增加，柴胡皂苷的溶解量不變，同時(shí)柴胡中的雜質(zhì)溶解量增大，導(dǎo)致皂苷提取率下降[9].因此料液比選擇為1∶60 g/mL.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 13.0軟件，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化皂苷提取實(shí)驗(yàn)條件.以柴胡皂苷提取率為響應(yīng)值，共設(shè)計(jì)4 因素3 水平實(shí)驗(yàn)29 組，設(shè)計(jì)見(jiàn)表3.

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of response surface test

2.2.2 數(shù)學(xué)模型擬合及數(shù)據(jù)分析

用Design-Expert 13.0 軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用Quadratic 模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到柴胡皂苷提取率的回歸方程為

式中：Y為柴胡皂苷提取率；A為微波提取溫度；B為料液比；C為提取時(shí)間；D為甲醇體積百分比度，實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表4.

以皂苷提取率作為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的ANOVA 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究模型系數(shù)在一階、二階和交互模型之間的擬合度和顯著性(表4)，模型的p<0.000 1(p<0.01)表示模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性.對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，相關(guān)系數(shù)R2=0.975 4，調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.948 9，均接近于1，表明數(shù)據(jù)對(duì)回歸模型具有很高的擬合度[10]；該模型具有合理性.失擬項(xiàng)的p=0.554 8(>0.05)，影響不顯著，表明該回歸模型可以很好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

表4 實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.4 Results of experimental analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

利用Design-Expert 13.0 軟件進(jìn)行多元擬合得出響應(yīng)面圖和對(duì)應(yīng)的等高線圖.固定其他因素水平值觀察各因素間的交互作用對(duì)柴胡中皂苷提取率的影響結(jié)果.等高線的形狀和曲面圖中的陡峭程度可反映出2 個(gè)因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性與否.由圖1 可知，在響應(yīng)面圖中，曲面變化陡峭，斜率極大，且等高線圖中曲線圖為橢圓，皂苷提取率變化極為明顯[11]；因此微波提取溫度和提取時(shí)間的交互作用顯著.由圖2 可知，在響應(yīng)面圖中，曲面變化陡峭，斜率極大，且等高線圖中的曲線為橢圓，皂苷提取率變化極為明顯，甲醇水溶液的沸點(diǎn)隨著甲醇體積百分比的上升逐漸降低，兩者之間的相互作用明顯[12]，因此微波提取溫度和甲醇體積百分比的交互作用顯著.由圖3可知，在響應(yīng)面圖中，曲面變化陡峭，斜率較大，且等高線圖中的曲線為橢圓，皂苷提取率變化較為明顯[13]，微波提取溫度和甲醇體積百分比的交互作用較為顯著.

圖1 微波提取溫度和提取時(shí)間對(duì)對(duì)皂苷提取率影響Fig.1 Effect of the microwave extraction temperature and extraction time on extraction yield of saikosaponins

圖2 微波提取溫度和甲醇體積百分比對(duì)皂苷提取率影響的響應(yīng)面和等高面圖Fig.2 Effect of the microwave extraction temperature and methanol concentration on extraction yield of saikosaponins

圖3 微波提取溫度和料液比對(duì)皂苷提取率影響Fig.3 Effect of the microwave extraction temperature and solid-liquid ratio on extraction yield of saikosaponins

由圖4 可知，在響應(yīng)面圖中，曲面變化較為陡峭，斜率較大，等高線圖中的曲線為橢圓，但接近為圓，柴胡皂苷提取率變化不明顯[13]，微波提取溫度和甲醇體積百分比的交互作用不顯著.由圖5 可知，在響應(yīng)面圖中，曲面變化較緩，等高線圖中的曲線為橢圓，但接近為圓，柴胡皂苷提取率變化不明顯，微波提取溫度和甲醇體積百分比的交互作用不顯著.由圖6可知，在響應(yīng)面圖中，曲面變化較陡峭，但等高線圖中的曲線接近為圓，皂苷提取率變化不明顯，提取時(shí)間和甲醇體積百分比的交互作用不顯著.

圖4 料液比和甲醇體積百分比對(duì)皂苷提取率影響Fig.4 Effect of the solid-liquid ratio and methanol concentration on extraction yield of saikosaponins

圖5 料液比和提取時(shí)間對(duì)皂苷提取率影響Fig.5 Effect of the solid-liquid ratio and extraction time on extraction yield of saikosaponins

圖6 提取時(shí)間和甲醇體積百分比對(duì)皂苷提取率影響Fig.6 Effect of extraction time and methanol concentration on extraction yield of saikosaponins

此外，A、D、AC、AD、A2、B2、C2、D2的p<0.01 達(dá)到極顯著水平，表明提取溫度、甲醇體積百分比單一作用和微波提取溫度與提取時(shí)間交互作用、微波提取溫度和甲醇體積百分比的交互作用對(duì)柴胡皂苷提取率影響極顯著，B、AB的p<0.05 達(dá)到顯著水平，表明料液比的單一作用和提取溫度與料液比的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響較大，C、BC、BD、CD的p>0.05不顯著，對(duì)柴胡皂苷提取率的影響較小[14].由此可得出單因素對(duì)響應(yīng)值影響大小的順序?yàn)锳>D>B>C.

2.3 方法學(xué)考察

加樣回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)HPLC 檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)考察，計(jì)算每組中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d 的加樣回收率及其RSD，結(jié)果如表5～7 所示.柴胡皂苷a 加樣回收率結(jié)果中RSD 為1.55%;柴胡皂苷b2加樣回收率結(jié)果中RSD 為0.53%;柴胡皂苷d 加樣回收率結(jié)果中RSD 為1.21%.

表5 柴胡皂苷a 加樣回收率結(jié)果(n=9)Tab.5 Average recovery of Saikosaponin a at three different levels( n= 9)

表6 柴胡皂苷b2 加樣回收率結(jié)果Tab.6 Average recovery of Saikosaponin b2 at three different levels

表7 柴胡皂苷d 加樣回收率結(jié)果Tab.7 Average recovery of Saikosaponin d at three different levels

結(jié)果顯示檢測(cè)方法中3 種皂苷的回收率在97.52%～100.80%，RSD 均小于1.55%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好，該檢測(cè)方法可作為檢測(cè)柴胡皂苷的含量測(cè)定方法.

2.4 工藝條件優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)對(duì)微波提取溫度、料液比、提取時(shí)間和甲醇體積百分比4 個(gè)因素的工藝參數(shù)的優(yōu)化，得到最佳參數(shù)結(jié)果：微波提取溫度為68.4 °C、料液比為1∶59 g/mL、提取時(shí)間為30.2 min、甲醇體積百分比為60.4%.最終選擇微波提取溫度為68 °C、料液比為1:59 g/mL、提取時(shí)間為30 min、甲醇體積百分比為60%，作為實(shí)際實(shí)驗(yàn)選擇.

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

甲醇水溶液微波輔助提取1 g 柴胡藥渣，用HPLC分析得到的提取液得到柴胡皂苷的提取率列于表8.采用“2.4”項(xiàng)下優(yōu)化的工藝參數(shù)進(jìn)行5 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，柴胡藥渣中的皂苷提取量分別為5.182、5.164、5.24、5.135、5.152 mg/g，平均皂苷提取率為5.175 mg/g，RSD為0.78%，與預(yù)測(cè)值5.141 mg/g 相接近，重復(fù)性良好.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明工藝參數(shù)可靠.

表8 提取物質(zhì)量及皂苷占比Tab.8 Extract amounts and their ratios of every saikosaponin

2.6 HPLC 檢測(cè)色譜圖

按照“1.2.2”項(xiàng)下HPLC 檢測(cè)方法對(duì)供試品溶液及對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，并按照保留時(shí)間和特征峰進(jìn)行比對(duì)，得到樣品溶液中每個(gè)相應(yīng)物質(zhì)的峰位置，色譜圖見(jiàn)圖7.

圖7 供試品溶液及柴胡皂苷a、b2、d 對(duì)照品HPLC 圖Fig.7 HPLC diagrams of sample solution, Bupleurum saponin a, b2 and d

3 結(jié) 論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選了微波提取溫度、料液比、提取時(shí)間、甲醇體積百分比等4 個(gè)因素作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化的因素，優(yōu)化的結(jié)果表明設(shè)計(jì)的模型具有顯著性.得出用甲醇水溶液作為提取溶劑的最佳工藝參數(shù)為：微波提取溫度為68 °C、料液比為1∶59 g/mL、提取時(shí)間為30 min、甲醇體積百分比為60%.統(tǒng)計(jì)回歸分析表明，該工藝參數(shù)可作為進(jìn)一步開(kāi)展中試研究的參考，對(duì)擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模有一定的指導(dǎo)意義.