洪繼彪，丁晟琦，常亞青，尹東紅，王許波，宋堅

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

哈氏刻肋海膽(Temnopleurushardwickii)隸屬于海膽綱(Echinoidea)拱齒目(Camarodonta)刻肋海膽科(Temnopleuridae)刻肋海膽屬(Temnopleurus)[1]，與細(xì)雕刻肋海膽(T.alexandri)的親緣關(guān)系較近[2]，分布于中國的黃海、渤海、東海舟山群島海域和臺灣海峽。其殼較低平，呈半球形，最大殼徑為4.5 cm，高約2 cm，步帶狹窄，此間步帶稍隆起(圖1)。

哈氏刻肋海膽棘刺較細(xì)，呈規(guī)則排列，棘一節(jié)深一節(jié)淺，形態(tài)美觀，觀賞性極高，在水族造景中應(yīng)用廣泛，對水族缸內(nèi)壁藻類的控制也有著較好的效果，有利于調(diào)節(jié)水質(zhì)。因此，其觀賞應(yīng)用潛力較大。目前，有關(guān)哈氏刻肋海膽的研究較少，主要集中在其遺傳進(jìn)化和生態(tài)方面[3-4]。國外有關(guān)哈氏刻肋海膽的養(yǎng)殖文獻(xiàn)也較稀少，僅見Yaguchi等[5]對該海膽的生殖周期進(jìn)行過研究。哈氏刻肋海膽種群數(shù)量較少，開展哈氏刻肋海膽的人工繁殖，不僅對生態(tài)環(huán)境的保護(hù)具有積極作用，而且緩解了水族造景等產(chǎn)業(yè)的需求。本研究中，首次探究了哈氏刻肋海膽人工繁育技術(shù)，并觀察其胚胎及幼體發(fā)育過程，以期為該海膽的遺傳和人工繁育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用親膽200枚，于2018年9月采自旅順黃泥川海域(圖1)，殼徑為3.0～4.5 cm，活力充沛，體表無損傷，親膽運(yùn)送至大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)3 d。

圖1 哈氏刻肋海膽形態(tài)Fig.1 Morphology of Temnopleurus hardwickii

1.2 方法

1.2.1 親膽管理 將哈氏刻肋海膽親膽暫養(yǎng)于實驗室內(nèi)，自然光照，水溫為(24.2±1.0)℃，鹽度為29～32。暫養(yǎng)池中24 h充氣，每天換水一次并投喂馬尾藻，換水量為2/3，換水時緩慢加水以減少對親膽的刺激。

1.2.2 親膽促熟 通過投喂充足餌料對哈氏刻肋海膽親膽進(jìn)行促熟。溫度較低時，可通過緩慢升溫促熟，促熟過程中投喂海帶、裙帶菜、石莼及少量煮熟的貽貝，保證親膽食物充足，使親膽在性腺發(fā)育過程中有著較好的豐滿度。自然光周期下，每天換水一次，換水量為1/3，輕度充氣，并用虹吸管將親膽所排糞便吸出，溫度控制在23 ℃左右。

1.2.3 受精卵的獲得與觀察 參考王寶鋒等[6]的方法對海膽進(jìn)行催產(chǎn)。在23.7 ℃水溫下，使用1 mL的注射器，分別從圍口膜處給10枚親膽注射0.5 mol/L的KCl溶液0.4 mL。注射KCl溶液后，將親膽倒扣在500 mL的礦泉水瓶上。親膽排精、產(chǎn)卵后，收集適量活力好的精子加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的卵子中，輕輕攪動，等待卵子的受精。在顯微鏡下觀察到卵子有極體放出時，表明該卵子已受精。取1 mL精卵混合液在顯微鏡下觀察受精卵的變化并記錄數(shù)量。受精率(%)計算公式為

受精率=2細(xì)胞數(shù)量/總卵數(shù)量×100%。

1.2.4 胚胎和幼體發(fā)育觀察 受精卵在水溫23～24 ℃、鹽度29～32下進(jìn)行孵化，受精時卵密度為60～80枚/mL。胚胎發(fā)育至纖毛囊胚期后上浮于水面，用虹吸法吸取上層囊胚進(jìn)入育苗池進(jìn)行培養(yǎng)，在選育時也可用孔徑為57 μm的篩絹網(wǎng)在水面上層進(jìn)行篩選。選育后的優(yōu)良胚胎發(fā)育至棱柱幼體時期時，開始投喂牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)，起始投喂量為每日2 000 cells/mL，通過光學(xué)顯微鏡觀察幼體胃部飽滿情況并逐漸增加投喂量。二腕幼體至四腕幼體時期，每日投喂量為3 500～8 100 cells/mL；六腕幼體至八腕幼體時期，每日投喂量逐漸增加至12 500～20 000 cells/mL。在浮游幼體培育過程中，幼體密度約為0.5 枚/mL，此時空間適宜，成活率較高。室內(nèi)水溫保持在22～23.3 ℃，鹽度保持在29～32，養(yǎng)殖池中24 h微充氣。在幼體發(fā)育期間，通過光學(xué)顯微鏡觀察幼體發(fā)育過程，并用電子設(shè)備進(jìn)行拍照，觀察記錄胚胎和幼體的發(fā)育特征及時間，測量相關(guān)時期特征數(shù)據(jù)。各期胚胎和幼體發(fā)育時間以隨機(jī)樣本中出現(xiàn)該時期50%的個體為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 稚膽培育 八腕幼體變態(tài)成為稚膽后，管足開始伸出，此時將培育好的波紋板放入稚膽池中，稚膽通過管足附著在硅藻板上，開始攝食底棲硅藻，纖毛帶上的纖毛活動逐漸減弱。每日換水一次，換水量為1/2，保持水質(zhì)清潔，自然光照，微充氣。隨著稚膽的生長，開始投喂海帶、裙帶菜和石莼，每日一次，及時查看，保證海膽的攝食充足。此時進(jìn)行網(wǎng)箱養(yǎng)殖，將相同大小的同家系海膽置于同一個網(wǎng)箱，以防止因食物競爭導(dǎo)致海膽生長差距過大。另外，仍需防范病害的發(fā)生，防止弧菌等病菌滋生，并加強(qiáng)人工管理，勤換水，或進(jìn)行流水養(yǎng)殖。

波紋板附著基的培育：先將水泥池消毒，取潮間帶底棲硅藻，用孔徑為50 μm的篩絹網(wǎng)反復(fù)篩取后加入池水中，再加入用硅酸鈉、過磷酸鈣和硫酸銨配制的營養(yǎng)鹽，將消毒后的波紋板放入池中，充氣，每隔兩天換水一次，如有橈足類等敵害生物發(fā)生，可加入敵百蟲等藥物控制。

1.2.6 人工繁育3齡海膽生長指標(biāo)及性腺指數(shù)的測定 將繁育的稚膽繼續(xù)在實驗室養(yǎng)殖3年。于2022年7月9日開始，一周內(nèi)先后取3批3齡海膽樣本，包括產(chǎn)卵的51枚和未產(chǎn)卵的39枚，每批樣本30枚。先稱量每一枚海膽的活體質(zhì)量，取其平均值，然后解剖取其性腺，稱量濕性腺質(zhì)量，取其平均值，再計算每一批海膽的性腺指數(shù)(IGS)，即

IGS=濕性腺質(zhì)量/活體質(zhì)量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 親膽促熟效果

在親膽促熟過程中，一般來說，體積越大的海膽性腺發(fā)育越好。殼徑在2 cm以上的哈氏刻肋海膽產(chǎn)卵量較大。給親膽注射KCl溶液1.5～5 min后，雌性海膽開始產(chǎn)卵，在燈光下可見卵透明且呈細(xì)小球狀體；雄性海膽開始排精，精液為白色乳狀液體。說明親膽催熟效果較好。

2.2 人工催產(chǎn)及受精卵觀察

在23.7 ℃水溫下，給哈氏刻肋海膽親膽注射KCl溶液1.5～5 min后，親膽開始產(chǎn)卵、排精。親膽在產(chǎn)卵、排精時，管足不停搖擺，生殖孔周圍的棘在無規(guī)則擺動，所排出的精子和卵細(xì)胞呈細(xì)線狀從多個生殖孔排出，隨之在海水中散開。2018年9月5日共催產(chǎn)10枚親膽，其中4枚親膽產(chǎn)卵，在5倍顯微鏡下可見均黃卵(圖2(a))，帶有極體，易沉，在燈光下可見細(xì)小透明球體；3枚親膽產(chǎn)精子，為細(xì)線狀乳白色液體，排入水體后散成霧狀，在40倍顯微鏡下可見精子呈帶有長尾的類似錐形體(圖2(b))，精子活性好，不停地?zé)o規(guī)則游動。取適量精子倒入卵子中進(jìn)行授精，10 min左右后在5倍鏡下可見卵膜(圖2(c))，每枚卵子周圍有3～5個精子不停游動；受精卵色澤淡黃，外形飽滿，無不規(guī)則卵，卵膜無破損；受精率較高，為90.6%～96.4%，平均為93.6%±2.1%。在此后又催產(chǎn)3次(表1)，每次解剖催產(chǎn)成功的親膽和未產(chǎn)卵的海膽共30枚，觀察其性腺發(fā)育情況。

PB—極體；UE—未受精卵；T—尾；H—頭；N—頸；A—頂體；EM—卵膜。PB—polar body；UE—unfertilized egg；T—tail；H—head；N—neck；A—acrosome；EM—egg membrane.圖2 哈氏刻肋海膽的生殖細(xì)胞和受精卵Fig.2 Germ cells and fertilized egg of Temnopleurus hardwickii

表1 哈氏刻肋海膽的催產(chǎn)、受精及孵化Tab.1 Induced to spawn，fertilization and incubation of the Temnopleurus hardwickii

2.3 胚胎發(fā)育過程

1)卵與受精卵。哈氏刻肋海膽成熟卵細(xì)胞卵徑為(131.0±13.9)μm，呈淡黃色，當(dāng)水中不充氣時，卵子易沉于水，屬于均黃沉性卵。卵呈橢圓形，光學(xué)顯微鏡下卵膜明顯，且具有卵膜孔(圖3A)。精子進(jìn)入卵細(xì)胞后，卵細(xì)胞周圍形成一層受精膜，受精卵卵徑為(132.71±4.68)μm(圖3B，表2)。

表2 哈氏刻肋海膽的胚胎和幼體發(fā)育過程Tab.2 Embryonic and larval development process of Temnopleurus hardwickii

A—卵；B—受精卵；C—2細(xì)胞期；D—4細(xì)胞期；E—8細(xì)胞期；F—16細(xì)胞期；G—囊胚期；H—原腸期；I—棱柱幼體期；J—二腕幼體；K—四腕幼體；L—六腕幼體；M—八腕幼體；N、O—稚膽。A—egg；B—fertilized egg；C—2-cell stage；D—4-cell stage；E—8-cell stage；F—16-cell stage；G—blastula stage；H—gastrula stage；I—prism stage；J—two-armed larva；K—four-armed larva；L—six-armed larva；M—eight-armed larva；N and O—juvenile.圖3 哈氏刻肋海膽胚胎發(fā)育過程Fig.3 Embryonic development of Temnopleurus hardwickii

2)卵裂期。受精卵經(jīng)50 min左右進(jìn)入卵裂期。受精卵開始輻射型卵裂，卵細(xì)胞中部向內(nèi)凹陷，分裂成兩個相似大小的細(xì)胞(圖3C)，第一次卵裂20 min后進(jìn)入第二次卵裂，受精卵分裂成4個相似大小的細(xì)胞(圖3D)。此后每經(jīng)30 min 進(jìn)行一次卵裂，歷經(jīng)8細(xì)胞期(圖3E)、16細(xì)胞期(圖3F)。

3)囊胚期。受精卵歷經(jīng)約5 h進(jìn)入囊胚期(圖3G)。囊胚期胚胎是由少數(shù)幾層細(xì)胞圍成的中空球體，胚胎長度為(121.69±3.61)μm(表2)，約2 h 后，囊胚脫去卵膜，開始在水中自主旋轉(zhuǎn)。

4)原腸期。受精卵經(jīng)過10 h發(fā)育后，胚胎進(jìn)入原腸期(圖3H)。原腸期胚胎長度為(139.53±9.03)μm(表2)。原腸期開始時，囊胚植物極出現(xiàn)扁平平面，處在植物極的中胚層細(xì)胞開始相互脫離，成為單個細(xì)胞并遷移到囊胚腔中，在植物極附近形成兩簇細(xì)胞團(tuán)。之后，內(nèi)胚層細(xì)胞整體內(nèi)陷并延伸形成原腸腔。

2.4 幼體發(fā)育過程

1)棱柱幼體。受精卵經(jīng)過18 h左右發(fā)育至棱柱幼體(圖3I)，幼體體長為(155.96±12.94)μm(表2)。棱柱幼蟲的口葉突出，前端呈弧形。幼蟲左右兩側(cè)的三射骨針已長大，一支伸向幼蟲的后端，一支伸至幼蟲的前端。此期內(nèi)，消化道未開通，尚不能攝食，幼蟲趨光性較強(qiáng)，多密聚于水表層。

2)二腕幼體。受精卵經(jīng)過23 h發(fā)育形成二腕幼體(圖3J)。二腕幼體整體呈三角錐形，其顯著特征為肛門所在的平面形成兩個錐形的長腕，腕內(nèi)有骨針支撐，使腕不能彎曲。二腕幼體體長為(197.03±16.89)μm(表2)。此時幼體的腸和胃已基本形成，腸呈細(xì)小管狀，有開口，為肛門。幼體周圍的纖毛不停地擺動，使幼體在水中游動，口上方形成的口前纖毛環(huán)不停地擺動。攝食角毛藻時食管開始緩慢蠕動，并伴隨胃部和腸的節(jié)律性收縮。到二腕幼體后期，幼體體長達(dá)到306.15 μm，位于口葉中線的橫枝凸起，頂端形成了前側(cè)腕芽突。

3)四腕幼體。受精卵經(jīng)過1 d 16 h進(jìn)入四腕幼體期(圖3K)。幼體明顯長大，體長為(339.74±24.45)μm(表2)。此期幼體的典型特征是口葉凸起，頂端形成2個前側(cè)腕，與之前的2個腕共同構(gòu)成四腕幼體的4個腕。幼體形態(tài)和內(nèi)部器官發(fā)育較快，胃部進(jìn)一步膨大，攝食量增加，胃部食物清晰可見。

4)六腕幼體。受精卵歷經(jīng)7 d 2 h進(jìn)入六腕幼體(圖3L)，體長達(dá)到(507.03±31.19)μm(表2)。幼體從前側(cè)腕和口后腕之間的口端面周緣生出2個后背腕，與之前的4個腕共同構(gòu)成六腕幼體的6個腕。胃部膨大呈卵圓形，顏色變深。體壁變厚，后期幼體反口端頂部逐漸變鈍圓。

5)八腕幼體。受精卵歷經(jīng)10 d 16 h進(jìn)入八腕幼體(圖3M)。此階段最后一對口前腕從前側(cè)腕的內(nèi)側(cè)生出，與之前的6個腕共同構(gòu)成八腕幼體的8個腕。幼體體長為(1 129.62±104.07)μm(表2)。后背腕與前側(cè)腕繼續(xù)生長變得更加寬大，使幼體體寬增加，與體長幾乎相等。八腕幼體中期，后背腕與口后腕靠外一側(cè)在與反口端較近的位置出現(xiàn)一條帶狀凸起，其上密布纖毛。反口端頂部變平，兩側(cè)向外擴(kuò)張形成了2個肉褶。八腕幼體后期，前庭復(fù)合體不斷增大，將幼體的胃向一側(cè)擠壓，后期可見前庭復(fù)合體內(nèi)的初生管足蠕動。

6)稚膽。受精卵歷經(jīng)35 d后進(jìn)入稚海膽階段(圖3N、O)。八腕幼體末期，幼體的體壁和腕在水中水解，前庭復(fù)合體中的初生棘長出體壁，初生觸手伸出與外界接觸，開始擺動，幼體經(jīng)過變態(tài)成為稚海膽。稚海膽體長為(595.89±46.09)μm(表2)，其口面位于原來幼體的左側(cè)面，反口面位于原來幼體的右側(cè)面。依靠初生的5只管足，固著在波紋板及池壁上，并且通過固著開始攝食波紋板上附著的底棲硅藻。隨著棘和管足不斷生長，數(shù)量也在不斷增多，管足隨著水流不停擺動，稚海膽的活動性增大，在波紋板上可以運(yùn)動攝食，此時稚海膽生長速度加快，體壁棘和管足仍在不斷生長，直至外殼布滿棘刺，此后稚海膽基本與親膽外形相似。

2.5 胚胎及幼體的生長

在23～24 ℃水溫下，通過測量胚胎及幼體的體長，繪制其生長曲線。在測量過程中，使用同一臺電子顯微鏡，由同一人測量，每個時期測量的個體數(shù)量不少于30個。從圖4可見，海膽胚胎及幼體發(fā)育過程中，胚胎期卵徑會稍微縮小，到幼體期則開始增大，體長開始增長，從二腕幼體到四腕幼體，以及六腕幼體到八腕幼體時，幼體生長有顯著性差異(P<0.05)；生長到八腕幼體后，體長達(dá)到最大，為(1 129.62±104.07)μm，而八腕幼體經(jīng)過變態(tài)到稚膽時，體長則明顯縮小，并有顯著性差異(P<0.05)。

*為該時期相對前一時期生長有顯著性差異(P<0.05)。*，relatively significant difference in growth is compared from the previous growth stage during this period(P<0.05).圖4 哈氏刻肋海膽胚胎及幼體生長曲線Fig.4 Embryo and larva growth curve of Temnopleurus hardwickii

2.6 稚膽的培育

稚膽培育2～3月后，體長達(dá)到0.5～2.0 cm，生長差異較大，這可能與其基因及攝食情況不同有關(guān)。此期間，應(yīng)加強(qiáng)巡視，保證食物充足和水質(zhì)良好，觀察池底是否起弧菌等病原，仔細(xì)檢查稚膽狀態(tài)，將大小一致的稚膽置入一個網(wǎng)箱中培育。

2.7 海膽的生長及性腺指數(shù)

對3齡人工繁育的哈氏刻肋海膽解剖發(fā)現(xiàn)，雌、雄海膽性腺顏色主要呈橙黃色、黃色和黃綠色。產(chǎn)完卵的雌性海膽性腺多呈淡黃綠色、黃色，在解剖鏡下呈暗黃色且可見細(xì)小的卵細(xì)胞；雄性海膽性腺多呈橙黃色、黃色，在解剖鏡下可見亮黃色。將雌、雄海膽性腺用體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液固定在1 mL離心管中，解剖鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3種顏色的雌、雄海膽性腺飽滿，呈簇狀球體(圖5)。

A—雌海膽性腺；B—解剖鏡下雌海膽性腺；C—雄海膽性腺；D—解剖鏡下雄海膽性腺；E—取出的性腺，左雌右雄；F—黃色性腺(♂)；G—橙黃色性腺(♂)；H—黃色性腺(♀)；I—黃綠色性腺(♀)；J—黃綠色性腺(♀)；Go—性腺；Ee—卵；Se—精液。A—gonads of female sea urchin；B—anatomical view of gonads of female sea urchin；C—male sea urchin gonads；D—anatomical view of male sea urchin gonads；E—removed gonads，female on the left and male on the right；F—yellow gonad(♂)；G—orange yellow gonad(♂)；H—yellow gonad(♀)；I—yellowish green gonad(♀)；J—yellowish green gonad(♀)；Go—Gonad；Ee—egg；Se—semen.圖5 3齡哈氏刻肋海膽性腺觀察Fig.5 Observation of gonads of the 3 years old Temnopleurus hardwickii

對3齡人工繁育的哈氏刻肋海膽性腺指數(shù)分3次進(jìn)行取樣測定，每次隔兩天。計算結(jié)果表明，3齡哈氏刻肋海膽的平均性腺指數(shù)為7%～12%(表3)，此時海膽已達(dá)性成熟，注射0.5 mol/L的KCl溶液即可進(jìn)行催產(chǎn)，開展人工繁育。

表3 3齡人工繁殖哈氏刻肋海膽的生長及性腺指數(shù)Tab.3 Growth and gonado-somatic index(GSI)of the 3 years old Temnopleurus hardwickii by artificial reproduction

3 討論

3.1 哈氏刻肋海膽的生殖特征

海膽在生殖過程中，產(chǎn)卵、排精不僅受水流、溫度等環(huán)境因素的影響，還與月盈月虧有著較大關(guān)系[7]。本研究中所用的哈氏刻肋海膽親本采自大連市黃泥川海域，7—9月份是哈氏刻肋海膽的高產(chǎn)期，9月份達(dá)到最高峰[7]。哈氏刻肋海膽在性腺成熟時，雌性性腺顏色較深，雄性性腺顏色鮮艷，雌、雄性腺顏色具有明顯差異，這與常亞青等[8]得出的馬糞海膽性腺的顏色亮度值(L*)、紅度值(a*)和黃度值(b*)，在雌、雄海膽間具有極顯著性差異的研究結(jié)果相似。哈氏刻肋海膽卵子直徑為131 μm左右，形態(tài)特征與中間球海膽等其他海膽卵子相似，在排卵時極體已經(jīng)排出[9]，此時向卵細(xì)胞中加入適量精液，即可開始人工授精，在光學(xué)顯微鏡下觀察到每個卵周圍有5個精子，此時精子適量[10]。受精后的卵細(xì)胞可見類似小圓點的第二極體放出，特征明顯。在養(yǎng)殖過程中還發(fā)現(xiàn)，換水、溫差過大和干露情況下均會發(fā)生零星產(chǎn)卵現(xiàn)象[11]。

3.2 哈氏刻肋海膽胚胎及幼體發(fā)育特征

哈氏刻肋海膽生長速度較快，胚胎時間短。本研究中，哈氏刻肋海膽受精后50 min時進(jìn)入卵裂期，快于29.22～30.18 ℃下的紫海膽(Anthocidariscrassispina)進(jìn)入卵裂期的時間(1 h 30 min)[12]，稍慢于25.8～27.5 ℃下的白棘三列海膽(Teipneustesgratilla)進(jìn)入卵裂期的時間(40 min)[13]，快于17～21 ℃下的馬糞海膽(Hemicentfotuspulcherrimus)[14]和25～26 ℃下的高腰海膽(Mespiliaglobulus)[6]進(jìn)入卵裂期的時間(分別為1 h 30 min和1 h)。哈氏刻肋海膽分別在受精后5、10 h時進(jìn)入囊胚期和原腸期，與20～24 ℃下的光棘球海膽(Mesocentrotusnudus)[15]和中間球海膽(S.intermedius)[16]進(jìn)入囊胚期的時間接近，與白棘三列海膽[13]進(jìn)入囊胚期和原腸期的時間接近，慢于紫海膽[12]，但快于馬糞海膽[14]和高腰海膽[6]。哈氏刻肋海膽進(jìn)入棱柱期的時間(18 h)快于馬糞海膽[14]和高腰海膽[6](表4)。

在幼體發(fā)育時期，哈氏刻肋海膽進(jìn)入四腕幼體、六腕幼體、八腕幼體的時間分別為1 d 16 h、7 d 2 h和10 d 16 h，與白棘三列海膽進(jìn)入四腕幼體的時間接近，但整體進(jìn)入速度快于白棘三列海膽[13]、馬糞海膽[14]、光棘球海膽[15]和中間球海膽[16](表4)。

表4 哈氏刻肋海膽與其他海膽胚胎發(fā)育時序比較Tab.4 Comparison of embryonic developmental timing of Temnopleurus hardwickii with other sea urchins

在外形上，哈氏刻肋海膽在胚胎期時，細(xì)胞期、桑葚期、囊胚期、原腸期的形態(tài)與光棘球海膽、中間球海膽、高腰海膽等[6，15-16]除卵徑外并無太大的區(qū)別；在棱柱幼體時，哈氏刻肋海膽一側(cè)形成平面，原腸分化成胃、口和腸，出現(xiàn)了后口腕，兩側(cè)骨針開始生長，這與馬糞海膽[14]、中間球海膽[16]相似；在二腕幼體時，兩側(cè)骨針生長形成弧形頂，這與高腰海膽[6]、紫海膽[12]和白棘三列海膽[13]類似，而中間球海膽[16]、光棘球海膽[15]和馬糞海膽兩側(cè)骨針相交合形成頂尖。四腕幼體時，哈氏刻肋海膽骨針斷裂，形成橢圓形頂，出現(xiàn)兩個前側(cè)腕，胃部食物明顯，口腕伸長，器官更加明顯，這與高腰海膽[6]、紫海膽[12]比較相似，比中間球海膽[16]、光棘球海膽[15]和白棘三列海膽[13]的腕寬。在六腕幼體時，哈氏刻肋海膽后背腕長出，體壁加厚，胃顏色加深，這與高腰海膽[6]、紫海膽[12]相似，腕繼續(xù)變寬，骨針繼續(xù)斷裂變成鈍圓形，中間球海膽[16]、光棘球海膽[17]和白棘三列海膽[13]的骨針同樣斷裂，形成鈍圓頂；在八腕幼蟲時，哈氏刻肋海膽口前腕生出，其他腕繼續(xù)增大，前庭復(fù)合體不斷增大，將胃擠向一側(cè)，可見初生管蠕動，這與高腰海膽[6]、中間球海膽[16]相似(表5)?？梢?，從二腕幼體到八腕幼體，哈氏刻肋海膽的腕比其他一些海膽寬，不同種類的海膽腕的增長不盡相同，腕的生長時期也各不相同，直到后期附著在硅藻板，各個時期的海膽腕的形狀和生長速度也存在一定的差異。

表5 哈氏刻肋海膽與其他海膽體長發(fā)育比較Tab.5 Comparison of body length development of Temnopleurus hardwickii with other sea urchins μm

3.3 哈氏刻肋海膽的繁殖生物學(xué)

在哈氏刻肋海膽?zhàn)B殖過程中，水質(zhì)、餌料和人工管理等方面顯得尤為重要。在哈氏刻肋海膽親膽促熟過程中，通過慢升溫、保證餌料充足等手段均可促熟，使性腺更加豐滿，與中間球海膽的促熟相似[16]。梁其旭等[10]在2021年紫海膽的人工育苗中指出，也可通過投喂牡蠣等肉類食物進(jìn)行催熟。海膽催產(chǎn)的方法較多，包括陰干、流水、電刺激和滲透壓等，在實際操作過程中，較常用的還是KCl溶液注射法[16]。海膽是否能夠產(chǎn)出生殖細(xì)胞，關(guān)鍵在于性腺的發(fā)育程度，哈氏刻肋海膽性腺形態(tài)和顏色與中間球海膽等稍有不同，雌、雄海膽的性腺顏色亦有不同，這可能是由于雌、雄性腺中組成成分不同導(dǎo)致的[19]。在水溫23～24 ℃、鹽度29～32條件下，哈氏刻肋海膽能夠正常生長，附板后其以底棲硅藻為食，之后以海帶等褐藻為食，哈氏刻肋海膽為雜食性，對綠藻(如石莼等)和肉類亦食，這與大連紫海膽食性相似[20]。在繁育過程中，病害對哈氏刻肋海膽也有較大的威脅，如黑嘴病、弧菌病等。因此，在哈氏刻肋海膽繁殖過程中，不僅要精準(zhǔn)地控制繁殖條件和保持餌料的充足，而且要防止病害的發(fā)生。

4 結(jié)論

1)在水溫23～24 ℃、鹽度29～32、海膽幼體培育密度為0.5 ind./mL、投喂餌料牟氏角毛藻的條件下，可以實現(xiàn)在室內(nèi)對哈氏刻肋海膽的人工育苗，并進(jìn)行大量增殖。哈氏刻肋海膽幼體培育周期較短，從受精卵到八腕幼體僅需要10 d左右，餌料投喂成本低，生長周期快，人工管理較為容易，易于大量繁殖。

2)使用0.5 mol/L的KCl溶液催產(chǎn)效果較好。在促熟過程中，投喂海帶、裙帶菜及少量煮熟的貽貝等對哈氏刻肋海膽的促熟效果較好。在胚胎及幼體發(fā)育過程中，從四腕幼體時體長顯著增長，而從八腕幼體變態(tài)成稚膽時，體長又顯著縮小。在稚膽的培育中，哈氏刻肋海膽生長顯著，偏好海帶和裙帶菜，需要保證餌料充足，將大小相同的海膽置于同一網(wǎng)箱中飼養(yǎng)，以減小食物競爭。

3)哈氏刻肋海膽的大量繁殖有利于緩解對其他地區(qū)供應(yīng)的問題，經(jīng)過人工繁育的哈氏刻肋海膽生命力增強(qiáng)，從而減少了運(yùn)輸途中的死亡率。哈氏刻肋海膽的人工繁育成功，極大地緩解了自然捕撈的壓力，為保護(hù)自然野生種和促進(jìn)生態(tài)建設(shè)及提高經(jīng)濟(jì)效益具有一定的積極作用。