一份矮稈玉米表型鑒定和基因初步定位

唐 蘭,張艷茹,邱貴蘭,李若楠,趙 麗,吳元奇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 玉米研究所,四川 成都 611130)

玉米(ZeamaysL.)是全球及我國(guó)第一大糧食作物,是一種典型的集糧、經(jīng)、飼、能、醫(yī)于一體的多元作物[1-2]。玉米種質(zhì)資源具有較強(qiáng)的適應(yīng)性、抗逆性等特點(diǎn),是確保我國(guó)糧食穩(wěn)產(chǎn)和增產(chǎn)的壓艙石,在我國(guó)糧食安全和能源安全中扮演著至關(guān)重要的角色。株高是玉米育種過程中最重要的農(nóng)藝性狀之一,玉米株高若過高則容易倒伏、倒折而造成減產(chǎn),矮稈玉米的增產(chǎn)性得益于株型緊湊、抗倒伏能力強(qiáng)、適宜高密度種植和群體光合利用率高。因此,育種家提出,玉米的理想株型是指中稈或者中矮稈、葉面積適中、葉夾角小、穗型好、莖稈堅(jiān)韌等特點(diǎn)[3-4],培育出矮稈、高產(chǎn)密植的玉米品種是提高玉米產(chǎn)量的重要手段之一[5]。

20世紀(jì)60年代以后,矮稈和半矮稈的使用極大提高了作物產(chǎn)量,并且爆發(fā)了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的第一次“綠色革命”。1935年Emerson發(fā)現(xiàn)的玉米矮稈基因br2是目前研究與使用最廣泛的玉米矮生基因[6-7],br2矮稈基因的特點(diǎn)是使玉米莖節(jié)明顯縮短,尤其是果穗以下莖節(jié)位點(diǎn)越低,縮短越顯著。研究表明,矮稈性狀的使用,培育出了抗倒性和耐密性的新一代玉米矮稈品種[8-9]。目前,已鑒定的玉米矮稈基因有60多個(gè),除D8、D9、D8-1023、D*-10、D11、Dt為顯性單基因控制外,其余大多數(shù)為隱性單基因[10-15],與不良性狀連鎖,或者一因多效,能夠直接應(yīng)用于育種的矮稈基因很少。因此,新矮稈資源的鑒定和新矮稈基因的篩選或克隆,對(duì)矮化育種仍然具有十分重要的意義。

本研究在吳元奇課題組前期關(guān)于該材料育種潛勢(shì)及遺傳模式研究的基礎(chǔ)上,鑒定出該矮稈有較好的單株產(chǎn)量配合力,具有極大的育種潛力價(jià)值,因此對(duì)dwarf-12和d8227矮稈進(jìn)行表型差異分析,以及d8227矮稈基因的遺傳分析和基因初步定位,從而確定d8227的利用價(jià)值,豐富矮稈種質(zhì)資源庫,從而為培育出產(chǎn)量高、抗倒伏的玉米品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及來源

試驗(yàn)材料為矮稈d8227和dwarf-12,以及矮稈dm676、Na360、125d、123d,玉米高稈自交系CA345、DR894、ZNC442、F910,構(gòu)建d8227×ZNC442、d8227×F910、DR894×d8227、CA345×d8227的F1、F2和BC1。矮稈自交系d8227是將dwarf-12和普通白玉米雜交得到矮稈玉米,經(jīng)過多代回交和自交,得到穩(wěn)定遺傳的矮稈自交系,dwarf-12是由矮稈高粱和本地玉米通過多次遠(yuǎn)緣雜交,得到的矮稈材料,研究發(fā)現(xiàn)[16],dwarf-12的親本矮稈高粱可能是當(dāng)時(shí)美國(guó)流通較廣的由dw3基因控制的矮稈高粱,與br2基因?yàn)榈任换?但試驗(yàn)沒進(jìn)行更深入的研究,由于其表型優(yōu)良,因此重新組配選育出優(yōu)良的矮稈材料d8227,進(jìn)行更深入的研究。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 矮稈農(nóng)藝性狀調(diào)查 將d8227與親本dwarf-12,分別種植8行,密度49 500株/hm2,行距0.75 m,寬5 m,一行10穴,去掉兩邊2行和頭尾2穴,一共調(diào)查48株,在抽雄株高穩(wěn)定后,調(diào)查株高、穗位高、葉夾角、葉長(zhǎng)葉寬、莖節(jié)長(zhǎng)度、葉面積等[17]性狀(各性狀具體測(cè)定方法參照國(guó)家普通玉米品種區(qū)域試驗(yàn)調(diào)查項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)),用t檢驗(yàn)性狀差異顯著性。

1.2.2 石蠟切片細(xì)胞觀察 種植d8227和矮稈dwarf-12,待其株高穩(wěn)定后,取其穗上、穗位、穗下橫切、縱切的莖節(jié)組織,取樣后迅速放入FAA固定液中,采用石蠟切片方法[18],用顯微鏡觀察并拍攝相同區(qū)域的圖片,參照劉小銳等[19]、張選等[20]的測(cè)量葉片面積的方法,利用Image J軟件測(cè)量相同區(qū)域細(xì)胞面積,一共測(cè)量40個(gè),用t檢驗(yàn)來進(jìn)行比較。

1.2.3 矮稈d8227遺傳模式分析 將d8227和F910、ZNC442、CR894、CA345分別雜交,其中和F910、ZNC442雜交是以d8227為母本,和CA345、CR894雜交是以8227為父本,在廣西種植d8227和F910、ZNC442組配的F2群體,分別種植1 000～2 000株,在云南種植CA345、DR894和d8227雜交F2群體和構(gòu)建的所有BC1群體,分別種植200～400株。成株后調(diào)查F2、BC1中高株和矮株株數(shù),用卡方檢驗(yàn),計(jì)算其分離比率。由于雙親中有主效基因和微效基因,處于雙親中間的株高由微效基因控制,由于群體的不同,因此劃分界限也不同,對(duì)于F2群體159 cm以下為矮稈,180 cm以上為高稈,回交群體以179 cm以下為矮稈,180 cm以上為高稈。

1.2.4 矮稈d8227基因初步定位

1.2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將矮稈d8227和高稈玉米ZNC442雜交獲得F1,F1自交得到F2,收種種植F2群體,并在玉米抽雄株高穩(wěn)定時(shí)取葉片,取穗位以上較嫩葉片,取群體中的高株30株和矮株30株以及親本,取樣時(shí)利用液氮和干冰保存保證樣本的新鮮,用CTAB法提取DNA[21],提取的DNA等摩爾濃度混合,構(gòu)建子代混池。

1.2.4.2 DNA檢測(cè)與建庫 對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)。將8 g瓊脂糖溶解在100 mL TBE中,加入適量的核酸染色劑。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA,驗(yàn)證DNA的純度。

建庫的主要步驟是采用TruSeq庫構(gòu)建工具包進(jìn)行建庫。DNA片段經(jīng)末端修復(fù)、加polyA尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)展等步驟,完成了文庫的構(gòu)建。文庫構(gòu)建完成后,首先用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量,稀釋文庫至1 ng/μL,其次用Agilent 2100檢測(cè)文庫的插入片段大小(Insert size)。插入片段大小達(dá)到期望后,通過Q-PCR方法準(zhǔn)確定量文庫的有效濃度 (文庫有效濃度>2 nmol/L),來確保文庫質(zhì)量。庫檢合格后,根據(jù)有效濃度和目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求對(duì)不同文庫pooling,然后進(jìn)行Illumina HiSeq TM PE150測(cè)序。

1.2.4.3 測(cè)序結(jié)果與參考基因組對(duì)比 利用FASTQ軟件[22],對(duì)下機(jī)獲得的Raw data原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,去除里面帶接頭、低質(zhì)量的read并得到Clean reads,后面分析均基于Clean reads。去除單端測(cè)序read中N含量超過此read長(zhǎng)度比例的10%時(shí)和單端測(cè)序read中低質(zhì)量(Q?5)堿基數(shù)超過該條read長(zhǎng)度比例的50%時(shí)的Paired reads。

根據(jù)BWA軟件[23](參數(shù):mem-t 4-k 32-M)將得到的有效測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean data)比對(duì)到參考基因組上(B73-V4版本),其比對(duì)結(jié)果經(jīng)SAMTOOLS去除重復(fù)(參數(shù):rmdup)。

通過比對(duì)結(jié)果進(jìn)行SNP的檢測(cè)及注釋,采用GATK軟件[24]的Unified Genotyper模塊檢測(cè)多個(gè)樣本SNP和InDel,利用VariantFiltration進(jìn)行質(zhì)控,參數(shù)為--clusterWindowSize 4,--filterExpression“OD<4.0‖MQ<40.0”,-G_filter“GQ<20”。SNP和InDel檢測(cè)結(jié)果利用ANNOVAR進(jìn)行注釋。

1.2.4.4 子代SNP/InDel頻率計(jì)算和基因候選區(qū)間分析 篩選2個(gè)親本之間純和差異的多態(tài)性,以親本中篩選出來的多態(tài)性為基礎(chǔ),分析計(jì)算2個(gè)子代在多態(tài)位點(diǎn)的SNP-index(即SNP的頻率)和InDel-index(即InDel的頻率)?；赟NP和InDel標(biāo)記,為了不忽略微效QTL的影響,在全基因組范圍內(nèi),選擇2個(gè)子代池中SNP、InDel差異大的位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)。對(duì)計(jì)算出SNP-index后的多態(tài)性位點(diǎn)和子代混池缺失的位點(diǎn)進(jìn)行過濾,以減小測(cè)序錯(cuò)誤和比對(duì)錯(cuò)誤造成的影響。選擇95%置信水平作為篩選閾值,超過95%置信水平的窗口作為候選區(qū)間。當(dāng)提取ANNOVAR的注釋結(jié)果時(shí),優(yōu)先挑選引起停止減少、停止增加、非同義突變、可變剪接的位點(diǎn)所在的基因作為候選基因。

1.2.5 等位性鑒定

1.2.5.1 矮稈材料來源 125d矮稈材料是玉米地方種甘洛白,通過混合授粉實(shí)現(xiàn)基因重組,在改良群體中自然突變的矮稈植株;123d矮稈材料是北方自交系123自然突變矮稈株,再多代自交到純合穩(wěn)定;dm676矮稈材料是玉米自交系M676自然突變矮稈植株,再經(jīng)過多代自交到純合穩(wěn)定;Na360矮稈材料是從墨西哥矮稈雜交種本雀-利比亞AN-360選出的自交系

1.2.5.2 d8227矮稈基因等位性鑒定 d8227與定位區(qū)間4個(gè)已知的矮稈材料構(gòu)建F1、F2群體,種植群體待株高抽雄穩(wěn)定后,調(diào)查F1、F2株高分離比率,用卡方檢驗(yàn),確定基因等位性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 d8227和dwarf-12表型鑒定差異分析

經(jīng)過在大田種植矮稈材料,觀察整個(gè)生育期,d8227和dwarf-12苗期株高基本一致,在抽雄前,d8227和dwarf-12株高出現(xiàn)差異,并一直持續(xù)到株高穩(wěn)定后,它們的葉片數(shù)、葉夾角、株高、穗部性狀如圖1,可以觀察到,d8227株高比dwarf-12高,d8227和dwarf-12葉片緊湊,穗位以下莖節(jié)明顯縮短,葉片顏色深綠,果穗籽粒為硬粒型,偏小,白軸。

A.左為d8227的果穗,右為dwarf-12的果穗; B.散粉結(jié)束時(shí)的去葉莖稈:左為dwarf-12,右為d8227;C.散粉結(jié)束長(zhǎng)果穗時(shí)的整株表型:左為dwarf-12,右為d8227;D.果穗籽粒大小:左為d8227,右為dwarf-12。A.On the left is the ear of d8227,on the right is an ear of dwarf-12;B.Remove the leaf stalk at the end of the powder:Left is the dwarf-12,right is d8227;C.The phenotype of the whole plant at the end of the spikelets:dwarf-12 on the left and d8227 on the right;D.The grain size of the ear:d8227 on the left and dwarf-12 on the right.圖1 d8227和dwarf-12植株各性狀比較Fig.1 Comparison character of dwarf d8227 and parent dwarf-12

對(duì)d8227和dwarf-12各個(gè)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如表1所示,d8227的株高為152.94 cm、穗位高為44.73 cm,dwarf-12株高為139.86 cm,穗位高為34.01 cm,d8227株高比親本株高增加9.35%,穗位高增加31.50%,達(dá)到顯著水平。d8227莖粗比dwarf-12減少7.49%,葉片減少2～3片,達(dá)到顯著水平。d8227穗上、穗位、穗下葉面積要比dwarf-12減少 0.58%,3.01%,3.44%,沒有達(dá)到顯著水平。穗上葉夾角增加0.11%,穗位、穗下葉夾角減少2.41%,11.25%,只有穗下葉夾角達(dá)到顯著水平。說明矮稈d8227和dwarf-12只有株高相差較大,整體性狀差異較小,dwarf-12株型要更緊湊。矮稈d8227的穗質(zhì)量、行粒數(shù)、百粒質(zhì)量、穗長(zhǎng)、粒深比dwarf-12增加52.21%,5.26%,23.76%,6.93%,12.02%,說明d8227的穗部經(jīng)濟(jì)性狀要比dwarf-12優(yōu)良。

表1 dwarf-12和d8227主要農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀比較 Tab.1 Comparisons of the main agronomic and economic trait among the d8227 and dwarf-12

從表2可以看出,d8227的莖節(jié)數(shù)要比dwarf-12少,d8227和dwarf-12的莖節(jié)越靠近基部縮短越明顯,穗下7節(jié)長(zhǎng)度差異最大且達(dá)到顯著水平,達(dá)54%;穗上13節(jié)差異最顯著,達(dá)84%,除穗下第1節(jié)不顯著以外,其他莖節(jié)長(zhǎng)度差異都為顯著,莖節(jié)長(zhǎng)度差異集中在穗位以上。

表2 矮稈d8227和dwarf-12莖節(jié)長(zhǎng)度分析Tab.2 Analysis of stem node length of d8227 and dwarf-12

2.2 矮稈d8227和dwarf-12莖稈表皮細(xì)胞分析

圖2為d8227穗上、穗下、穗位(A、B、C)和dwarf-12穗上、穗下、穗位(D、E、F)100×下相同區(qū)域的橫切細(xì)胞特征,可以看出,d8227穗上、穗位、穗下的維管束逐漸減小,dwarf-12穗上維管束較小,穗位和穗下基本沒變。圖3為親本矮稈d8227穗上、穗下、穗位(A、B、C)和dwarf-12穗上、穗下、穗位(D、E、F)40×下相同區(qū)域的縱切細(xì)胞,可以看出,d8227縱切細(xì)胞排列比較松散,并且細(xì)胞呈縱向伸長(zhǎng),dwarf-12細(xì)胞緊湊且呈橫向伸長(zhǎng)。結(jié)果分析如圖4, 經(jīng)過測(cè)量細(xì)胞面積,d8227在穗位、穗下的橫切細(xì)胞要比矮稈dwarf-12細(xì)胞面積減少25.6%,25.6%,達(dá)到顯著水平,在穗上細(xì)胞面積增加3.4%,沒有達(dá)到顯著水平。d8227穗上縱切面積比dwarf-12減少10%,沒有達(dá)到顯著水平,d8227的穗位、穗下細(xì)胞面積要比dwarf-12分別增加54%,56%,達(dá)到顯著水平。

A—C.d8227穗上、穗位、穗下橫切細(xì)胞圖 (100×);D—F.dwarf-12穗上、穗位、穗下橫切細(xì)胞圖 (100×)。A—C.d8227 upper,ear and lower ear cross section cell map(100×);D—F.dwarf-12 cross-section cell map at the upper,ear,and lower ear(100×).圖2 矮稈d8227和dwarf-12穗位、穗上、穗下節(jié)間橫切細(xì)胞比較Fig.2 Comparison of the cross-cut cells at upper,ear and lower ear internode between dwarf d8227 and dwarf-12

A—C.d8227穗上、穗位、穗下縱切細(xì)胞圖 (40×);D—F.dwarf-12穗上、穗位、穗下縱切細(xì)胞圖 (40×)。A—C.d8227 at the upper,ear,and lower ear,below the ear of the longitudinal cell map(40×);D—F.dwarf-12 at the upper,ear,and lower ear,below the ear longitudinal cell map(40×).圖3 d8227和dwarf-12穗上、穗位、穗下節(jié)間縱切細(xì)胞比較Fig.3 Comparison of longitudinal section of internodes cell in the upper,ear and lower ear between dwarf d8227 and dwarf-12

左圖為細(xì)胞橫切圖,右圖為細(xì)胞縱切圖,a和b表示d8227和dwarf-12同一倍鏡下的細(xì)胞面積存在顯著差異。On the left is cell cross section,and on the right is cell longitudinal section,a and b indicate that there are significant differences in cell area between d8227 and dwarf-12 under the same magnification.圖4 矮稈d8227、dwarf-12在穗位、穗上、穗下細(xì)胞面積Fig.4 Cell area of dwarf d8227 and dwarf-12 at the upper,ear and lower ear

綜合結(jié)果來看,d8227穗位、穗下橫切細(xì)胞面積相比dwarf-12顯著減少,穗上橫切面積和dwarf-12無顯著差異,說明dwarf-12莖粗增加;縱切細(xì)胞d8227細(xì)胞縱向伸長(zhǎng)明顯,dwarf-12細(xì)胞緊湊且呈橫向伸長(zhǎng),表明了d8227縱切細(xì)胞在穗上、穗位、穗下細(xì)胞面積增加主要是細(xì)胞縱向伸長(zhǎng)的原因?？傮w來看,d8227和dwarf-12細(xì)胞伸長(zhǎng)方式不同,也說明了株高的調(diào)控方式不同。

2.3 矮稈d8227遺傳模式分析

d8227與4個(gè)測(cè)驗(yàn)種組配的F2以及回交群體株高,經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分離比率,結(jié)果如表3所示,回交群體分離比率,除了F910、DR894測(cè)驗(yàn)種,均符合1∶1的單基因遺傳比率,F2株高分離比率,經(jīng)過卡方檢驗(yàn),除了F910測(cè)驗(yàn)種,均符合3∶1的單基因遺傳比率,初步推測(cè)d8227和F910、DR894組配的F2和回交群體不符合雙峰,可能是由于株高較低,也有可能受遺傳背景的影響,導(dǎo)致株高分離不顯著?？傮w來看,該矮稈是由一個(gè)主效基因控制,排除株高由數(shù)量性狀控制連續(xù)性分布,即由多基因控制的可能性較低。

表3 回交群體和F2群體株高χ2檢驗(yàn)Tab.3 Plant height χ2 test of backcross population and F2 population

2.4 BSA定位分析

2.4.1 混池測(cè)序質(zhì)量情況 本次測(cè)序結(jié)果如表4所示,共產(chǎn)生Raw data 205.043 GB,過濾后為201.162 GB,各混池的Raw data 29 993.22～72 301.75 Mb,測(cè)序質(zhì)量高(Q20(%)>96.28%,Q30(%)>90.15%),CG含量為46.41%～46.55%。綜上,所有數(shù)據(jù)量足夠,測(cè)序質(zhì)量合格,GC分布正常,測(cè)序成功。

表4 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總Tab.4 Summary of sequencing data quality

2.4.2 Reads與參考基因組比對(duì)情況統(tǒng)計(jì)根據(jù)BWA軟件把有效測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)比到參考基因組上,然后將對(duì)比結(jié)果經(jīng)過SAMTOOLS去除重復(fù),參考基因組為B73-V4版本。經(jīng)過對(duì)比結(jié)果如表5所示,親本d8227、ZNC442平均測(cè)序深度為12.75×、12.23×,矮稈混池(DM)和高稈混池(HM)平均測(cè)序深度為27.70×和27.41×。

表 5 測(cè)序深度及覆蓋度統(tǒng)計(jì)Tab.5 Sequencing depth and coverage statistics

2.4.3 SNP與InDel檢測(cè)及注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì) 使用ANNOVAR對(duì)由多個(gè)基因組檢測(cè)出的基因變異進(jìn)行功能注釋,與B73參考基因?qū)Ρ?結(jié)果如表6,7所示,總計(jì)得到6 180 863個(gè)SNP和870 214個(gè)InDel,其中外顯子區(qū)域存在157 081個(gè)SNP變異位點(diǎn),其中76 090為非同義突變,如表7,在外顯子區(qū)域中29 176個(gè)為InDel變異位點(diǎn),其中8 339個(gè)變異是由缺失或插入造成的。

表 6 SNP檢測(cè)及結(jié)果Tab.6 SNP detection and result

表7 InDel檢測(cè)及結(jié)果Tab.7 InDel detection and result

2.4.4 子代頻率差異分布 篩選親本之間具有多態(tài)性SNP位點(diǎn),共挑選出1 908 082個(gè)標(biāo)記,經(jīng)過篩選得到過濾后的1 677 107的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn),通過分析2個(gè)子代在親本間1 677 107個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的SNP的頻率,并繪制染色體上SNP頻率的分布圖,以便直觀地反映子代SNP-index在染色體上的分布情況。默認(rèn)情況下,選擇1 MB作為為窗口,1 kb作為步長(zhǎng)。計(jì)算每個(gè)窗口的SNP-index的平均值,以反映子代的SNP的頻率分布。

將2個(gè)子代的SNP-index和InDel-index作差,即Δ(SNP-index)和Δ(InDel-index)= SNP-index/InDel-index(極端性狀B)-SNP-index/InDel-index(極端性狀A(yù))。將子代之間的SNP-index和InDel-index合并后的All-index在染色體上的分布作圖,以便直觀地反映變異位點(diǎn)在染色體上的分布情況。在進(jìn)行1000次置換檢驗(yàn)后,選取95%(藍(lán)色)的置信水平,作為篩選閾值。從圖5可以看出,Δ(SNP-index)、Δ(InDel-index)、Δ(All-index)結(jié)果一致,都位于1號(hào)染色體。

NC_024459.2～NC_024468.2.染色體1號(hào)～染色體10號(hào)。NC_024459.2—NC_024468.2.Chromosome 1—chromosome 10,respectively.圖 5 2個(gè)子代的Δ(SNP-index)、Δ(InDel-index)、Δ(All-index)在染色體上的分布Fig.5 Distribution of two progeny Δ(SNP-index),Δ(InDel-index),Δ(All-index)on chromosome

2.4.5 基于SNP和InDel標(biāo)記的矮稈基因區(qū)域初步定位 以InDel標(biāo)記和SNP標(biāo)記為基礎(chǔ),經(jīng)過子代SNP-index作差分別得到Δ(InDel-index)和Δ(SNP-index),選擇95%的置信水平,大于閾值的窗口作為候選區(qū)間。從圖6可以看出,左圖為Δ(InDel-index),右圖為Δ(SNP-index),兩者高于置信水平的區(qū)間均位于1號(hào)染色體190～215 Mb,物理距離為25 Mb。為了不忽略微效QTL的影響,在全基因組范圍內(nèi)選擇候選SNP和InDel時(shí),如果參考親本和子代相同,就挑選子代池中All-index接近0的位點(diǎn);如果參考基因和子代表型相反,就挑選All-index接近1的位點(diǎn)。選取子代差異顯著的位點(diǎn),共選出2 088個(gè)SNP候選位點(diǎn),702 585個(gè)InDel候選位點(diǎn),優(yōu)先挑選引起stop loss、stop gain、非同義突變、可變剪接的位點(diǎn)所在的基因作為候選基因,以此作為ANNOVAR的注釋結(jié)果。篩選后有176個(gè)SNP位點(diǎn),190個(gè)InDel位點(diǎn),由于定位區(qū)間在1號(hào)染色體190～215 Mb,在此區(qū)間一共有107個(gè)SNP位點(diǎn),128個(gè)InDel位點(diǎn),在maize GDB官網(wǎng)以B73-V4為版本查找到相關(guān)22個(gè)候選基因,在NCBI、KEGG官網(wǎng)查詢基因功能,結(jié)果如表8所示。

圖6 2個(gè)子代Δ(InDel-index)和Δ(SNP-index)有顯著差異的染色體Fig.6 Chromosomes with significantly different Δ(InDel-index) and Δ(SNP-index) between the two offspring

表8 候選基因Tab.8 Candidate gene

2.5 矮稈等位性鑒定分析

d8227和4個(gè)矮稈雜交得到F1,通過分析F1和親本之間的株高、穗位高,結(jié)果如表9所示,矮稈d8227與125d、123d、Na360雜交得到的F1株高、穗位高與親本都達(dá)到了顯著水平,但d8227和125d、dm676組配的F1株高較低。通過在雅安和云南2個(gè)地點(diǎn)種植4個(gè)F2群體,株高分布圖如圖7所示,d8227和123d的F2為2個(gè)峰值,其余F2群體都為一個(gè)峰值,通過卡方檢驗(yàn),如表10,d8227和123d的F2群體2個(gè)峰值在云南符合 9∶7的比例,在雅安不符合遺傳比例,說明株高受到環(huán)境的影響較大。123d和d8227的F2群體矮稈和高稈界限根據(jù)親本高度劃分矮稈為150 cm以下,高稈為170 cm以上。根據(jù)在雅安株高分離比例可以判斷123d與d8227不為等位基因,d8227與125d、Na360、dm676雜交F2群體株高只有一個(gè)峰值,但Na360和d8227雜交F2群體高于雙親的植株較多,因此,可以排除為等位基因的可能,但是不能說明dm676、125d和d8227不是等位基因,其親本之間表型性狀差異也較大,需要后續(xù)進(jìn)一步的精細(xì)定位來確定。

表9 雙親及子代F1株高與穗位高比較Tab.9 Comparison of plant height and ear height of parents and progeny F1 cm

A.在雅安種植F2群體;B.在云南種植的F2群體。A.F2 population grown in Ya'an;B.F2 population grown in Yunnan.圖7 矮稈d8227等位性鑒定F2株高分布Fig.7 High distribution of F2 strains identified by the allele of dwarf stalk d8227

表10 等位鑒定卡方檢驗(yàn)Tab.10 Chi-square test for allelic identification

3 結(jié)論與討論

3.1 矮稈d8227和 dwarf-12表型特征分析

目前,發(fā)現(xiàn)的矮稈玉米大多為單基因,但單基因大多會(huì)連鎖不良性狀,如顯性矮稈玉米D*-10株高極度矮化,莖稈扭曲,花器官發(fā)育異常,不能夠正常授粉[12],隱性單基因控制的矮稈dm676,葉片重疊,授粉困難,造成結(jié)實(shí)率低,因此,要選取有利性狀的矮稈基因,構(gòu)建合理株型,提高群體光合利用率,才能達(dá)到提高作物產(chǎn)量的目的。

本試驗(yàn)矮稈玉米d8227株高適宜,屬于中等矮稈,矮稈d8227株高、穗位高比dwarf-12增加9.35%,31.5%,d8227株高增加是由于莖節(jié)長(zhǎng)度的增加,觀察矮稈株高發(fā)育動(dòng)態(tài),生長(zhǎng)前期未出現(xiàn)變化,在抽雄前期親本dwarf-12和d8227的株高開始出現(xiàn)差異,一直到抽雄結(jié)束株高穩(wěn)定,差異達(dá)到最大。這也表明了兩者節(jié)間長(zhǎng)度的調(diào)控方式有所不同,前人研究表明,當(dāng)遺傳背景不同也會(huì)導(dǎo)致基因表型不同,即使含有相同矮生主基因,其株高也不相同,其表型也會(huì)相差極大,其原因是在主效基因起作用的同時(shí),一些修飾基因也會(huì)對(duì)株高起到一定的作用,如前人研究的同屬br2基因,其表型差異也相差較大;這也可能與基因在植物體內(nèi)不同的剪切方式有關(guān),可變剪切是轉(zhuǎn)錄后加工的過程,這種機(jī)制在植物體內(nèi)普遍存在,研究證明,這些剪切體可能會(huì)改變蛋白序列,影響蛋白質(zhì)功能,能夠參與生物重要的調(diào)控進(jìn)程[25-26],如前人通過對(duì)比br2等位基因變異的br2-114F和br2-117A、d2004,在植株早期發(fā)育形態(tài),br2-114F極度矮化,br2-117A次之,但突變體d2004比較溫和,不同的br2等位變異具有不同的突變效應(yīng),這與br2的可變剪切密不可分。對(duì)d8227穗部經(jīng)濟(jì)性性狀分析,果穗性狀的穗質(zhì)量、行粒數(shù)、百粒質(zhì)量、穗長(zhǎng)、粒深都比dwarf-12增加,這也說明了d8227矮稈材料經(jīng)濟(jì)性狀良好,雖然dwarf-12葉片數(shù)增加,但穗位以下莖節(jié)縮短顯著,這會(huì)導(dǎo)致葉片重疊,減少葉片的透光率和光合作用,導(dǎo)致2個(gè)矮稈之間果穗性狀產(chǎn)生差異?？傮w來看,矮稈d8227株高中等高度,穗位以下縮短明顯,具有抗倒伏的優(yōu)點(diǎn),并且穗部性狀優(yōu)良,配合力良好,可以進(jìn)行組配,從而選育出株高中等,產(chǎn)量好的矮稈品種,從而提高材料綜合利用價(jià)值。

3.2 莖稈組織特征和矮化的關(guān)系

玉米株高是由莖節(jié)數(shù)和莖節(jié)長(zhǎng)度決定,引起矮稈的直接原因是矮稈基因?qū)е轮仓瓯硇秃图?xì)胞學(xué)產(chǎn)生變化,從表型上來看,矮稈會(huì)導(dǎo)致莖稈數(shù)目減少和莖節(jié)長(zhǎng)度縮短;從細(xì)胞學(xué)來看,矮稈是由于莖節(jié)間細(xì)胞數(shù)目減少或單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度縮短。如王文秀等[27]通過誘變鄭58自交系獲得的矮稈突變體,發(fā)現(xiàn)矮稈株高降低是由于細(xì)胞縮短和細(xì)胞數(shù)目增加,王宇宇[28]發(fā)現(xiàn)的矮稈突變體,是由于穗位以下莖節(jié)縮短和細(xì)胞長(zhǎng)度減少,導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目增加,株高出現(xiàn)矮化。

在本研究中d8227和dwarf-12的矮化機(jī)理可能存在差異。前人研究表明,植物激素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程,如植物種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)和葉片的生長(zhǎng)等,矮稈dwarf-12和d8227的矮化機(jī)理可能與植物激素合成、運(yùn)輸以及信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。通過觀察莖稈細(xì)胞組織,dwarf-12株高比d8227矮是由于穗上、穗位、穗下縱切細(xì)胞伸長(zhǎng)被抑制導(dǎo)致莖節(jié)長(zhǎng)度縮短,dwarf-12的矮化機(jī)理和李啟芳[29]研究的矮稈52333Dt矮化機(jī)理相同,都是細(xì)胞伸長(zhǎng)受到抑制,但和王宇宇[28]研究的矮稈結(jié)果不同,王宇宇研究矮稈材料穗位以下細(xì)胞長(zhǎng)度明顯縮短,穗位以上細(xì)胞長(zhǎng)度和野生型相比無明顯變化。在本研究中d8227和dwarf-12的矮化機(jī)理可能存在差異。前人研究表明,植物激素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程,如植物種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)和葉片的生長(zhǎng)等,矮稈dwarf-12和d8227的矮化機(jī)理可能與植物激素合成、運(yùn)輸以及信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

3.3 矮稈d8227基因初步定位和等位性鑒定

通過構(gòu)建定位群體,通過對(duì)矮稈d8227的遺傳分析,判斷為隱性主基因控制,從而也驗(yàn)證了本課題組前期利用主效基因+多基因模型得出的至少有1對(duì)主效基因或2對(duì)主效基因[30]。d8227的矮稈基因初步定位于1號(hào)染色體190～215 Mb,有25 Mb長(zhǎng)度,在此區(qū)間已經(jīng)定位的矮稈有br2、br1、123d、125d、Na360、dm676,它們的突變體都具有株高變矮,節(jié)間縮短,葉寬的特點(diǎn)。其中123d是br2相同突變類型,在第4個(gè)外顯子的編碼的氨基酸替換,對(duì)赤霉素敏感[31],Na360是含有br2基因的,經(jīng)過在maizeGDB網(wǎng)站查詢,控制br2基因名稱為Zm0001d031871,在204 745 698～204 758 247 bp,在d8227測(cè)序得到的候選基因中,不含控制br2的基因,d8227與含有br2基因矮稈材料Na360雜交F1、F2中超親的植株較多, d8227與123d的F1株高極顯著高于雙親,并且F2群體符合9∶7的分離比率,因此可以初步排除d8227與123d、Na360為等位基因。以br2基因模型GRMZM2G315375克隆發(fā)現(xiàn)125d矮稈材料在br2基因1 651個(gè)堿基處有一個(gè)9 bp片段的插入,在6 438個(gè)堿基處有一個(gè)232 bp片段的缺失,缺失導(dǎo)致移碼突變,造成功能位點(diǎn)缺失[32],導(dǎo)致矮稈表型。經(jīng)過等位性鑒定,F1、F2群體株高偏矮的植株較多,F2群體只有一個(gè)峰值,沒有表現(xiàn)超親植株,不能排除等位基因的可能。矮稈材料dm676初步定位于1號(hào)染色體分子標(biāo)記umc2396和umc1356,物理位置在bin1.07位置,組配的F1、F2群體株高較矮,并且F2株高為一個(gè)峰,不能排除等位基因的可能。但由于dm676、125d和d8227表型差異較大,因此需要后續(xù)一系列試驗(yàn),如候選基因分子學(xué)遺傳驗(yàn)證(克隆、表達(dá)量比較)以及精細(xì)定位,才能推斷出d8227與dm676、125d為等位基因,還是一個(gè)新的矮稈基因。

3.4 d8227的育種應(yīng)用前景

大多發(fā)現(xiàn)的矮稈玉米由于組合配合力產(chǎn)量較低,未能在育種中進(jìn)行推廣應(yīng)用,如br1、br3、br8等矮稈材料,劉宗華等[33]在矮稈玉米資源研究中理想的矮稈資源是即可以降低雜交種的株高,又可以提高增產(chǎn)的潛力。因此,發(fā)掘和尋找既能降低株高,又對(duì)產(chǎn)量無明顯影響的矮稈材料,有利于促進(jìn)矮化育種的發(fā)展[34-35]。本試驗(yàn)材料株高中等矮度,葉片較寬,顏色較深,葉夾角也較小,株高配合力效應(yīng)為-2.77,單株產(chǎn)量配合力效應(yīng)為21.84,綜合產(chǎn)量性狀配合力良好[30],具有較好的育種潛,矮稈d8227可以通過雜交自交重組,聚合矮生基因或者其他優(yōu)良基因,選育新的綜合性狀優(yōu)良的抗倒的矮生系。