索海翠 劉計濤 王 麗 李成晨 單建偉 李小波

廣東省農業(yè)科學院作物研究所 / 廣東省農作物遺傳改良重點實驗室, 廣東廣州 510640

人體缺鋅已成為非常普遍的公共健康問題。提高糧食作物可食用部位的鋅含量是緩解人體缺鋅的一條經濟而有效的途徑[1]。馬鈴薯是全球僅次于水稻、玉米和小麥的第四大重要糧食作物, 世界上已經有2/3的人口把馬鈴薯作為主糧消費, 全球每年消費馬鈴薯約為3.0～3.3億噸。中國是世界馬鈴薯生產和消費第一大國[2], 因此提高馬鈴薯塊莖中鋅含量, 對于緩解人體缺鋅的現(xiàn)狀具有積極意義。

鋅以Zn2+或有機復合物的形式從植物根部運輸?shù)饺~肉細胞, 參與各種生理生化過程; 也可以存儲在液泡中,避免過量Zn2+的傷害; 或者通過韌皮部再分配[3]。這些過程都與植物鋅轉運蛋白家族的調控密不可分[4]。因此, 從分子水平研究這些轉運蛋白家族在鋅吸收和分配的動態(tài)平衡中的作用, 有助于增加植物可食用部位的鋅含量。近年在擬南芥[5-12]、水稻[13-16]、苜蓿[4]和番茄[17]等植物中發(fā)現(xiàn)了多種鋅轉運蛋白家族, 并利用酵母互補技術或轉基因手段在水稻[16]、大麥[18-19]、木薯[20]等作物中開展了其調控機制的研究。鋅轉運蛋白家族按其功能不同可分為吸收蛋白和排出蛋白兩大類: 吸收蛋白主要有鐵調控轉運蛋白家族(Zinc-iron transporter protein, ZIP)[21]和自然抗性相關巨噬蛋白家族(Natural resistance associated macrophage protein, NRAMP)[22], 鋅吸收蛋白主要位于細胞質膜上, 功能是將Zn2+等二價陽離子跨膜運轉到細胞內, 參與植物細胞中多種生理生化反應; 鋅排出蛋白包括CDF蛋白家族(Cation diffusion facilitator protein family,CDF)[23]和重金屬ATP酶家族P1B-ATPase (Heavy metal ATPase, HMA)[24]等, 其主要位于細胞質膜和液泡膜上,功能是將Zn2+排出細胞質或運載到液泡進行區(qū)域化隔離,在植物耐受鋅脅迫中起到防御作用[25-26]。鋅轉運蛋白家族基因成員可在植物不同組織, 包括根、莖、葉等部位表達,表明其不僅與根吸收有關, 同時與細胞內鋅的再分配和平衡相關[6,27]。

ZIP轉運蛋白家族廣泛存在于動物、植物、細菌和原生生物中[21]。ZRT1和ZRT2是首次在酵母細胞中發(fā)現(xiàn)的ZIP家族成員[28]。隨后Eide等[5]發(fā)現(xiàn)了IRT1轉運載體的基因。ZIP轉運蛋白的氨基酸序列一般為309～406個序列,具有8個跨膜結構域, 其N末端和C末端均位于細胞膜的外側, 在第III～IV結構域之間一段氨基酸序列稱為可變區(qū), 可變區(qū)是富含His的區(qū)域, 在第IV～V之間是允許金屬離子通過的位點, 在第II～III結構域之間是轉運底物的最初結合位點。ZIP基因家族的功能分析表明, 該基因家族在從胞外向胞內轉運并在胞內進行鋅運輸過程中起重要作用。另外, 其轉運對象也包括其他二價陽離子, 如:Fe2+、Mn2+及Cd2+, 但成員間往往具有不同的轉運對象及專一性[7]。

在馬鈴薯中, 前期通過ZIP家族基因生物信息學分析,鑒定出12個馬鈴薯ZIP基因, 大多數(shù)含有8個跨膜區(qū)域。在III和IV結構域之間, 有一個可變區(qū),StZIP12在可變區(qū)中His的數(shù)量最多, 且低鋅品種的馬鈴薯塊莖中StZIP12表達量受到誘導, 推測StZIP12在馬鈴薯塊莖鋅富集中的作用可能存在潛在作用[29]。本研究在前期研究基礎上, 克隆了馬鈴薯StZIP12基因, 并通過異源酵母互補試驗和遺傳轉化手段證實了StZIP12在體外和體內能夠增強馬鈴薯鋅吸收, 在馬鈴薯鋅富集過程中具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)品種‘粵引85-38’、‘鄂薯3號’, 哥倫比亞型擬南芥[Arabidopsis thaliana(ecotype Columbia)], super1300植物雙元表達載體, pJG4-5(pB42AD)酵母表達載體, pCAMBIA2300N植物表達載體均由本實驗室保存。酵母野生型菌株: (WT)DEY1457, 鋅吸收障礙突變體酵母菌株(zrt1zrt2) ZHY3 (MATα ade6 can1 his3 leu2 trp1 ura3 zrt1::LEU2 zrt2:: HIS3)由David Eide, Ph.D. Professor and Chair, Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison贈與。

1.2 基因克隆及載體構建

根據(jù)文獻[29]和馬鈴薯基因組網站(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml)結合, 在參考序列5′UTR和3′UTR兩端設計2條基因特異引物StZIP12-F1:5′-GAAAGAATTTCATTCCCTCGACCCC-3′和StZIP12-R1:5′-ATAATTGCTTGCTTGGCTGATTTT-3′, 進行PCR擴增。將StZIP12的開放閱讀框(open reading frame, ORF)構建到super1300～GFP雙元表達載體上, 最終形成super:GFP～StZIP12載體。StZIP12的編碼區(qū)(ORF)構建到pCAMBIA2300～35S載體上, 形成35S:StZIP12。將StZIP12的ORF構建到酵母表達載體pJG4-5 (pB42AD)。

1.3 實時熒光定量PCR

定量PCR儀為CFX96 (美國Bio-Rad公司), 預混液使用SYBR Premix ExTaqII (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)。反應為25 μL, 其中1 μL cDNA作為模板。程序為兩步法:95℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 共39個循環(huán)。EF1-α作為內參基因。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt方法。

1.4 亞細胞定位

取短日照培養(yǎng)4～5周的擬南芥蓮座葉片, 去掉葉脈取中間部位, 將葉片切成1 mm左右的細葉條, 然后置于預先備好的酶解液中, 使切好的葉條可以與酶液充分接觸;用黑色塑料袋包裹燒杯, 置于水平搖床上, 以60轉 min-1的轉速消化3～4 h, 此時, 酶液由褐色變?yōu)榫G色, 鏡檢酶解效果, 擬南芥葉肉原生質體直徑約為30～50 μm; 用300目的網篩過濾包含有原生質體的酶液于圓底離心管中,36×g離心1～2 min; 去掉上清, 加預冷的W5溶液, 緩緩懸起原生質體, 36×g離心再沉淀1～2 min; 輕輕吸取上清, 加入適量預冷的W5溶液, 使原生質體濃度達到1×105～2×105mL-1, 冰上放置30 min; 60×g離心1 min, 以1×105～2×105mL-1濃度重懸于MMg溶液; 取20 μL質粒DNA于1.5 mL的離心管中, 加200 μL的原生質體(4×104個原生質體), 輕輕混勻; 加入220 μL的PEG/Ca2+溶液, 輕輕混勻, 23℃放置15～30 min; 加入800 μL的W5溶液, 充分輕輕混勻; 2×g離心1 min, 去掉PEG; 輕輕重懸原生質體于1 mL的W5溶液中; 放于23℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng), 12～16 h之后CCD觀察。

1.5 酵母功能互補

將酵母突變體菌株ZHY3 (zrt1zrt2) (MATα ade6 can1 his3 leu2 trp1 ura3 zrt1::LEU2 zrt2::HIS3)接種到YPD培養(yǎng)基上28℃活化2 d; 挑取生長良好的單菌落用三角瓶加入25.0 mL YPD液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng), 搖菌8～12 h (28℃,200轉 min-1)至OD600=1.0; 660×g(25℃)離心5 min去上清, 用25.0 mL無菌水震蕩懸浮清洗酵母菌, 再次離心5 min去上清; 加入25.0 mL無菌水震蕩懸浮, 吸取1.0 mL菌液到無菌的1.5 mL離心管中; 2656×g離心5 min, 棄上清;用100 μL one-step buffer懸浮; 加入6 μL預先沸水浴20 min的鮭魚精; 1 μg載體DNA (空載、融合或報告子)渦旋混合均勻; 45℃水浴30 min, 每隔10 min渦旋一次; 取約200 μL懸浮液涂布在SD-Trp選擇培養(yǎng)基上, 28℃暗培養(yǎng)2～3 d; 待長出白色單菌落后, 挑取菌落進行PCR驗證,獲得陽性轉化菌株; 將鑒定好的轉化菌株加入10 mL液體SD-Trp培養(yǎng)基28℃, 200轉min-1培養(yǎng)至OD600=1.0; 將各菌株的菌液按照細胞濃度分別做10-1、10-2、10-3、10-4濃度梯度稀釋; 取各菌液2.5 μL, 按照順序將菌液分別滴在含Zn2+、Zn2++2 mmol L-1EGTA、Zn2++5 mmol L-1EGTA、Zn2++7.5 mmol L-1EGTA的SD-Trp酵母異源功能互補驗證的培養(yǎng)基上, 28℃培養(yǎng)2～3 d; 觀察并記錄個菌株的生長情況, 照相記錄。

1.6 馬鈴薯遺傳轉化及轉基因植株缺鋅處理

采用的農桿菌菌株為GV3101, 受體材料為馬鈴薯鄂薯3號, 具體方法參考文獻[30]。

轉基因組培苗處理: 采用莖段培養(yǎng)的方式將轉基因和對照植株分別轉入無鋅和正常鋅培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基中,放入人工氣候箱(溫度25 ℃/ 18 ℃,光照16 h/8 h), 培養(yǎng)20 d后, 每個處理各取5株進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和鋅含量測定。

轉基因植株沙培處理: 取生根21 d的馬鈴薯轉基因植株和對照植株, 放入去離子水中蓋上保鮮膜平衡2 d, 然后移栽到裝有石英砂的花盆中, 放入人工氣候箱中進行培養(yǎng)。每隔3 d分別施入Hoagland營養(yǎng)液和無鋅Hoagland營養(yǎng)液, 直到收獲。每個處理各取5株進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和鋅含量測定。

1.7 鋅含量測定

收獲后, 塊莖在65℃下干燥1周。25.0 mg樣品分別用5.0 mL HNO3和1.0 mL HClO4在150℃下消化5 h。采用ZA3300型火焰原子吸收分光光度計(日本日立公司;波長為213.856)進行鋅含量測定。

2 結果與分析

2.1 StZIP12基因的克隆及跨膜結構域分析

利用前人研究的StZIP12基因序列, 設計特異引物進行擴增和測序。結果表明,StZIP12基因全長1820 bp(圖1-A), 包含245 bp的5′UTR, 351 bp的3′UTR, 編碼區(qū)長度為1224 bp, 編碼含有407個氨基酸的蛋白(圖1-B)。進一步利用 CCTOP (http://cctop.enzim.ttk.mta.hu/?Ref=labworm)軟件對StZIP12蛋白在細胞中的跨膜結構域進行分析, 預測到8個跨膜結構域, 在第3和第4個跨膜結構域之間有1個長環(huán)區(qū)(圖1-C)。

圖1 StZIP12基因的克隆及跨膜結構域分析Fig. 1 Cloning and transmembrane domain analysis of StZIP12 geneA: StZIP12基因的分離; 1、2、3泳道均為馬鈴薯StZIP12基因, M為DL2000 DNA marker。B: StZIP12序列分析, 灰色字母代表氨基酸序列。C: StZIP12跨膜結構域分析, 黃色區(qū)域代表跨膜結構部分, 灰色區(qū)域代表細胞膜。A: the isolation of StZIP12 gene. Lane 1, 2, and 3 are all potato StZIP12 genes. M2000 is DL 2000 DNA marker. B: the sequence analysis of StZIP12, gray letters in the background represent amino acid sequences. C: StZIP12 transmembrane domain analysis. The yellow area represents the transmembrane structure and the gray area represents the cell membrane.

2.2 StZIP12蛋白亞細胞定位

為確定 StZIP12蛋白在細胞內的定位, 構建了StZIP12基因的瞬時表達載體進行亞細胞定位。結果表明,GFP空載的信號存在于整個細胞, 而GFP-StZIP12融合蛋白主要存在于細胞膜上(圖2)。因此,StZIP12基因編碼的是一個細胞膜定位的蛋白。

圖2 StZIP12蛋白亞細胞定位在細胞膜上Fig. 2 StZIP12 protein is subcellular localized on the cell membrane標尺為50 μm。Bar: 50 μm.

2.3 StZIP12基因表達特性分析

分析StZIP12基因在新葉、老葉、根、莖、匍匐莖、小薯以及成熟薯中的表達量發(fā)現(xiàn),StZIP12在馬鈴薯各組織中均有表達, 且在新葉中表達量顯著高于其他組織, 其次為老葉和根, 在薯塊中表達量最低(圖3-A)。

分析不同濃度鋅溶液噴施處理下StZIP12的表達模式發(fā)現(xiàn), 隨著噴施鋅濃度的增大,StZIP12的表達量逐漸受到抑制(圖3-B)。

圖3 StZIP12的表達分析Fig. 3 Relative expression pattern of StZIP12 genes誤差線代表標準誤, 多重比較采用Duncan分析法, 不同小寫字母代表顯著水平(P ＜ 0.05)。Error bar represents standard error. Duncan’s analysis method is used for multiple comparisons. Different lowercase represents significant difference at P ＜ 0.05.

2.4 StZIP12異源酵母功能互補分析

為明確StZIP12蛋白對于鋅吸收的功能, 構建StZIP12酵母表達載體StZIP12-pJG4-5, 轉化到鋅吸收障礙突變體(zrt1zrt2)ZHY3中, 空載體作為對照。在培養(yǎng)基上進行不同鋅濃度處理。結果顯示, 轉入空載體的鋅吸收缺陷型酵母突變體zrt1 /zrt2隨著菌液稀釋倍數(shù)的增大和鋅吸收障礙螯合劑EGTA濃度的增加, 生長受到抑制; 與對照相比, 轉StZIP12的酵母突變體表現(xiàn)出較好的生長狀態(tài)(圖4)。表明馬鈴薯StZIP12在鋅吸收缺陷型酵母突變體zrt1 /zrt2中能夠恢復其對Zn的吸收, 證明StZIP12在Zn吸收過程中起著重要的作用。

(圖4)

圖4 StZIP12對酵母鋅吸收障礙突變體功能互補Fig. 4 Functional complementation of StZIP12 to yeast zinc uptake deficient mutantVC: 空載體對照; 10-1～10-4代表菌液稀釋濃度。VC: the empty vector controls; 10-1-10-4 represent the dilution concentration of bacterial solution, respectively.

2.5 過量表達StZIP12增加馬鈴薯鋅含量

為進一步驗證StZIP12的功能, 構建過量表達載體并利用農桿菌進行遺傳轉化, 共獲得7株陽性植株(圖5)。

圖5 轉基因株系定量PCR檢測Fig. 5 Detection of transgenic lines by qRT-PCRES3: 非轉基因對照; OE-26、OE-27、OE-28、OE-31、OE-32、OE-47、OE-67為過表達株系。ES3: non transgenic control; OE-26, OE-27, OE-28, OE-31, OE-32,OE-47, and OE-67 are overexpressed StZIP12 lines.

對轉基因株系及對照植株的組培苗進行缺鋅處理發(fā)現(xiàn), 在正常鋅培養(yǎng)條件下, 轉基因株系OE-26和OE-31與對照ES3在總根長、地上部株高上差異不顯著。在缺鋅培養(yǎng)條件下, 轉基因株系OE-26和OE-31與對照ES3在地上部株高和總根長上差異顯著, 且在地上部和根部鮮重上OE-26顯著高于ES3。對地上部和根部鋅含量進行測定發(fā)現(xiàn), 在正常鋅培養(yǎng)條件下, 轉基因株系OE-26和OE-31與對照ES3鋅含量差異不顯著。缺鋅處理顯著降低了轉基因株系和對照植株的地上部和根部鋅含量。但在缺鋅培養(yǎng)條件下, OE-26地上部和根部鋅含量顯著高于對照植株, OE-31地上部和根部鋅含量也略高于對照植株, 但差異未達顯著水平(圖6-A)。

根體積能反映根粗。對總根體積進行分級發(fā)現(xiàn), 在缺鋅處理下, 對照植株V＞0.400的體積比由63%降低到20%,0.000＜V≤0.100的體積比由4%上升到16%; 而OE-26和OE-31兩個株系的根體積比變化不大, V＞0.400的體積比分別為77%和58%, 0.000＜V≤0.10的體積比分別為2%和4%。說明在缺鋅處理下, 2個轉基因株系生長所受影響較小(圖6-B, C)。

(圖6)

圖6 缺鋅處理下馬鈴薯轉基因組培苗的表型及鋅含量Fig. 6 Phenotype and zinc content of potato transgenic tissue culture seedlings under zinc deficiency treatmentsA: 植株表型及鋅含量分析, 誤差線代表標準誤, 多重比較采用Duncan分析法, 不同小寫字母代表顯著水平(P ＜ 0.05)。B: 植株表型圖片; C: 根體積分級。CK: 正常鋅; -Zn: 缺鋅處理。A: plant phenotype analysis. Error bar represents standard error. Duncan’s analysis method is used for multiple comparisons. Different lowercase represents significant difference at P ＜ 0.05. B: plant phenotype; C: the classification of root volume. CK: the normal zinc treatment;-Zn: zinc deficiency treatment.

為進一步探究StZIP12在馬鈴薯塊莖鋅吸收過程中的功能, 本研究采用了石英砂培養(yǎng)下的鋅處理試驗。結果表明, 在正常鋅濃度條件下, 過表達株系植株高度低于對照植株, 其中OE-31與對照差異顯著; 但在塊莖鋅含量上,轉基因株系與對照植株差異不顯著。在缺鋅培養(yǎng)下, 2個過表達株系的塊莖鋅含量高于對照, 分別比對照提高22.00%和32.95%, 且差異達到顯著水平(圖7)。

圖7 正常和缺鋅處理下下轉基因馬鈴薯植株表型、株高和鋅含量Fig. 7 Phenotype, plant height, and zinc content of transgenic lines under zinc deficiency treatmentCK: 正常鋅; -Zn: 缺鋅處理。誤差線代表標準誤, 多重比較采用Duncan分析法, 不同小寫字母代表顯著水平(P ＜ 0.05)。CK: normal zinc treatment; -Zn: zinc deficiency treatment. Error bar represents standard error. Duncan’s analysis method is used for multiple comparisons. Different lowercase represents significant difference at P ＜ 0.05.

3 討論

植物吸收鋅主要分為3個階段, 即鋅的吸收、轉運和儲存。這些過程與植物鋅轉運蛋白密不可分, 按鋅轉運蛋白家族功能的不同可分為吸收蛋白和排出蛋白, ZIP家族屬于吸收蛋白家族, 該家族的基因表達變化會影響鋅的吸收和分配。迄今為止, 從植物中發(fā)現(xiàn)鑒定的ZIP家族成員大約有100多個, 并對其功能進行了研究[31]。

據(jù)報道, 擬南芥中存在15個ZIP家族成員, At-ZIP1～AtZIP12和AtIRT1～AtIRT13[7]。IRT1和ZRT1是最早被分離出來的ZIP家族成員。IRT1是擬南芥在缺鐵條件下在根部表達的一種蛋白, 主要參與了擬南芥在根系對鐵離子吸收的生理生化過程[5]。ZRT1和ZRT2分別是酵母中Zn2+吸收和轉運的高、低親和轉運蛋白, 參與了Zn2+的跨膜運輸[28]。最近在擬南芥中新發(fā)現(xiàn)一個鋅轉運蛋白AtZNE1, 亞細胞定位于高爾基體上, 對于葉片中鋅離子濃度的平衡起到重要作用[6]。水稻是研究ZIP基因較多的作物之一, 共預測出17個ZIP家族成員。異源酵母互補雜交試驗已經驗證了OsIRT1、OsIRT2、OsZIP1～OsZIP5、OsZIP7～OsZIP9等家族成員均具有轉運鋅和鐵的功能[15,21,32], 且研究表明OsZIP5和OsZIP9在鋅和鈣的吸收上表現(xiàn)出協(xié)同作用[33]。此外, 還鑒定和研究了ZIP家族成員在其他物種中的功能, 如大麥[18]、玉米[34]。目前在馬鈴薯中, 共鑒定到了12個ZIP轉運蛋白StZIP1～StZIP12, 且發(fā)現(xiàn)StZIP12在可變區(qū)中His的數(shù)量最多, 暗示它具有很強的金屬離子結合能力。缺鋅條件下, 在高、低鋅品種(系)馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)了4個差異表達基因StZIP6、StZIP9、StZIP11和StZIP12, 這4個基因在高鋅品種中表達量增加, 而在低鋅品種中表達量減少, 其中,StZIP12的表達水平最高, 分別是StZIP6和StZIP9的5倍和12倍以上, 推測StZIP12在馬鈴薯塊莖鋅富集中的作用可能更為顯著[29]。

本研究克隆了StZIP12基因, 表達模式分析顯示其在馬鈴薯所有組織中均有表達, 尤其在新葉中表達量最高,且受低鋅誘導。異源酵母互補試驗證實了StZIP12基因能夠互補鋅吸收障礙突變體ZHY3(zrt1/zrt2)的功能, 說明了StZIP12基因在體外具有鋅吸收的功能。與前人在擬南芥[5]、水稻[15,21,32]、柑橘[35]的研究結果一致。此外利用轉基因手段, 過表達StZIP12基因于馬鈴薯品種鄂薯3號,提高了轉基因組培苗的鋅含量和轉基因植株塊莖的鋅含量, 表明StZIP12在鋅的吸收和富集過程中起著重要的功能。這與前人研究基本一致。如過量表達AtZIP1提高木薯根部鋅含量9倍以上[20]。過量表達AtZIP1提高了大麥種子鋅含量2倍以上[19]。在水稻中,OsZIP1的異位表達提高了煙草和小米中的鋅含量[36],OsZIP4、OsZIP5、OsZIP8和OsZIP9的超表達都顯著提高了根部鋅的富集, 降低了植株地上部分的鋅含量[14,16,37]。OsZIP4的過量表達于甘薯塊根鋅含量提高[39]。OsZIP7對鋅在根系木質部卸載和節(jié)部的維管束間轉移中起著不可或缺的作用, 優(yōu)先向正在發(fā)育的組織和水稻籽粒輸送鋅[40]。過量表達OsZIP7于擬南芥, 轉基因植株地上部鋅含量提高了25%[41]。