晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者外泌體PD-1/PD-L1 的表達(dá)與PD-1 單抗免疫治療效果的關(guān)系

沈輝，陸坤，陳茜，辛勇

食管癌為癌癥相關(guān)性死亡的第6 大主要原因，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，給人類(lèi)的健康帶來(lái)巨大威脅［1］。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一種常見(jiàn)的食管癌病理類(lèi)型，約占食管癌的90%［2］。近年來(lái)，隨著免疫治療的快速發(fā)展，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在胃癌等多種惡性腫瘤的療效已被證實(shí)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑主要針對(duì)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4（cytotoxic T lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）、程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death receptor 1，PD-1）、PD 配體1（PD-ligand 1，PD-L1）［3］。PD-1 主要分布于NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞以及T細(xì)胞中，PD-L1 可與PD-1 結(jié)合來(lái)抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮增強(qiáng)局部抗腫瘤功能［4］。免疫檢查點(diǎn)抑制劑納武單抗為抗PD-1 IgG4 單克隆抗體，其在非小細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、ESCC 等多種惡性腫瘤中取得良好療效，但部分患者5 年生存率仍不甚理想［5］。外泌體為一種細(xì)胞外囊泡（直徑為30～100 nm），腫瘤早期大量外泌體會(huì)進(jìn)入循環(huán)細(xì)胞，檢測(cè)外泌體上PD-1、PD-L1 有助于疾病的精準(zhǔn)治療與早期診斷［6］。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)晚期ESCC 患者外泌體PD-1/PD-L1的表達(dá)與PD-1 單抗免疫治療效果的關(guān)系的研究較少，為此，本研究選取收治的95 例晚期ESCC 患者進(jìn)行研究。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年2 月至2021 年11 月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院收治的95 例晚期ESCC 患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合《中國(guó)早期食管鱗狀細(xì)胞癌及癌前病變篩查與診治共識(shí)（2015 年，北京）》［7］中ESCC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)；（2）均行PD-1 單抗免疫治療；（3）至少有1 個(gè)可測(cè)量病灶；（4）預(yù)計(jì)生存期＞3 個(gè)月；（5）美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組活動(dòng)狀態(tài)評(píng)分0～1 分；（6）均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移；（2）活動(dòng)性感染；（3）獲得性或先天性免疫功能缺陷；（4）合并其他類(lèi)型惡性腫瘤者；（5）有自身免疫疾病史；（6）肝腎等臟器功能不全者；（7）間質(zhì)性肺炎；⑧伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 95 例患者均接受PD-1 單抗免疫治療。靜脈輸注卡瑞利珠單抗（批準(zhǔn)文號(hào)：S20190027，蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司，規(guī)格為200 mg/支）1 支/次，靜脈輸注時(shí)間大于30 min，每3 周1 次，持續(xù)用藥至患者不能耐受或疾病進(jìn)展。

1.2.2 外泌體PD-1、PD-L1 的表達(dá)的檢測(cè)方法 通過(guò)乙二胺四乙酸抗凝管采集患者4 ml 靜脈血，于4 ℃下2 000 g 離心20 min，取上清液（血漿）用1.5 ml EP 管分裝，于-80 ℃冰箱中保存，通過(guò)超速離心法從血漿中分離外泌體（離心半徑為8 cm），首先300 g離心10 min，隨后2 000 g 離心10 min，然后10 000 g離心30 min，最后將上清液100 000 g 離心70 min，離心完成后將外泌體重懸于磷酸鹽緩沖液中，于-80 ℃冰箱中保存。采用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）測(cè)定表型，圈出CD14 單核細(xì)胞門(mén)，建立針對(duì)CD14-FITC/PD-1-PE 與CD14-FITC/PD-L1-PE 的峰圖，分析外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率。

1.2.3 治療效果判定 治療3 個(gè)療程后，參照《實(shí)體瘤免疫治療療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》［8］，根據(jù)患者治療效果分為有效組（n=43）與無(wú)效組（n=52）。完全緩解：原病灶及臨床癥狀消失，且持續(xù)超過(guò)4 周，部分緩解：原病灶縮?。?0%，臨床癥狀明顯改善，且持續(xù)超過(guò)4 周，疾病穩(wěn)定：原病灶增幅≤25% 或增大≤50%，臨床癥狀未見(jiàn)減輕，且持續(xù)超過(guò)4 周，疾病進(jìn)展：原病灶增大＞25%或出現(xiàn)新病灶，臨床癥狀?lèi)夯Ｆ渲?，部分緩解與完全緩解記為有效；疾病進(jìn)展與疾病穩(wěn)定記為無(wú)效。

1.2.4 收集資料 收集可能影響晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的危險(xiǎn)因素，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕?、高脂血癥、糖尿?。⒛[瘤最大直徑、腫瘤部位（頸椎、胸椎、腹部）、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、T 分期、分化程度、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、細(xì)胞角蛋白19 片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen21-1，Cyfra21-1）、外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較有效組與無(wú)效組的臨床資料；（2）分析晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的危險(xiǎn)因素；（3）分析外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率對(duì)晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 有效組與無(wú)效組的臨床資料比較

無(wú)效組年齡、低分化例數(shù)占比、CEA、外泌體PD-1 表達(dá)率和PD-L1 表達(dá)率高于有效組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 有效組與無(wú)效組晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床資料比較

2.2 晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的危險(xiǎn)因素

以年齡、分化程度、CEA、外泌體PD-1 表達(dá)率、PD-L1 表達(dá)率為自變量（賦值情況：年齡、CEA、外泌體PD-1 表達(dá)率、PD-L1 表達(dá)率為連續(xù)變量；分化程度：低分化=1，中高分化=0），以晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療效果為因變量進(jìn)行Logistic 多因素回歸分析（賦值情況：無(wú)效=1，有效=0），結(jié)果顯示，年齡、低分化、外泌體PD-1 表達(dá)率、PD-L1 表達(dá)率為晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率對(duì)晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線結(jié)果顯示，外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率預(yù)測(cè)晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的AUC 值（95%CI）分 別 為0.785（0.689～0.863）、0.706（0.604～0.795），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率對(duì)晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

晚期ESCC 已錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)間，臨床上常采用化療來(lái)提高患者的生存率。PD-1 單抗免疫治療為一種新型的惡性腫瘤治療模式，其在ESCC、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中取得良好效果［9］。但部分患者的腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)多種機(jī)制來(lái)逃避免疫殺傷，嚴(yán)重影響PD-1 單抗免疫治療效果［10］。PD-1能夠調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞凋亡與活化；PD-L1 通常表達(dá)于腫瘤中活躍的T 細(xì)胞炎癥區(qū)域中，其在免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)能夠抑制T 細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)［11］。臨床研究表明，外泌體PD-1/PDL1 表達(dá)與多種惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，然而二者可用于評(píng)估接受PD-1 單抗免疫治療的ESCC 患者的效果目前尚不清楚，鑒于此，本研究特采用前瞻性研究進(jìn)行分析，期望為指導(dǎo)臨床治療提供一定的參考價(jià)值［12］。

本研究結(jié)果顯示，無(wú)效組年齡、低分化例數(shù)占比、CEA、外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率高于有效組，Logistic 多因素回歸分析結(jié)果顯示，年齡、低分化、外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率為晚期ESCC 患者PD-1單抗免疫治療無(wú)效的危險(xiǎn)因素。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體的免疫功能逐漸下降，年齡較高的晚期ESCC患者免疫功能較低，即使采用PD-1 單抗免疫治療，其預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)仍然較高。低分化的晚期ESCC患者腫瘤惡性程度高，臨床治療難度較高，多數(shù)患者治療效果不佳。外泌體PD-L1 為PD-1 單抗免疫治療的重要靶點(diǎn)，其可與PD-1 結(jié)合，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，使T 細(xì)胞無(wú)法正?；罨种艭D4+T 細(xì)胞功能，從而影響患者抗腫瘤作用［14］。相關(guān)研究表明，外泌體PD-L1 能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)［15-16］。相關(guān)研究表明，在抗PD-1 治療前檢測(cè)黑色瘤患者外泌體PD-L1 蛋白，結(jié)果顯示，低水平外泌體PD-L1 蛋白的患者通常表現(xiàn)為部分應(yīng)答或完全應(yīng)答，而對(duì)治療無(wú)響應(yīng)的患者外泌體PD-L1 蛋白水平一般很高［17］。另有研究表明，外泌體外泌體PD-L1mRNA 表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤患者抗PD-1 治療響應(yīng)密切相關(guān)，經(jīng)PD-1單抗治療后，病情穩(wěn)定組外泌體PD-L1mRNA 表達(dá)水平降低不明顯，而響應(yīng)組外泌體PD-L1mRNA 表達(dá)水平明顯下降，而病情惡化組PD-L1mRNA 表達(dá)水平異常升高［18］。既往研究證實(shí)，Cyfra21-1、CEA等腫瘤標(biāo)志物可用于評(píng)估和診斷ESCC 進(jìn)展，然而生物標(biāo)志物靈敏度較低［19-20］，本研究結(jié)果未證實(shí)Cyfra21-1、CEA 與PD-1 單抗免疫治療效果密切相關(guān)，可能與樣本量、病情嚴(yán)重程度等因素有關(guān)。此外，本研究結(jié)果顯示，外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)率預(yù)測(cè)晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無(wú)效的AUC 值（95%CI）分 別 為 0.785（0.689～0.863）、0.706（0.604～0.795），提示晚期ESCC 患者外泌體PD-1、PD-L1 表達(dá)可用于評(píng)估PD-1 單抗免疫治療效果，值得推廣使用。

綜上所述，晚期ESCC 患者外泌體PD-1、PD-L1表達(dá)在預(yù)測(cè)PD-1 單抗免疫治療效果中具有重要價(jià)值。然而，本研究納入病例較少，仍需擴(kuò)大樣本，進(jìn)一步證實(shí)研究結(jié)果。