王明耀 楊 曉 黃 濤 王曉玲,3,4* 楊其長 郭俊凌,3,4*

(1.四川大學(xué) 生物質(zhì)與皮革工程系,成都 610065;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 都市農(nóng)業(yè)研究所/成都國家農(nóng)業(yè)科技中心,成都 610213;3.四川大學(xué) 制革清潔技術(shù)國家工程實驗室,成都 610065;4.四川大學(xué) 皮革化學(xué)與工程教育部重點實驗室,成都 610065)

水培技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于園藝或糧食作物生產(chǎn)的植物工廠中。該技術(shù)能夠減少病蟲害,實現(xiàn)連續(xù)種植,一年多產(chǎn),而且能夠適用于水資源有限和土壤退化的地區(qū),所以水培技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為能夠促進可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要技術(shù)之一[1]。然而,水培生產(chǎn)是在一種開放式環(huán)境中培養(yǎng)農(nóng)作物,而且培養(yǎng)所用營養(yǎng)液含有豐富的營養(yǎng)元素,從而便于藻類滋生,并在營養(yǎng)液中爆發(fā)式生長。藻類爆發(fā)式的生長會消耗水培營養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分,減少營養(yǎng)液中的溶解氧,釋放有毒代謝物,降低水質(zhì),并增加了植物病蟲害入侵的風(fēng)險[2]。迄今,已有許多方法被證明能抑制藻類生長,如人工打撈、使用鋁絮凝、使用銅基除藻劑等[2-3]。其中,銅基除藻劑(如硫酸銅),能夠破壞藻細胞的光合系統(tǒng),造成氧化還原失衡,嚴重影響藻細胞內(nèi)酶的活性以及藻細胞的呼吸作用,最終導(dǎo)致藻細胞死亡[4]。但是,直接使用這類銅基除藻劑會造成嚴重的二次環(huán)境污染,使得這種方法難以在糧食作物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[2-3,5]。所以迫切需要就新一代的抑藻劑展開研究,探討既能夠保留銅的高效抑藻能力,又能兼顧環(huán)境安全性和生物安全性的策略。

納米定向緩釋技術(shù)是一種以納米材料為載體的物質(zhì)精確遞送策略,可以實現(xiàn)農(nóng)藥和營養(yǎng)物質(zhì)的精確遞送和在較長時間內(nèi)的緩慢釋放,可極大地提高營養(yǎng)物質(zhì)的遞送和農(nóng)藥的利用效率,同時減少環(huán)境損害,減少投入成本,提高產(chǎn)量[6-9]。然而,這種納米定向緩釋技術(shù)通常需要合成納米材料作為農(nóng)藥的載體[10],例如二氧化硅納米顆粒[11]、有機聚合物[12]、碳納米管[13]、粘土納米片[14]和病毒顆粒[8]。而且,這些納米材料的合成工藝復(fù)雜且耗時、運載的藥劑被無限制的釋放以及納米載體的合成過程均會造成二次環(huán)境污染[10]。

已有研究表明天然植物多酚是一種綠色生物質(zhì)材料,其酚羥基能夠與金屬離子配位(如Fe3+或Cu2+等),可被進一步自組裝形成功能性金屬-多酚納米膜和納米復(fù)合物[15-16]。而且,由于生物相容性和模塊化自組裝特性[17-20],金屬-多酚自組裝納米膜和納米復(fù)合物已經(jīng)在生物技術(shù)[21-24]和生物醫(yī)學(xué)[25-26]的應(yīng)用中已得到了極大的探索。Li等[27-28]將功能性稀土釤離子(Sm3+)分別與表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素配位形成納米復(fù)合物,并成功用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和結(jié)腸癌。此外,水培生菜是一種世界范圍內(nèi)食用的沙拉蔬菜,也是一種在植物工廠中廣泛種植的綠葉蔬菜。因此,本研究擬以水培生菜為研究對象,將功能性銅離子(Cu2+離子)與不同的植物多酚,包括楊梅單寧(Bayberry tannin,BT)、橡椀單寧(Valonia tannin,VT)、塔拉單寧(Tara tannin,Tr)、單寧酸(Tannin acid,TA),自組裝成為銅(II)-多酚納米抑藻材料,評估本研究自組裝銅(II)-多酚納米抑藻材料對生菜水培過程中各種藻類的抑制作用,以期為一種綠色和可持續(xù)的水培作物生產(chǎn)中的藻類生長抑制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通小球藻(Chlorellavulgaris)購自四川杜瑞特科技有限公司;楊梅單寧(Bayberry tannin,BT),橡椀單寧(Valonia tannin,VT),塔拉單寧(Tara tannin,Tr)購自廣西百色天星植物科技有限公司。單寧酸(Tannin acid,TA)購自Sigma-Aldrich。丙酮、戊二醛、碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鐵銨、CuSO4、EDTA·2Na、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、Na2CO3、Na2EDTA·2H2O、H3BO3、FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MnO4·2H2O、CuSO4·5H2O、Co(NO3)2·6H2O、異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)購自上海泰坦科技股份有限公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 銅(II)-多酚納米復(fù)合物的制備及表征

在室溫下,取4 mL不同植物多酚(BT、VT、Tr、TA)溶液(8、16、32、64 mg/mL)分別和4 mL金屬鹽(CuSO4)溶液(2、4、8、16 mg/mL)混合于去離子水中(16 mL),再加入16 mL檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4),靜置過夜。然后,離心(10 000 r/min,10 min),分離沉淀物,并重懸于去離子水(40 mL)中,得到銅(II)-多酚納米復(fù)合物懸浮液,即CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr和CuII-TA納米復(fù)合物懸浮液,每一種納米復(fù)合物懸浮液的質(zhì)量濃度均為1、2、4、8 mg/mL。隨后,采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM,Helios G4 UC,Thermo Fisher Scientific,USA)、傅立葉變化近紅外光譜(FT-IR,IS10,Thermo Nicolet,USA)、動態(tài)光散射光譜儀(DLS,Zetasizer nano zsp,Malvern,UK)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES,Optima 8000,PerkinElmer,USA)等手段表征銅(II)-多酚納米復(fù)合物的形貌、結(jié)構(gòu)、粒徑和銅含量等。

1.3 銅(II)-多酚納米復(fù)合物的抑藻性能分析

以普通小球藻(C.vulgaris)為試驗?zāi)Ｐ?。將不同濃度的銅(II)-多酚納米復(fù)合物(CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA)懸浮液(1 mL)加入BG11營養(yǎng)液(24 mL)中,再加入C.vulgaris(初始數(shù)量約為1×106個/mL)作為試驗組。在不含有銅(II)-多酚納米復(fù)合物的BG11營養(yǎng)液(25 mL)中加入C.vulgaris(初始數(shù)量約為1×106個/mL)作為對照組(表1)。然后分別放置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,設(shè)置植物培養(yǎng)箱溫度為25 ℃,光照強度為4 000 LUX,光暗比為12 h/12 h。在培養(yǎng)過程中,連續(xù)監(jiān)測試驗組和對照組中C.vulgaris細胞生長數(shù)量的變化,繪制C.vulgaris的生長曲線。每組設(shè)置3個平行試驗組。

藻細胞數(shù)量和藻細胞總體熒光強度呈線性關(guān)系,可通過測量營養(yǎng)液中藻細胞的熒光強度來計算。即,先將不同濃度梯度的C.vulgaris細胞在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù),然后再將不同濃度梯度的C.vulgaris細胞用酶標儀(Tecan infinite 200,Tecan,Switzerland)測量熒光強度,激發(fā)波長:410 nm,發(fā)射波長:650～700 nm。最后根據(jù)藻細胞數(shù)量和藻細胞熒光強度建立線性的標準曲線。根據(jù)標準曲線計算C.vulgaris細胞在培養(yǎng)期的生長數(shù)量。

1.4 C.vulgaris形態(tài)觀察

將試驗組和對照組培養(yǎng)3 d后,通過FESEM和透射電子顯微鏡(TEM,HT7700,Hitachi,Japan)觀察C.vulgaris的形態(tài)結(jié)構(gòu)。即,在培養(yǎng)C.vulgaris3 d后,分別取試驗組和對照組的培養(yǎng)液(20 mL),離心(10 000 r/min,3 min)后收集沉淀,用2.5%的戊二醛在4 ℃下固定過夜。然后用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.2)洗滌3次,再用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇進行梯度脫水,最后采用FESEM觀察C.vulgaris形態(tài)。

將收集的藻細胞置于戊二醛溶液(2.5%)中,在4 ℃條件下固定過夜。倒掉固定液,用磷酸鹽緩沖液(0.1 M,pH 7.2)洗滌3次,每次15 min。然后用鋨酸溶液(1%)固定樣品1～2 h。吸取鋨酸廢液,用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.2)再次洗滌樣品3次,每次15 min。隨后用梯度濃度的(30%、50%、70%、80%、90%和95%)乙醇溶液進行脫水處理,每種濃度處理15 min,再用100%的乙醇處理20 min,最后用丙酮處理20 min。將固定好的藻細胞用Spurr包埋劑包埋,用超薄切片機(LEICA EM UC7)切片。切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5 ～ 10 min。最后使用TEM觀察藻細胞形態(tài)。

將牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)溶解在生理鹽水(27 mL)和碳酸鹽緩沖液(3 mL,0.1 mol/L,pH 9.0)中,質(zhì)量濃度為10 mg/mL。將異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)溶解在碳酸鹽緩沖液(1 mL,0.1 mol/L,pH 9.0)中,質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。然后,將FITC溶液添加到BSA溶液中,并在4 ℃下攪拌混合12 h。通過離心(2 500 r/min,10 min)獲得上清液,再用分子量為500的透析袋透析3 d,去除游離異硫氰酸熒光素,即獲得FITC-BSA。最后,將FITC-BSA加入CuII-BT懸浮液(1 mg/mL,10 mL)中,于4 ℃下攪拌24 h。通過離心(10 000 r/min,10 min)得到異硫氰酸熒光素-牛血清白蛋白標記的CuII-BT(Fluorescein isothiocyanate isome-Bovine serum albumin-CuII-BT,FITC-BSA-CuII-BT)沉淀,并重新懸浮于去離子水中,質(zhì)量濃度為1 mg/mL。將FITC-BSA-CuII-BT懸浮液(1 mL)加入含有C.vulgaris(數(shù)量約為1×106個/mL)的BG11營養(yǎng)液中(24 mL)作為試驗組。在不含有FITC-BSA-CuII-BT的BG11營養(yǎng)液(25 mL)中加入C.vulgaris(初始數(shù)量約為1×106個/mL)作為對照組。然后放置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d(溫度為25 ℃,無光照)。3 d后,取10 mL營養(yǎng)液,離心(10 000 r/min,3 min)后用去離子水連續(xù)洗滌3次,最終得到C.vulgaris細胞。將得到C.vulgaris細胞重懸于去離子水中(10 mL),并采用LCFM觀察C.vulgaris細胞形態(tài),激發(fā)波長:488和405 nm,發(fā)射波長:525和650～700 nm。

1.5 C.vulgaris細胞內(nèi)銅含量、SOD活性和MDA含量分析

將CuII-BT懸浮液(1 mL,1 mg/mL)加入含有C.vulgaris(數(shù)量約為1×106個/mL)的BG11培養(yǎng)液中(24 mL)作為試驗組。在不含有CuII-BT的BG11營養(yǎng)液(25 mL)中加入C.vulgaris(初始數(shù)量約為1×106個/mL)作為對照組(表1)。然后放置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d(溫度為25 ℃,光照強度為4 000 LUX,光暗比為12/12 h)。培養(yǎng)3 d后,分別取20 mL對照組和試驗組營養(yǎng)液,離心(10 000 r/min,3 min)后得到C.vulgaris細胞,冰浴待用。取藻細胞使用EDTA·2 Na(0.1 M)洗滌3次,去除黏附在C.vulgaris表面的CuII-BT,得到C.vulgari細胞。最后,將C.vulgaris細胞經(jīng)過硝酸和雙氧水(V(硝酸)∶V(雙氧水)=5∶2)消解、過濾(0.22 μm的水相濾膜)以及定容后,采用ICP-AES檢測銅含量。用液氮反復(fù)凍融[29],對C.vulgari細胞進行破碎,隨即采用SOD和MDA檢測試劑盒測定SOD活性和MDA含量,同時采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。

1.6 銅(II)-多酚納米復(fù)合物在水培生產(chǎn)中的抑藻性能及其對植物的影響

將CuII-BT懸浮液(4 mg/mL)和CuSO4溶液(0.37 mg/mL)分別加入到Hoagland營養(yǎng)液中,分別得到含有CuII-BT和CuSO4的Hoagland營養(yǎng)液,質(zhì)量濃度分別為160.0和14.7 μg/mL。利用含有CuII-BT和CuSO4的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)生菜幼苗(種子萌發(fā)15 d后的幼苗,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所成都國家農(nóng)業(yè)科技中心提供)。同時,設(shè)計對照組為直接采用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)生菜幼苗(表1)。設(shè)置培養(yǎng)箱溫度為22 ℃,光照強度為8 000 LUX,光暗比為12/12 h。在7 和15 d分別取營養(yǎng)液,使用顯微鏡在血球計數(shù)板中統(tǒng)計藻細胞數(shù)量。經(jīng)過上述培養(yǎng)15 d后,分別取試驗組和對照組的生菜葉,用硝酸和雙氧水(V(硝酸)∶V(雙氧水)=5∶2)消解、過濾(0.22 μm的水相濾膜)以及定容,采用ICP-AES檢測銅含量。

表1 各試驗分析對照組和處理組的分組設(shè)置Table 1 Grouping setting of each test analysis control group and treatment group

2 結(jié)果與分析

2.1 銅(II)-多酚納米復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征

制備銅(II)-多酚納米復(fù)合物的具體步驟見圖1。具體步驟如下:在室溫下,取不同植物多酚(BT、VT、Tr、TA)分別和金屬鹽(CuSO4)溶解于去離子水中,再加入pH 7.4 的檸檬酸鹽緩沖液,靜置過夜。然后,離心分離沉淀物并重懸于去離子水中,形成銅(II)-多酚納米復(fù)合物懸浮液,即CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr和CuII-TA。利用X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)解釋銅(II)-多酚納米復(fù)合物中多酚與銅離子的相互作用機理。O 1 s分譜圖顯示不同多酚具有C-O和C=O信號峰,當多酚和銅離子絡(luò)合后,由于電子云密度增加,結(jié)合能降低,致使C-O信號峰會出現(xiàn)偏移。其中,楊梅單寧(BT)的C-O信號峰為533.21 eV,當銅離子與楊梅單寧配位后,CuII-BT的C-O信號峰結(jié)合能降低至532.77 eV。同樣地,單寧酸(TA)與銅離子配位后,C-O信號峰結(jié)合能降低至533.16 eV。橡椀單寧(VT)與銅離子配位后,C-O信號峰結(jié)合能降低至532.87 eV。塔拉單寧(Tr)與銅離子配位后,CuII-Tr的C-O信號峰結(jié)合能降低至532.69 eV。

圖1 銅(II)-多酚納米復(fù)合物的制備及抑藻策略Fig.1 Preparation of copper(II)-phenolic nanocomplexes and algal inhibition strategies

多酚(BT、TA、Tr、VT)和銅(II)-多酚納米復(fù)合物(CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA)的傅立葉變換近紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)如圖2(a)～(d)所示。在1 621～1 455 cm-1處的吸收峰和1 313 cm-1處的吸收峰分別對應(yīng)于多酚苯環(huán)的拉伸震動吸收峰和-OH基團的彎曲振動吸收峰。當與銅離子配位后,銅(II)-多酚納米復(fù)合物(CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA)的苯環(huán)拉伸震動吸收峰強度和-OH基團的彎曲振動吸收峰強度都降低。綜上所述,多酚酚羥基與銅離子配位形成了銅(II)-多酚納米復(fù)合物。

圖2 不同多酚和銅(II)-多酚納米復(fù)合的FT-IR光譜Fig.2 FT-IR Spectra of different polyphenol and copper(II)-phenolic nanocomplexes

采用激光納米粒度儀(Dynamic light scattering measurements,DLS)及Zeta電位儀測量銅(II)-多酚納米復(fù)合物(CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA)在水溶液中的粒徑大小及穩(wěn)定性,結(jié)果見圖3。由圖可知,CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr和CuII-TA的粒徑分別約為85、86、64和30 nm(圖3(a)～(d))。在pH 7.1條件下,CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr和CuII-TA 的Zeta電位均為負值,分別為-44.2、-41.5、-41.1和-43.6 mV。由此可知,銅(II)-多酚納米復(fù)合物(CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA)能夠形成穩(wěn)定的懸浮液。

圖3 不同銅(II)-多酚納米復(fù)合物粒徑分布Fig.3 Size distribution of different copper(II)-phenolic nanocomplexes

圖4為銅(II)-多酚納米復(fù)合物(CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA)穩(wěn)定懸浮液中銅離子含量。由圖可知,在質(zhì)量濃度為40 μg/mL時,CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA中銅離子含量分別為0.66、1.35、0.20和3.02 μg/mL。隨著CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA濃度增大,銅離子含量增大。其中,同樣濃度的銅(II)-多酚納米復(fù)合物懸浮液中,縮合類多酚(BT、VT)形成的CuII-BT、CuII-VT懸浮液中銅離子含量大于水解類多酚(Tr、TA)形成的CuII-Tr、CuII-TA懸浮液,表明不同多酚與銅離子的絡(luò)合能力不同。

柱形圖上方不同字母標記表示顯著差異性,(P<0.05)。下同。Different letters above columns represent significant differences at P<0.05. The same below.圖4 不同銅(II)-多酚納米復(fù)合物的銅含量Fig.4 Concentration of Cu contained by different copper (II)-phenolic nanocomplexes

2.2 銅(II)-多酚納米復(fù)合物的抑藻機理

利用FESEM觀察C.vulgaris細胞的形貌結(jié)構(gòu),結(jié)果見圖5(a)。由圖可知,對照組C.vulgaris細胞的表面光滑、無顆粒物。試驗組的C.vulgaris表面黏附有大量的CuII-BT納米顆粒(紅色箭頭處),并且C.vulgaris細胞發(fā)生變形和塌陷。利用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)觀察的結(jié)果同樣表明,相比于對照組完整的C.vulgaris細胞,經(jīng)過含有CuII-BT的培養(yǎng)液培養(yǎng)的C.vulgaris細胞出現(xiàn)嚴重的變形(圖5(b))。

此外,采用FITC-BSA-CuII-BT(40 μg/mL)處理C.vulgaris72 h,用激光共聚焦顯微鏡(Laser-scanning confocal fluorescence microscopy imaging,LCFM)觀察C.vulgaris細胞形貌,結(jié)果如圖5(c)所示。由于含有葉綠素,C.vulgaris細胞自身散發(fā)出紅色熒光[30],同時,C.vulgaris細胞表面能夠觀測到FITC-BSA-CuII-BT散發(fā)的綠色熒光,表明CuII-BT能夠黏附于C.vulgaris細胞表面,為精確遞送銅離子至藻細胞內(nèi)部提供基礎(chǔ)。此外,經(jīng)過CuII-BT處理的C.vulgaris細胞內(nèi)部銅含量(0.059 μg/mL)顯著高于對照組細胞(0.013 μg/mL),說明CuII-BT黏附在藻細胞表面并定向釋放大量的銅離子至藻細胞內(nèi)部。

圖5 CuII-BT處理組以及對照組中C.vulgaris的SEM、TEM圖和FITC-BSA-CuII-BT處理C.vulgaris的熒光圖Fig.5 SEM and TEM images of C.vulgaris in control group and CuII-BT treatment group and fluorescence images of C.vulgaris treated by FITC-BSA-CuII-BT

當銅離子進入藻細胞內(nèi)部后,銅離子將引起藻細胞的非生物脅迫,藻細胞會產(chǎn)生大量的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)以應(yīng)對脅迫,所以此時檢測藻細胞內(nèi)部SOD活性則可以評估藻類對氧化應(yīng)激的耐受性[29,31-32]。當細胞無法承受氧化應(yīng)激產(chǎn)生的脅迫時,細胞會發(fā)生氧化損傷,膜酯過氧化并分解產(chǎn)生丙二醛(Malondialdehyde,MDA),所以MDA是細胞氧化損傷的重要標志物[32]。如圖6(a)所示,經(jīng)過CuII-BT處理C.vulgaris3 d后,細胞內(nèi)部SOD活性(0.035 0 U/mg 蛋白)顯著高于對照組(0.001 6 U/mg蛋白),說明C.vulgaris細胞正在遭受銅離子帶來的巨大的非生物脅迫。圖6(b)表明經(jīng)過CuII-BT處理C.vulgaris3 d后,細胞的MDA含量也顯著增大至0.033 1 nmol/mg 蛋白,遠遠大于對照組(0.006 8 nmol/mg 蛋白),說明此時銅離子引起的脅迫反應(yīng)極強,C.vulgaris細胞膜遭受嚴重的氧化作用,進而產(chǎn)生更多的MDA。由此可知,多酚的多重作用力[20]促使CuII-BT黏附于藻細胞表面并向藻細胞內(nèi)部定向釋放銅離子,從而引起藻細胞嚴重的氧化損傷,破壞其正常的生理功能,最終造成藻細胞的死亡。

圖6 對照和CuII-BT處理后C.vulgaris產(chǎn)生的超氧化物歧化酶活性(a)和丙二醛含量(b)變化Fig.6 Superoxide dismutase activity (a) and malondialdehyde content (b) of C. vulgaris for control group and CuII-BT treatment group

2.3 銅(II)-多酚納米復(fù)合物的抑藻性能

以C.vulgaris為試驗?zāi)Ｐ?用不同的銅(II)-多酚納米復(fù)合物(CuII-BT、CuII-VT、CuII-Tr、CuII-TA)分別處理C.vulgaris,連續(xù)7 d監(jiān)測處理組和對照組中C.vulgaris細胞生長數(shù)量的變化,繪制C.vulgaris的生長曲線,如圖7所示。由圖7(a)可知,當營養(yǎng)液中CuII-BT的質(zhì)量濃度為40和80 μg/mL時,C.vulgaris細胞數(shù)從3 d開始維持不變,說明C.vulgaris的生長受到巨大非生物脅迫,從而C.vulgaris的正常生長被抑制。當CuII-BT的質(zhì)量濃度進一步增大至160和320 μg/mL,C.vulgaris細胞個數(shù)急劇減少,表明隨著CuII-BT濃度增大,C.vulgaris細胞的生長不僅能夠被完全抑制,并且由于細胞膜遭受嚴重的氧化作用從而出現(xiàn)凋亡。在7 d時,C.vulgaris完全凋亡,此時CuII-BT對C.vulgaris的抑制率 >99%。由此可知,CuII-BT對C.vulgaris具有高效的抑制作用。

圖7(b)是CuII-VT處理C.vulgaris的生長曲線。由圖可知,隨著CuII-VT質(zhì)量濃度從40 μg/mL增大至320 μg/mL時,在7 d后的營養(yǎng)液中C.vulgaris細胞個數(shù)急劇較少至7.17×105個/mL,此時,CuII-VT 對C.vulgaris的生長抑制率達到了94%。同樣說明隨著CuII-VT濃度增大,C.vulgaris細胞生長不僅能夠被完全抑制,且由于細胞膜遭受嚴重的氧化作用從而出現(xiàn)凋亡,表明CuII-VT可以抑制C.vulgaris在水培營養(yǎng)液中的生長,且能夠消除藻類污染。

圖7(c)展示了銅離子與Tr形成的CuII-Tr納米復(fù)合物處理培養(yǎng)C.vulgaris的生長曲線。隨著培養(yǎng)時間的延長,當CuII-Tr的質(zhì)量濃度達到了320 μg/mL時,C.vulgaris細胞個數(shù)減少,說明此時的C.vulgaris生長受到抑制,且在7 d時,CuII-Tr對C.vulgaris的抑制率為32%。與CuII-Tr相比,CuII-TA對C.vulgaris生長抑制能力增強(圖7(d)),在濃度為320 μg/mL時,7 d時的抑制率為63%。

圖7 不同銅(II)-多酚納米復(fù)合物在不同濃度下處理C.vulgaris細胞7 d的生長曲線Fig.7 Growth curves of C.vulgaris after treatment with different concentrations copper(II)-phenolic nanocomplexes for 7 days

綜上所述可知,銅離子與縮合類多酚形成的CuII-BT和CuII-VT對C.vulgaris的抑制能力明顯強于水解類多酚形成的CuII-Tr和CuII-TA,這主要是由于粘附于C.vulgaris細胞表面的CuII-BT和CuII-VT能夠釋放更多的銅離子,對藻細胞造成更強的氧化損傷,從而實現(xiàn)對C.vulgaris的高效抑制(圖(8))。

2.4 銅(II)-多酚納米復(fù)合物在水培生產(chǎn)中的抑藻性能及其對植物的影響

在水培營養(yǎng)液(Hoagland營養(yǎng)液)中添加CuII-BT(160 μg/mL)納米復(fù)合物后培養(yǎng)生菜15 d,并評估銅(II)-多酚納米復(fù)合物的生物安全性及其在實際水培生菜過程中的抑藻能力。圖9(a)和(b)所示是對照組與CuII-BT處理組培養(yǎng)15 d的生菜生長表型。相比于對照組,CuII-BT處理組的生菜葉表型沒有表現(xiàn)出差異,生長狀況良好。CuSO4(14.7 μg/mL,以CuII-BT銅含量計算)處理組生菜葉相對于對照組開始表現(xiàn)出萎蔫現(xiàn)象(圖9(c))。根據(jù)計數(shù)水培營養(yǎng)液中的藻類數(shù)量可知,在生菜生長的7 d和15 d,CuII-BT處理組的營養(yǎng)液中,藻類生長受到極大的限制,并且在生菜根部無肉眼可見的藻類附著(圖9(a)和(d))。但是,CuSO4處理組的營養(yǎng)液中的藻類生物量顯著增加,并且大量的藻類附著在生菜的根部(圖9(c)和(d))。

圖8 不同銅(II)-多酚納米復(fù)合物處理 C.vulgaris的胞內(nèi)銅濃度Fig.8 Intracellular copper concentration of C.vulgaris after treatment with different copper(II)-phenolic nanocomplexes

圖9 不同處理組生菜的表型(a)～(c)和營養(yǎng)液中的藻細胞數(shù)(d)Fig.9 Phenotype (a-c) and algal cell counts (d) in nutrient solution of lettuce seedling under different treatment groups

此外,相較于對照組的生菜根(平均根長10.2 cm),CuII-BT處理組的生菜根生長發(fā)育無差異(平均根長12.4 cm),而CuSO4處理組的生菜根的根長較短,平均根長僅6.0 cm(圖10(a))。同時,培養(yǎng)15 d后,與對照組相比,含有CuII-BT處理組的生菜鮮重沒有明顯差異,但CuSO4處理組的生菜鮮重顯著降低(圖10(b))。測量生菜葉中的銅含量結(jié)果顯示,與對照組相比,CuSO4處理組的生菜葉中銅含量顯著增高,但CuII-BT處理組的生菜葉的銅含量沒有明顯變化(圖11)。由此可知,營養(yǎng)液中加入的CuSO4作為微量元素被生菜大量攝入,致使營養(yǎng)液中的銅含量降低,進一步導(dǎo)致營養(yǎng)液中的銅含量不足以抑制藻類繁殖,反而可以作為微量元素促進藻類繁殖與生長,從而影響生菜生長。此外,當添加CuII-BT納米復(fù)合物時,由于多酚黏附于藻細胞表面并定向向藻細胞內(nèi)部釋放銅離子,從而能夠抑制藻類生長,有助于生菜生長。

圖10 不同處理組生菜的根長(a)和鮮重(b)Fig.10 Root length (a) and fresh weight (b) of lettuce seedling under different treatment groups

圖11 不同處理組的生菜葉含有的銅質(zhì)量分數(shù)Fig.11 Concentration of Cu in lettuce leaf after treatment with different groups

3 討 論

由于水培所用營養(yǎng)液富含的營養(yǎng)成分高且培養(yǎng)環(huán)境開放,致使藻類會反復(fù)爆發(fā),大大降低糧食作物產(chǎn)量,所以藻類的抑制或滅殺是水培生產(chǎn)中亟待解決的技術(shù)難題。針對藻類的抑制或滅殺通常使用銅基滅藻劑,但是仍然無法長期有效的抑制藻類的生長。此外,直接使用硫酸銅雖然能夠有效的進行抑藻,但是自由的銅離子會嚴重阻礙植物的生長發(fā)育,甚至導(dǎo)致植物枯萎[33-34]。已有研究者表明農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用的農(nóng)用化學(xué)品(農(nóng)藥)有99%的成分流入到了環(huán)境中,僅有1%能夠被利用[35-37]。值得注意的是,大量的農(nóng)藥流入環(huán)境,不可避免地會造成生態(tài)環(huán)境污染,可能會破壞生態(tài)平衡(滅殺有益生物),也有可能會促進耐藥菌的產(chǎn)生[37-38]。因此,為了能夠使農(nóng)藥最大程度的被利用,研究人員提出了利用納米技術(shù)作為新一代的農(nóng)藥使用策略[35-36]。

本研究利用天然植物提取物(多酚)與功能性金屬離子(銅離子)合成銅(II)-多酚納米復(fù)合物,其中天然多酚是一種生物相容性極高的材料,已經(jīng)被用于食品工程和生物工程領(lǐng)域[18,21,39-40],使該納米復(fù)合物能夠成為一種理想的材料用于抑制水培中藻類的生長繁殖。銅(II)-多酚納米復(fù)合物中的銅在營養(yǎng)液中是非自由態(tài)的離子,所以能夠使營養(yǎng)液中的自由銅離子不會過量,故不會損傷植物生長。此外,由于多酚具有的多重作用力[20]且能夠和蛋白質(zhì)相互作用[41],促使銅(II)-多酚納米復(fù)合物能夠黏附于藻細胞表面并向藻細胞遞送銅離子,從而導(dǎo)致藻細胞死亡。并且,相較于直接加硫酸銅,該納米復(fù)合物能夠長期持續(xù)的釋放銅離子,擁有持續(xù)抑藻能力,同時,銅(II)-多酚納米復(fù)合物不會造成植物的枯萎。以上說明,基于植物多酚自組裝的納米復(fù)合物,能夠定向向藻細胞內(nèi)部緩釋銅離子,從而直接滅殺藻細胞,不會對農(nóng)作物表現(xiàn)出毒性作用,表明其擁有高的生物安全性。因此,在未來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,該納米定向緩釋技術(shù)將會是一種具有極大潛力的農(nóng)用化學(xué)品使用策略,為實現(xiàn)糧食的增產(chǎn)和水培農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供可行性的技術(shù)手段。

4 結(jié) 論

本研究基于天然植物多酚對銅離子螯合能力,開發(fā)了一種能夠精確遞送農(nóng)用化學(xué)品和具有持久緩釋能力的納米復(fù)合物,主要結(jié)論如下:1)銅(II)-多酚納米復(fù)合物能夠黏附在藻細胞表面,進而持續(xù)地向藻細胞釋放銅離子,造成藻細胞強烈的氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致藻細胞的死亡;2)銅離子與縮合類多酚形成的納米復(fù)合物比與水解類多酚形成的納米復(fù)合物具有更強的抑藻性能,其中CuII-BT在7 d的抑制率達到99%;3)實際水培生菜試驗證明,銅(II)-多酚納米復(fù)合物能夠抑制實際水培生產(chǎn)營養(yǎng)液中藻類的生長。并且相對于直接使用CuSO4,銅(II)-多酚納米復(fù)合物對水培生菜沒有毒性。