趙喜娟劉圣宣劉騰飛鄭 潔杜 鵑胡新喜宋波濤,*何長征,*

1湖南省蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育研究中心 / 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 湖南長沙 410128;2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬鈴薯生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 湖北武漢 430070

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)是茄科茄屬的一年生草本植物, 是糧、菜、飼和工業(yè)原料兼用作物。2020年FAO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明我國已經(jīng)是世界第一馬鈴薯生產(chǎn)和消費(fèi)國。馬鈴薯可加工成馬鈴薯淀粉、薯片、薯?xiàng)l等產(chǎn)品, 但主要食用形式仍是鮮食[1]。鮮薯在采后運(yùn)輸及銷售過程中難以避免地受光照影響表皮發(fā)生綠化, 從而降低消費(fèi)者購買興趣[2], 這直接導(dǎo)致塊莖安全品質(zhì)下降以及經(jīng)營者的經(jīng)濟(jì)損失。

馬鈴薯綠化的本質(zhì)是光照條件下塊莖表皮下方薄壁組織細(xì)胞內(nèi)形成成熟葉綠體, 并合成葉綠素的過程。葉綠素是一種具有四吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)的植物色素[3], 在植物中的合成起始于δ-氨基酮戊酸(δ-aminolevulinic acid, ALA)在多種酶的催化作用下合成葉綠素。光照是影響馬鈴薯塊莖綠化以及葉綠素合成的一個重要因素。在光照條件下, 原葉綠素酸酯在光依賴性原葉綠素酸酯氧化還原酶(light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase,LPOR)的催化作用下合成葉綠素酸酯, 從而進(jìn)入下游的合成代謝。Okamoto等[4]比較了馬鈴薯綠化敏感品種“King Edward”在不同波長光源(紅、藍(lán)、白和遠(yuǎn)紅光)下塊莖中的葉綠素含量差異, 并檢測了在不同光源下的HEMA1、GSA、CHLH和GUN4等4種葉綠素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量, 結(jié)果表明葉綠素的生物合成可能受到光敏色素和隱花色素的調(diào)控。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中成員數(shù)量最多、分布最廣的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 廣泛參與植物的各種生理活動及外界環(huán)境的響應(yīng)過程[5]。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子參與各種各樣的生理進(jìn)程, 例如胚胎發(fā)育、節(jié)律調(diào)節(jié)、開花時間、組織分化、光信號傳遞、干旱和激素響應(yīng)等[6-7]。MYB蛋白的N端含有1～3個串聯(lián)且不完全重復(fù)的R結(jié)構(gòu)域, C端通常含有一個含有酸性氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[8]。MYB轉(zhuǎn)錄因子可通過和bHLH、WD40形成MBW復(fù)合體, 控制花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[9]。在番茄、馬鈴薯以及牽?；ㄖ芯蠱YB家族轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)光照并調(diào)節(jié)花青素合成的報(bào)道[10-13]。部分MYB轉(zhuǎn)錄因子也被發(fā)現(xiàn)會影響葉綠素合成, 在番茄中轉(zhuǎn)錄因子MYB72可抑制葉綠素、類胡蘿卜素以及類黃酮的合成[14], 而MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB5b[7]和RSM1[15]可分別抑制番茄和馬鈴薯中葉綠素的積累, 但是否有MYB轉(zhuǎn)錄因子參與馬鈴薯塊莖綠化過程中葉綠素的合成調(diào)控尚不明晰。

本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝物分析等方法比較了馬鈴薯塊莖在光誘導(dǎo)綠化過程中的葉綠素含量變化, 并對塊莖綠化過程中的DEGs及表達(dá)模式進(jìn)行了探究, 篩選出潛在轉(zhuǎn)錄因子, 并通過轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子與葉綠素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的相互作用, 研究結(jié)果為研究光信號調(diào)控馬鈴薯塊莖葉綠素合成提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

本試驗(yàn)所用馬鈴薯材料RM-210 (黃皮白肉)種植于塑料大棚內(nèi), 移栽在直徑24 cm塑料缽, 80 d后收獲成熟塊莖, 在20℃下黑暗儲藏10 d。選取大小一致, 形狀與表皮顏色相近, 無肉眼可見發(fā)芽、綠化以及機(jī)械損傷的馬鈴薯塊莖進(jìn)行試驗(yàn)。馬鈴薯塊莖用清水洗凈后自然風(fēng)干。風(fēng)干后將馬鈴薯塊莖置于20℃、光照強(qiáng)度36 μmol m-2s-1的條件下進(jìn)行全天照射誘導(dǎo)其綠化, 連續(xù)120 h, 分別于光照0、6、12、36、48和120 h后取塊莖表皮作為樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn), 取樣時避開芽眼部位。用刀片取塊莖表皮以及下方1.5～2.0 mm的髓部組織, 取下后立即用液氮速凍后研磨成粉末, 存放于-80℃條件下備用。每5個塊莖作為1組生物學(xué)重復(fù), 每個時間點(diǎn)取3組生物學(xué)重復(fù)。

用于雙熒光素酶測定的煙草(Nicotiana benthamianaL.)種于植物生長室, 待幼苗長至5～6片葉子時用于農(nóng)桿菌滲透。

1.2 葉綠素含量測定

參考Wassie的方法[16]測定葉綠素含量, 略有修改。利用乙醇萃取法, 取0.1 g凍存粉末樣品, 加入1.5 mL 95%乙醇后密封, 室溫黑暗下放置24～36 h, 在665 nm和649 nm的波長下測定溶液吸光度值。

1.3 RNA提取及基因表達(dá)檢測

使用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取RNA, 參照愛必夢生物科技有限公司的5× All-In- One RT Master Mix (with ACCURT Genomic DNA Removal Kit)使用說明書合成cDNA第一條鏈。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

將RM-210光照0、6、36 h的塊莖RNA送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行RNA測序。

將從Illumina平臺獲得的原始熒光圖像文件轉(zhuǎn)換為原始數(shù)據(jù)。通過移除適配器對包含超過5%的ploy-N和低質(zhì)量序列的原始讀取進(jìn)行修剪。數(shù)據(jù)處理后, 原始序列被轉(zhuǎn)換為干凈讀取。然后用Salmon軟件1.3.0版將干凈的讀數(shù)映射到馬鈴薯DM參考基因組的轉(zhuǎn)錄組。使用TPM估計(jì)基因表達(dá)水平, 用R包DESeq2在不同樣品間進(jìn)行差異基因表達(dá), 通過主成分分析(PCA)方法分析樣品之間的相關(guān)性, 基于Fold change≥2和FDR＜0.01標(biāo)準(zhǔn), 篩選DEGs;利用TBtools軟件對DEGs進(jìn)行了GO富集與KEGG通路富集分析, 在調(diào)整后的P＜0.05下利用超幾何檢驗(yàn), 并對葉綠素含量和與其相關(guān)的DEGs進(jìn)行了共表達(dá)聚類分析。

1.5 基因表達(dá)檢測

實(shí)時熒光定量PCR (qPCR)引物在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)(表1), 實(shí)時熒光定量PCR參照愛必夢生物科技有限公司的Blastaq 2× qPCR Master Mix說明書, 在Roche Light CyclerR 480II上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。選擇ef1α馬鈴薯基因(基因庫: AB061263)作為對照。用2-ΔΔCt方法計(jì)算單個基因的相對表達(dá)[17]。

表1 定量引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR used in this study

1.6 轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)構(gòu)基因的啟動子分析

以M6基因組作為參考基因組, 提取轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因的CDS上游2000 bp的序列作為啟動子區(qū)段, 上傳至Plant CARE (https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對潛在轉(zhuǎn)錄因子的啟動子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測

轉(zhuǎn)錄因子CDS序列重組到載體ph7lic-C-HA中,將啟動子重組到線性化載體pGREEN0800, 并用KpnI和NcoI限制性位點(diǎn)消化。用輔助質(zhì)粒pSoup將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中, 然后在本氏菌瞬時表達(dá)系統(tǒng)中瞬時表達(dá)。將感染農(nóng)桿菌的煙草置于正常條件下2 d, 然后在液氮中將葉片研磨成粉末。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Yeason Biotechnology Co., Ltd., 上海)檢測螢火蟲熒光素酶(Luc)和海腎熒光素酶(Ren)的活性, 并計(jì)算Luc/Ren比值以確定每個啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019 (Microsoft Corp., 美國)與SPSS 25.0 (SPSS Inc., 美國)進(jìn)行方差分析。使用Tukey多重比較法對各組樣品間進(jìn)行多重比較,使用Student’st-test進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。使用Graphpad Prism 8.4.2 (GraphPad Software, 美國)繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 RM-210塊莖光照后表皮顏色及葉綠素含量變化

對馬鈴薯RM-210塊莖連續(xù)光照120 h并拍照記錄其表型變化發(fā)現(xiàn), 在光照36 h后, RM-210的塊莖表皮可初步觀察到綠化現(xiàn)象, 光照48 h后表皮可觀察到明顯綠化(圖1-A)。測定了RM-210塊莖在光照0～120 h的葉綠素a和葉綠素b的含量(圖1-B), 塊莖表皮葉綠素含量在光照36 h后出現(xiàn)顯著上升, 且隨著光照時間的延長葉綠素含量持續(xù)升高, 這與表型變化的觀察結(jié)果相吻合。

圖1 RM-210塊莖在光照條件下0～120 h的表型和葉綠素含量變化Fig. 1 Change in phenotype and chlorophyll content of potato tubers of the RM-210 under light condition for 0-120 hours(A)光照0、6、12、36、48、120 h后塊莖圖片; (B)光照120 h期間葉綠素a和葉綠素b的含量變化。數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。不同字母表示由方差分析確定的各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Tukey多重比較,P＜ 0.05)。(A): the photographs of potato tubers were taken after 0, 6, 12, 36, 48, and 120 h of light exposure. (B): contents of chlorophyllaand chlorophyllbduring 120 hours light exposure. Data are the averages of three replicates ± SDs. Different lowercase letters indicate the statistical differences between different groups by ANOVA (Tukey’s Method,P＜ 0.05).

2.2 塊莖表皮變綠過程中DEGs的GO富集和KEGG通路分析

為明確光調(diào)控塊莖葉綠素合成中的關(guān)鍵途徑酶基因以及調(diào)控基因的表達(dá), 本研究對RM-210塊莖光照0、6、36 h的塊莖表皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過主成分分析(PCA)方法分析樣品之間的關(guān)系, 表明相同樣品的生物重復(fù)聚合在一起, 說明試驗(yàn)樣品具有良好的重復(fù)性(圖2-A), RNA-seq數(shù)據(jù)可以用于進(jìn)一步DEGs分析。

為探索光響應(yīng)的葉綠素合成相關(guān)基因, 比較了6 h與0 h和36 h與0 h的RNA-seq數(shù)據(jù), 基于Fold change≥2和FDR＜0.01標(biāo)準(zhǔn), 鑒定出5646個DGEs,并繪制了火山圖(圖2-B)。進(jìn)一步對DEGs進(jìn)行了GO富集與KEGG通路富集分析。GO富集結(jié)果表明,大部分DEGs顯著富集在“質(zhì)體” “類囊體”“細(xì)胞質(zhì)”“葉綠體”等細(xì)胞組分中, 以及“脅迫響應(yīng)”“能量與代謝前體物質(zhì)的合成”“光合作用”等生物學(xué)進(jìn)程中(圖2-C)。KEGG通路分析結(jié)果表明, 在-log10(P-value)＞2的水平上, DEGs共富集到15個信號通路上, 其中包括“光合作用”“能量代謝”及“氨基酸代謝”等信號通路中(圖2-D)。

圖2 光照0、6和36 h塊莖中DEGs的聚類圖和富集分析Fig. 2 Cluster diagrams and enrichment analysis of DEGs in tubers exposed at uninterrupted light for 0, 6, and 36 hours(A) 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的主成分分析; (B) 6 h vs 0 h和36 h vs 0 h的DEG火山圖。藍(lán)色代表顯著表達(dá)的基因, 灰色代表不顯著表達(dá)的基因; (C)DEGs的GO富集分析; (D) DEGs的KEGG通路分析。(A): principal component analysis of transcriptome data. (B): Volcano plot of DEGs for 6 h vs. 0 h and 36 h vs. 0 h. Blue rots represent genes of significant expression and gray rots were genes of nonsignificant expression. (C): GO enrichment analysis of DEGs. (D): the KEGG pathway analysis of DEGs.

2.3 塊莖表皮變綠過程中DEGs的聚類分析

為獲得光調(diào)控塊莖表皮葉綠素合成相關(guān)的調(diào)控機(jī)制, 本研究對DEGs進(jìn)行了聚類分析(圖3)。對鑒定到的DEGs進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn), 葉綠素合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因均上調(diào)表達(dá), 如StGAS1、StCHLD、StCrd1、StHEMA、StGUN4、StPORA、StUROD、StCHLM、StCHLG。此外, 發(fā)現(xiàn)MYB、bHLH、GATA和LSD等轉(zhuǎn)錄因子家族的61個轉(zhuǎn)錄因子在光照后均上調(diào)表達(dá), 其中StMYB-like、StWRKY、StLSD等19個轉(zhuǎn)錄因子持續(xù)上調(diào)表達(dá),StMYB113、StGATA、StERF等46個轉(zhuǎn)錄因子在光照0～6 h上調(diào)表達(dá), 6～36 h下調(diào)表達(dá)。

圖3 光照0、6、36 h的塊莖中DEG的聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of DEGs in tuber exposed to light for 0, 6, and 36 h

2.4 塊莖表皮葉綠素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子鑒定

為驗(yàn)證葉綠素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)模式, 本研究利用qPCR在RM-210光照0、6、36、48 h的樣品中檢測了StGSA1、StUROD、StCrd1、StHEMA、StGUN4、StPORA、StUROD、StCHLM、StCHLG等9個葉綠素合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因(圖4-A)表達(dá)量, 發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量隨著光照時間的延長而升高(圖4-B), 在36 h或48 h表達(dá)量最高, 與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致, 表明這些基因的表達(dá)可能在光誘導(dǎo)下參與了馬鈴薯塊莖表皮葉綠素的合成。

圖4 qPCR測定RM-210塊莖中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 4 Relative expression pattern of genes involved in the synthesis of chlorophyll in greening potato tubers derived from RM-210 determined by qPCR(A): 葉綠素生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因; (B): 提取22℃下光照0、6、36和48 h 時塊莖皮中的RNA, qPCR技術(shù)檢測9個結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量。不同字母表示由方差分析確定的各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Tukey多重比較,P＜ 0.05)。(A): structural genes in the chlorophyll biosynthesis pathway; (B): RNA was extracted from the tuber epidermis under light at 22℃ for 0, 6,36, and 48 h. The relative expression level of nine structural genes were determined by qRT-PCR. Different letters indicate significant difference between the different groups by ANOVA (Tukey’s Method,P＜ 0.05).

為進(jìn)一步挖掘調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,以log2(Fold Change)＞2為標(biāo)準(zhǔn), 篩選出6個表達(dá)量顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子, 即StSBP、StLSD、StGATA、StWRKY、StMYB-like和StMYB113, 分析其表達(dá)模式并進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證, 結(jié)果表明6個轉(zhuǎn)錄因子的定量數(shù)據(jù)均與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)呈顯著正相關(guān)(圖5-C)。其中,StGATA和StMYB113的表達(dá)量在6 h最高(圖5-A),推測其可能是早期響應(yīng)光信號, 調(diào)控葉綠素合成早期結(jié)構(gòu)基因, 從而調(diào)控葉綠素合成;StSBP、StLSD、StWRKY、StMYB-like的表達(dá)量在36 h或48 h的表達(dá)量最高, 推測其可能是調(diào)控葉綠素合成中、后期結(jié)構(gòu)基因, 從而調(diào)控葉綠素累積。

圖5 qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量Fig. 5 Verification of transcription factor expression by qPCR(A): 轉(zhuǎn)錄因子的qPCR結(jié)果; (B): 轉(zhuǎn)錄因子的RNA-seq數(shù)據(jù)與qPCR數(shù)據(jù)的比較; (C): 轉(zhuǎn)錄因子的RNA-seq數(shù)據(jù)與qPCR數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析(Pearson相關(guān)性分析)。不同字母表示由方差分析確定的各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Tukey多重比較,P＜ 0.05)。(A): qPCR results of 6 TFs selected in the transcriptome sequencing. (B): RNA-seq and qPCR data. (C): the correlation analysis of RNA-seq and qPCR results (Pearson Correlation Analysis). Different letters indicate significant difference between the different groups by ANOVA(Tukey’s Method,P＜ 0.05).

2.5 結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子的啟動子區(qū)域順式作用元件分析

為探究轉(zhuǎn)錄因子在光誘導(dǎo)葉綠素合成代謝中的調(diào)控作用, 本研究對9個葉綠素生物合成的結(jié)構(gòu)基因以及6個轉(zhuǎn)錄因子的啟動子序列進(jìn)行了順式作用元件預(yù)測, 結(jié)果表明StUROD等9個結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)域含有多個MYB結(jié)合位點(diǎn), 還存在其他光響應(yīng)元件, 如G-box, I-box、GT1-motif等(圖6-A),而StMYB113等6個轉(zhuǎn)錄因子的啟動子上均含有多個光響應(yīng)元件(圖6-B)。結(jié)合qPCR結(jié)果, 推測MYB轉(zhuǎn)錄因子在光誘導(dǎo)下與結(jié)構(gòu)基因互作, 激活結(jié)構(gòu)基因表達(dá), 從而調(diào)控了葉綠素的合成。

圖6 結(jié)構(gòu)基因(A)和轉(zhuǎn)錄因子(B)的啟動子順式元件預(yù)測Fig. 6 Prediction ofcis-elements in promoters of structural genes (A) and transcription factors (B)

2.6 轉(zhuǎn)錄因子StMYB113對葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因StUROD的調(diào)控

為驗(yàn)證MYB轉(zhuǎn)錄因子通過與結(jié)構(gòu)基因啟動子互作激活其表達(dá), 將MYB轉(zhuǎn)錄因子StMYB113和StMYB-like的CDS序列分別重組到載體ph7lic-CHA中, 將結(jié)構(gòu)基因StUROD和StCHLD的啟動子重組到線性化載體pGREEN0800 II中, 用輔助質(zhì)粒pSoup將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中, 在煙草中利用雙熒光素酶試驗(yàn), 檢驗(yàn)其對結(jié)構(gòu)基因的激活, 結(jié)果表明StMYB113能顯著激活StUROD的表達(dá)(圖7)。

圖7 MYB轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)構(gòu)基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活Fig. 7 Transcriptional activation of structural gene promoter by MYB transcription factorEV代表空載與結(jié)構(gòu)基因的啟動子重組載體共注射煙草; TF代表相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子重組載體與結(jié)構(gòu)基因的啟動子重組載體共注射煙草。星號表示由Student’st測驗(yàn)確定的試驗(yàn)組與空載間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*為P＜ 0.05, **為P＜ 0.01)。EV: the co-injection of tobacco with the empty vector recombinant promoter of the structural gene; TF: the co-injection of tobacco with the transcription factor recombinant vector and the promoter recombinant vector of the structural gene. Asterisks indicate significant difference between EV and respective treatments by Student’st-test (*:P＜ 0.05; **:P＜ 0.01).

3 討論

光照是影響馬鈴薯塊莖綠化的重要因素。在光照條件下, 塊莖表皮下方的薄壁組織細(xì)胞內(nèi)形成完整的葉綠體, 并合成葉綠素[16-17]。顯微成像技術(shù)的發(fā)展使觀察塊莖組織中的質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程成為可能, 為揭示綠化的生理機(jī)制提供依據(jù)[18-20]。本研究中RM-210的塊莖隨著光照時間延長, 塊莖表皮綠化程度逐漸加深(圖1-A), 葉綠素含量持續(xù)增加(圖1-B), 與前人研究結(jié)果一致[21-22]。葉綠素生物合成途徑已經(jīng)比較明確, L-谷氨酰-tRNA在一系列酶的催化下合成葉綠素a, 葉綠素a再經(jīng)葉綠素酸酯a加氧酶氧化形成葉綠素b[23-24], 共涉及到15種酶, 從擬南芥中已經(jīng)分離了27個編碼這些酶的基因[25-26]。Gibson等[27]從擬南芥C24中分離并測序了一個cDNA, 氨基酸序列比對結(jié)果顯示它與葉綠素生物合成的Mg螯合酶bchH高度相似, 命名該基因?yàn)镃HLH, 進(jìn)一步研究表明晝夜循環(huán)過程中該基因的表達(dá)受光誘導(dǎo)控制葉綠素合成。Kumar等[28]將反義HEMA1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中, 抑制了谷氨酰-tRNA還原酶(GluTR)的表達(dá), 減少了下游產(chǎn)物ALA和原葉綠素酸酯的合成, 導(dǎo)致葉綠素含量顯著減低。Okamoto等[4]比較了馬鈴薯綠化敏感品種“King Edward”在不同光源下塊莖中的葉綠素含量和HEMA1、GSA、CHLH和GUN4等4種葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn), 這4個基因在光照下正調(diào)控了葉綠素的生物合成。而本研究結(jié)果表明葉綠素合成途徑上的StGAS1、StCHLD、StCrd1、StHEMA、StGUN4、StPORA、StUROD、StCHLM、StCHLG等9個結(jié)構(gòu)基因在光誘導(dǎo)下明顯上調(diào)表達(dá)并進(jìn)行了定量驗(yàn)證(圖4), 這說明有更多的基因在光誘導(dǎo)下參與了馬鈴薯塊莖葉綠素合成調(diào)控途徑, 這個結(jié)果豐富了結(jié)構(gòu)基因類型認(rèn)識。

光誘導(dǎo)基因大部分是通過光誘導(dǎo)型啟動子來轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 光誘導(dǎo)型啟動子區(qū)域一般都有大量的G-box、I-box、ATCT-motif、CATT-motif、AE-box、box-4、Box I、BOX-II、GT1-motif等類型的光響應(yīng)元件[29], 在馬鈴薯[30]、水稻[31]、擬南芥[32-33]及大豆[34]等多種作物中均有相關(guān)報(bào)道。本研究中StUROD、StCHLM及StCHLG等9個葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因的啟動子序列分析表明啟動子區(qū)域存在大量G-box、GT1-motif、I-box等光響應(yīng)元件和MYB結(jié)合位點(diǎn)(圖6-A), 由此說明, 這些基因可能受光誘導(dǎo)表達(dá)或受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控參與葉綠素合成。

在本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中, 聚類分析表明65個轉(zhuǎn)錄因子與9個葉綠素結(jié)構(gòu)基因聚在一起, 表達(dá)模式相似。進(jìn)一步分析了表達(dá)量較高且顯著上調(diào)的6個轉(zhuǎn)錄因子的啟動子序列, 結(jié)果表明在啟動子區(qū)域存在大量的光響應(yīng)元件, 推測這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可能受到光信號誘導(dǎo)。Wu等[14]研究表明R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SIMYB72直接與葉綠素合成關(guān)鍵酶POR和CHLH互作, 負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)中的葉綠素合成;撒世娟等[15]在馬鈴薯體內(nèi)抑制和過量表達(dá)MYB轉(zhuǎn)錄因子StRSM1發(fā)現(xiàn),StRSM1響應(yīng)光照反向調(diào)控葉綠素積累; Mahjoub等[7]在番茄中超表達(dá)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子VvMYB5b, 降低了葉片的葉綠素含量;Jeong等[35]在水稻中過表達(dá)OsMYBR22, 很大程度上提高了葉片和種子果皮的葉綠素含量, 且藍(lán)光下上調(diào)表達(dá), 由此表明MYB轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控葉綠素的合成。本研究挑選了StMYB-like和StMYB113這2個MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)表明StMYB113可使StUROD在煙草瞬時表達(dá)體系中顯著上調(diào)表達(dá), 證明StMYB113可正向調(diào)控StUROD的表達(dá), 從而影響塊莖綠化過程中葉綠素的合成。此外, 本研究共表達(dá)聚類結(jié)果顯示還有bHLH、ERF等其他家族的轉(zhuǎn)錄因子, 它們也可能直接或間接參與了葉綠素合成調(diào)控, 有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組和共表達(dá)聚類等方法分析了馬鈴薯塊莖綠變過程的差異表達(dá)基因及其表達(dá)模式,篩選出了在葉綠素合成過程中受光誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因以及可能的轉(zhuǎn)錄因子, 并通過轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn),證明了轉(zhuǎn)錄因子MYB113可與葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因StUROD啟動子互作, 并激活其表達(dá), 從而影響光照條件下馬鈴薯塊莖中葉綠素累積。