巫祎琴，陳福暖，張志強(qiáng)，江栢堅(jiān)，簡(jiǎn)紀(jì)常，黃瑜

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是在真核生物中進(jìn)化的一種常見的生理過程，目的是去除多余的、受感染的或受損的細(xì)胞，以維持內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡[1]，在細(xì)胞發(fā)育、衰老、傷口愈合和清除病原體等生理活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用[2]。研究者現(xiàn)已闡明了多種導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的途徑，如線粒體依賴(內(nèi)部)、線粒體非依賴性(外部)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)介導(dǎo)的途徑[3]等。

跨膜Bax抑制劑母體6(transmembrane Bax inhibitor motif containing 6，TMBIM 6)，又稱Bax抑制劑-1(Bax inhibitor-1，BI-1)，1994年在成年大鼠睪丸的cDNA文庫篩選時(shí)被首次發(fā)現(xiàn)，并命名為Tegt(testis enhanced gene expression)，隨后于1998年在酵母中被鑒定為是一種抗凋亡蛋白，可以抑制Bax的促凋亡作用[4]。TMBIM 6主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核外膜，含有6～7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，主要功能是保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)鈣離子的主要儲(chǔ)存區(qū)，在蛋白質(zhì)的合成和折疊過程中起著重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集及鈣離子平衡紊亂均可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和Caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。TMBIM 6作為一種抗凋亡蛋白，其過表達(dá)可以通過抑制Bax的激活與易位、Caspase的激活和降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平等來保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TMBIM 6可以抑制UPR途徑中肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme-1α，IRE1α)的蛋白活性，阻止其下游c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的激活，從而通過抑制Caspase-12活性來阻止細(xì)胞凋亡[7]。

TMBIM 6還參與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[8]、活性氧簇(ROS)調(diào)節(jié)[9]、細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]，以及細(xì)胞增殖、凋亡和分化[11]等多種生理過程。Lisak等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TMBIM 6通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)，在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的功能中發(fā)揮重要作用，缺乏TMBIM 6功能的小鼠中，胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子水平升高，導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NK-κB的激活有著直接而密切的聯(lián)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，活化的IRE1α通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2(tumor necrosis factor receptor-associated factors 2，TRAF2)與IKK形成復(fù)合體，進(jìn)一步激活I(lǐng)κB的上游激酶IKK，誘導(dǎo)IKK的磷酸化，從而導(dǎo)致IkB降解和NF-κB激活[12]。

近年來，有關(guān)TMBIM 6和TMBIM 6類蛋白參與細(xì)胞發(fā)育及其對(duì)生物和非生物脅迫的研究相繼報(bào)道[13]，但對(duì)TMBIM 6在魚類病原性感染中的作用知之甚少。目前，已經(jīng)鑒定出Tmbim6的硬骨魚類有斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[14]、暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[15]，以及甲殼類的克氏螯蝦(Procambarusclarkii)[16]和貝類的櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[17]等。Du等[16]使用RNAi下調(diào)克氏螯蝦Tmbim6表達(dá)，結(jié)果顯示，在克氏螯蝦TMBIM 6功能缺失后，對(duì)白斑綜合征病毒感染后誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率顯著增加。而在石斑魚虹彩病毒感染斜帶石斑魚過程中，Tmbim6過表達(dá)則可以抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡、Caspase-3活性和病毒基因轉(zhuǎn)錄[14]。由此可見，TMBIM 6是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，在魚類抵抗病原體感染過程中參與了機(jī)體對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)作為中國優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，為漁業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來了巨大的收益。近年來，以無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)為主的羅非魚鏈球菌病及羅非魚湖病毒病在國內(nèi)外時(shí)有發(fā)生，給尼羅羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[18-19]。本研究中，對(duì)尼羅羅非魚Tmbim6進(jìn)行克隆與鑒定，分析了該基因在健康魚組織中的分布模式及細(xì)菌與病毒感染后的表達(dá)變化，研究了TMBIM 6的亞細(xì)胞定位及其對(duì)NF-κB通路的影響，以期為探究尼羅羅非魚TMBIM 6的生物學(xué)功能及免疫調(diào)節(jié)功能提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 尼羅羅非魚(體質(zhì)量為80～100 g)購于廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)，于廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)30 d后用于正式試驗(yàn)，水溫控制在(28±5)℃。本試驗(yàn)中涉及試驗(yàn)動(dòng)物的所有操作均嚴(yán)格遵守廣東海洋大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)決議內(nèi)容及廣東省實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理?xiàng)l例相關(guān)要求執(zhí)行。

1.1.2 細(xì)胞、載體和試劑 HEK-293T、無乳鏈球菌菌株(ZQ0901)由廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離及保存；RNA提取試劑盒(TransZolUp Plus RNA Kit)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix )和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TransStart?Green qPCR SuperMix)均購自北京全式金生物技術(shù)公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PCR引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×MagicTaq DNA聚合酶、pMD-19T載體均購自TaKaRa公司；青霉素-鏈霉素溶液(100×)、pEGFP-N1和pcDNA 3.1載體均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；T4 DNA Ligase、QuickCutTMEcoR Ⅰ、QuickCutTMXho Ⅰ、Opti-MEM 培養(yǎng)基、Bovine Serum、Trypsin-EDTA(0.05%)、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent試劑盒、普通質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Miniprep Kit)和PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Thermo ScientificTMGene JETTMGel Extraction Kit)均購自Thermo公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(E.Z.N.ATMEndo-Free Plasmid Mini Kit Ⅱ)購自O(shè)mega公司；Poly I：C購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Tmbim6基因序列(GenBank No. XM_003457055.5)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Tmbim6基因的PCR和qPCR引物(表1)，以尼羅羅非魚β-actin作為內(nèi)參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及Tmbim6開放閱讀框克隆 隨機(jī)抽取3尾實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1個(gè)月的尼羅羅非魚，取其頭腎組織，使用TransZol up傳統(tǒng)法進(jìn)行RNA提取，提取的總RNA測(cè)定濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以取得的cDNA為模板，以帶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)的Tmbim6-F/Tmbim6-R引物對(duì)Tmbim6開放閱讀框(open reading franme，ORF)片段進(jìn)行克隆，經(jīng)核酸電泳檢測(cè)后進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收。隨后將純化的PCR產(chǎn)物連接至pMD-19T載體中，并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19T-Tmbim6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中(冰上操作)，在37 ℃下振蕩(150 r/min)培育1 h后，涂布于含Amp+(氨芐西林)的LB平板上，培養(yǎng)8 h以上；挑取大小均勻的圓形單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定后，再挑選陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)測(cè)序正確的Tmbim6序列進(jìn)行分析，獲得TMBIM 6氨基酸序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所用分析軟件見表2。

表2 生物信息學(xué)分析軟件Tab.2 Software for bioinformatics analysis

1.2.4 尼羅羅非魚TMBIM 6在HEK-293T中的亞細(xì)胞定位 參照羅國玲等[20]的方法。對(duì)“1.2.2節(jié)”測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，使用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ限制性快切酶對(duì)pMD19T-Tmbim6、pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；酶切后的產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收純化后，使用T4酶在4 ℃下過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中(操作同“1.2.2節(jié)”)；選取測(cè)序正確的菌液培養(yǎng)后，對(duì)其去內(nèi)毒素質(zhì)粒進(jìn)行提取，檢測(cè)其濃度并經(jīng)電泳驗(yàn)證后，暫存于-80 ℃超低溫冰箱中。將提前接種于24孔板培養(yǎng)的HEK-293T(密度為80%～90%)按照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將25 μL/孔Opti-mem培養(yǎng)基與1 μL/孔LipofectamineTM3000混合，命名為A液；將25 μL/孔Opti-mem培養(yǎng)基、1 μL/孔P300TM3000和500 ng DNA混合(pEGFP-N1作為對(duì)照組，pEGFP-Tmbim6作為試驗(yàn)組)，命名為B液；將A、B液等比例混勻后靜置15 min，靜置期間給HEK-293T更換無血清培養(yǎng)基，隨后將混合液按每孔50 μL添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，前后搖動(dòng)混勻。將細(xì)胞板置于含CO2的培養(yǎng)箱(37 ℃)中，轉(zhuǎn)染6 h后換帶血清的培養(yǎng)基；48 h后先用PBS清洗細(xì)胞，再加入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，15 min后用PBS潤(rùn)洗兩次；加入150 μL DAPI進(jìn)行核染15 min，使用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 NF-κB信號(hào)通路活性的檢測(cè) 參照羅國玲等[20]的方法。按照“1.2.4節(jié)”方法構(gòu)建pcDNA 3.1-Tmbim6過表達(dá)質(zhì)粒，并按照轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM3000 Transfection Reagent說明書，混合A、B 液，其中B液的DNA為啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒(150 ng)、內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK(4 ng)及試驗(yàn)組 pcDNA 3.1-Tmbim6(150 ng)/對(duì)照組pcDNA 3.1(150 ng)，將A、B液等比例混勻后靜置15 min，共轉(zhuǎn)染至HEK-293T內(nèi)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，往細(xì)胞樣品中加入 100 μL 細(xì)胞裂解液，充分裂解后將裂解產(chǎn)物置于離心機(jī)，以12 000 r/min離心30 s。取細(xì)胞上清裂解液20 μL，轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板中，并往樣品中加入100 μL的熒光素酶檢測(cè)緩沖液，充分混勻后立即放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)第一次發(fā)光值，并記錄數(shù)值為A；然后加入海腎螢光素酶檢測(cè)工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，再次放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)第二次發(fā)光值，并記錄數(shù)值為B。分別記錄試驗(yàn)組及對(duì)照組的雙熒光參數(shù)，計(jì)算A/B值。根據(jù)試驗(yàn)組與對(duì)照組的A/B值計(jì)算目的報(bào)告基因的激活程度。

1.2.6Tmbim6基因在健康組織中的表達(dá)模式 隨機(jī)抽取5尾暫養(yǎng)的尼羅羅非魚進(jìn)行解剖，取其肝臟、脾臟、頭腎、腸道、肌肉、血液和腦8個(gè)組織，按RNA提取試劑盒和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明，對(duì)樣品進(jìn)行RNA提取和cDNA合成，使用qPCR法檢測(cè)8個(gè)組織中Tmbim6的表達(dá)情況。反應(yīng)體系(10 μL)：Mix 5.0 μL，ddH2O 3.5 μL，cDNA模板0.5 μL，qTmbim6上、下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火15 s，72 ℃下復(fù)性20 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用 2-ΔΔCt方法對(duì)qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.7 無乳鏈球菌感染和Poly I：C免疫刺激后Tmbim6的表達(dá)變化 無乳鏈球菌組，采用腹腔注射法對(duì)每尾尼羅羅非魚注射0.1 mL劑量為1×107cells/mL的無乳鏈球菌；Poly I：C組，每尾注射0.1 mL劑量為1 mg/mL的Poly I：C(PBS稀釋)；空白對(duì)照組，注射0.1 mL無菌PBS。在注射后的0、3、6、12、24、48 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)各取3尾魚，取適量脾臟、肝臟、頭腎、腸道和腦組織，同法提取RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA，分別對(duì)所提取的樣品進(jìn)行qPCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同“1.2.6節(jié)”。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。所有反應(yīng)均設(shè)置 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和 3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析及組間比較分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tmbim 6基因克隆及生物信息學(xué)分析

克隆獲得的尼羅羅非魚Tmbim6開放閱讀框?yàn)?14 bp，可編碼237個(gè)氨基酸，不存在信號(hào)肽。預(yù)測(cè)其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為26 500，理論等電點(diǎn)為9.16。多序列比對(duì)分析表明，尼羅羅非魚與其他魚類的TMBIM 6氨基酸序列一致性為81%～92%，與哺乳動(dòng)物TMBIM 6的一致性為68%～74%(圖1)。TMBIM 6氨基酸序列包含1個(gè)cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)(圖2)。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2陰影部分)及1個(gè)C-末端基序(EKDKKKEKK)(圖1)。

圖1 尼羅羅非魚與其他物種TMBIM 6氨基酸序列的多序列比對(duì)Fig.1 Multiple alignments of TMBIM 6 amino acid sequence of Oreochromis niloticus compared with other species

表示cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；□表示蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)； 表示N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)； 表示微體C端靶向信號(hào)；陰影表示跨膜結(jié)構(gòu)域；*表示終止子。 stands for cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site；□ stands for protein kinase C phosphorylation site； stands for N-myristoylation site； stands for microbodies C-terminal targeting signal；shadow area stands for transmembrane region；*stands for stop codon.圖2 尼羅羅非魚TMBIM 6氨基酸序列和功能位點(diǎn)分析Fig.2 Amino acid sequence and functional site of TMBIM 6 in Oreochromis niloticus

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，尼羅羅非魚TMBIM 6首先與金頭鯛(Sparusaurata)、大西洋鱈(Gadusmorhua)聚為一支，然后與其他魚類聚為一大類，表明其與金頭鯛和大西洋鱈親緣關(guān)系較近(圖3)。

圖3 尼羅羅非魚TMBIM 6的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TMBIM 6 in Oreochromis niloticus

2.2 重組蛋白的亞細(xì)胞定位

將pEGFP-Tmbim6和空載pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，以確定尼羅羅非魚TMBIM 6在細(xì)胞內(nèi)的定位。從圖4可見，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組綠色熒光均勻分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，而pEGFP-Tmbim6轉(zhuǎn)染組綠色熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)中。

圖4 TMBIM 6在HEK-293T中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of TMBIM 6 in HEK-293T

2.3 NF-κB信號(hào)通路的活性檢測(cè)

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示，尼羅羅非魚Tmbim6在HEK-293T細(xì)胞中過表達(dá)后極顯著抑制NF-κB信號(hào)通路活性(P<0.01)(圖5)。

*表示與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)。*means significant difference compared with the control(P<0.05)；**means very significant difference compared with the control(P<0.01).圖5 尼羅羅非魚Tmbim 6過表達(dá)對(duì)NF-κB通路的影響Fig.5 Effect of Tmbim 6 over-expression on NF-κB pathway in Oreochromis niloticus

2.4 Tmbim 6基因在健康尼羅羅非魚組織中的表達(dá)

從圖6可見，Tmbim6基因在檢測(cè)的8個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，在肝臟中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次是肌肉、腸道和腦，在脾臟和頭腎中表達(dá)量較低(P<0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences.圖6 Tmbim 6在尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of Tmbim 6 of Oreochromis niloticus in different tissues

2.5 無乳鏈球菌刺激后Tmbim 6的組織表達(dá)變化

從圖7可見：經(jīng)無乳鏈球菌攻毒后，肝臟中，尼羅羅非魚Tmbim6基因的表達(dá)量在感染6 h時(shí)開始下調(diào)，12 h時(shí)表達(dá)量最低，而后開始上調(diào)，至48 h時(shí)達(dá)到峰值(P<0.05)；脾臟中，Tmbim6表達(dá)量在6～12 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)，呈時(shí)序性表達(dá)模式；腸道中，Tmbim6表達(dá)量在6 h時(shí)顯著上調(diào)至峰值(P<0.05)，12 h時(shí)表達(dá)量與對(duì)照組相近，48 h時(shí)再次顯著上調(diào)(P<0.05)；頭腎中，Tmbim6表達(dá)量在6 h時(shí)顯著下調(diào)(P<0.05)，12 h時(shí)恢復(fù)至正常水平，24 h后再次下調(diào)，最后于48 h時(shí)顯著上調(diào)至峰值(P<0.05)；腦中，Tmbim6表達(dá)量在感染后6～12 h時(shí)顯著下調(diào)(P<0.05)，24 h時(shí)顯著上調(diào)至峰值(P<0.05)，最后于48 h時(shí)恢復(fù)至正常水平。

標(biāo)有不同字母者表示同一組織中不同時(shí)間點(diǎn)間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters in the same tissue are significantly different in different time at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences，et sequentia.圖7 無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚組織中Tmbim 6的時(shí)序表達(dá)Fig.7 Temporal expression of Tmbim 6 in tissues of Oreochromis niloticus after infected by Streptococcus agalactiae

2.6 Poly I：C刺激后Tmbim 6的組織表達(dá)變化

從圖8可見：經(jīng)Poly I：C病毒類似物刺激后，尼羅羅非魚肝臟、頭腎、腦和腸道中Tmbim6基因的表達(dá)量均在3 h時(shí)開始顯著上調(diào)(P<0.05)，其中，肝臟和頭腎中持續(xù)高表達(dá)至12 h時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，而在腦組織中6 h后表達(dá)量與對(duì)照組相差不大，在腸道中持續(xù)高表達(dá)至12 h時(shí)表達(dá)量下調(diào)至對(duì)照組水平，而后于24 h時(shí)再次顯著上調(diào)(P<0.05)；在脾臟中Tmbim6表達(dá)量于6 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)，之后顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖8 Poly I：C刺激后尼羅羅非魚組織中Tmbim 6的時(shí)序表達(dá)Fig.8 Temporal expression of Tmbim 6 in tissues of Oreochromis niloticus after infected by Poly I：C

3 討論

3.1 尼羅羅非魚TMBIM 6的生物信息學(xué)分析

本研究中，克隆得到尼羅羅非魚Tmbim6的ORF為714 bp，可編碼237個(gè)氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，尼羅羅非魚與哺乳動(dòng)物的TMBIM 6相似，含有6個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)保守的C-末端基序(EKDKKKEKK)，表明尼羅羅非魚TMBIM 6可能與哺乳動(dòng)物TMBIM 6具有相似的功能。據(jù)報(bào)道，斜帶石斑魚TMBIM 6的C-末端基序在抵抗病毒感染時(shí)起關(guān)鍵作用[14]，且該段保守結(jié)構(gòu)與TMBIM 6具有的抗細(xì)胞凋亡、ROS調(diào)節(jié)和鈣調(diào)節(jié)等功能密不可分[21]。本研究中，通過SoftBerry-Psite預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚TMBIM 6蛋白包含1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)及2個(gè)微體C端靶向信號(hào)，表明該蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及信息傳遞中具有重要作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，尼羅羅非魚TMBIM 6與金頭鯛親緣關(guān)系最近。Blast分析顯示，尼羅羅非魚與其他魚類TMBIM 6氨基酸序列的一致性為81%～92%，與哺乳動(dòng)物TMBIM 6的一致性為68%～74%。以上結(jié)果說明TMBIM 6在進(jìn)化上高度保守。

3.2 TMBIM 6亞細(xì)胞定位及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

亞細(xì)胞定位與蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。已有研究表明，TMBIM 6是一種進(jìn)化保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，主要定位在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核外膜[22]。本試驗(yàn)中亞細(xì)胞定位顯示，尼羅羅非魚TMBIM 6主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，與對(duì)人類、暗紋東方鲀及斜帶石斑魚的研究結(jié)果相符[14-15]。

NF-κB是一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，與免疫細(xì)胞活化和發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞活動(dòng)密切相關(guān)[23]。NF-κB也是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)存在密切關(guān)系，可通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡[24]。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，活化的IRE1α通過TRAF2與IKK形成復(fù)合體，誘導(dǎo)IKK的磷酸化，導(dǎo)致IkB降解和NF-κB激活[12]。而TMBIM 6可以抑制UPR途徑中IRE1α的蛋白活性，影響下游的信號(hào)分子傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致NF-κB的激活受到抑制[7]。Lisak等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在TMBIM 6缺陷的小鼠中觀察到NF-κB蛋白豐度和核轉(zhuǎn)位增加。本研究中，通過構(gòu)建TMBIM 6真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了尼羅羅非魚TMBIM 6對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明，Tmbim6在HEK-293T細(xì)胞中過表達(dá)后顯著抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子。綜上，亞細(xì)胞定位及雙熒光素報(bào)告基因結(jié)果均表明，尼羅羅非魚TMBIM 6在進(jìn)化過程中與其他物種的TMBIM 6具有相似的分布及功能特征。

3.3 尼羅羅非魚Tmbim 6基因的組織表達(dá)模式

本研究發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚Tmbim6基因在脾臟、頭腎、鰓、皮膚、腦、腸道、肌肉和肝臟8個(gè)組織中均有表達(dá)，這表明TMBIM 6對(duì)尼羅羅非魚的正常生命活動(dòng)起到一定作用。與高等脊椎動(dòng)物相似[8]，Tmbim6在肝臟與肌肉中的表達(dá)量顯著高于其他組織。脊椎動(dòng)物的肝臟不僅是新陳代謝的重要場(chǎng)所，也是重要的免疫器官[25]，高表達(dá)的Tmbim6可抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)維持肝臟正常新陳代謝及生理功能可能有重要作用[17]。而肌肉作為魚類的結(jié)構(gòu)組織和運(yùn)動(dòng)器官，Tmbim6在肌肉中高表達(dá)，推測(cè)其可能在尼羅羅非魚生長(zhǎng)發(fā)育過程的細(xì)胞增殖或分化中起到調(diào)節(jié)作用[11]。此外，Tmbim6在腸道、腦、皮膚和鰓中的表達(dá)水平相對(duì)較高，這些組織主要構(gòu)成魚類黏膜免疫系統(tǒng)，推測(cè)其可能參與尼羅羅非魚非特異性免疫過程[26]。而脾臟和頭腎作為魚類的主要免疫器官[27]，在其他魚類中檢測(cè)到Tmbim6在這兩種組織中也高表達(dá)，如暗紋東方鲀及斜帶石斑魚[14-15]，暗示Tmbim6可能參與了魚類對(duì)病原體的免疫反應(yīng)。

3.4 無乳鏈球菌感染和Poly I：C刺激后細(xì)胞的應(yīng)激過程和免疫反應(yīng)

為探究TMBIM 6在尼羅羅非魚的功能，本研究中分別檢測(cè)了無乳鏈球菌感染和Poly I：C刺激后，尼羅羅非魚肝臟、脾臟、頭腎、腦和腸道組織中Tmbim6基因的表達(dá)變化。免疫刺激后，魚體出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、魚體失衡和肛門紅腫等不自然狀態(tài)。解剖后發(fā)現(xiàn)，其腹腔積水，肝、脾和腎腫大，腦組織出血。無乳鏈球菌作為羅非魚鏈球菌病的主要病原菌，傳染性強(qiáng)、死亡率高[28]。腸道作為黏膜免疫器官，與外界環(huán)境接觸，更容易接觸病原；而肝臟作為重要代謝器官的同時(shí)也是免疫器官，其在免疫和新陳代謝中的雙重作用，使該器官成為宿主防御病原體攻擊時(shí)調(diào)整代謝功能的重要角色[25]；頭腎和脾臟是魚類主要的造血和免疫組織，而無乳鏈球菌可以穿過血腦屏障感染腦部，導(dǎo)致腦環(huán)境紊亂，并引發(fā)腦膜炎[29-30]。在這5個(gè)不同組織中，經(jīng)無乳鏈球菌感染后，尼羅羅非魚Tmbim6的表達(dá)均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性上調(diào)。TMBIM 6主要通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑發(fā)揮對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)功能，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑中，TMBIM 6可抑制UPR途徑中IRE1α的蛋白活性并阻止其下游JNK的激活，從而通過抑制Caspase 12來阻止細(xì)胞凋亡[6]。在線粒體凋亡過程中，細(xì)胞色素C通過線粒體外膜的膜孔釋放出來，與凋亡激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，APAF-1)結(jié)合，激活Caspase-9，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在這個(gè)過程中，Bax利于線粒體膜孔的形成，促進(jìn)凋亡蛋白的釋放，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]；而人的TMBIM 6蛋白可抑制小鼠Bax的促凋亡作用，說明TMBIM 6有抑制細(xì)胞凋亡的作用[4]。本研究中，Tmbim6的表達(dá)上調(diào)，暗示尼羅羅非魚TMBIM 6在這5個(gè)組織中發(fā)揮細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)功能以響應(yīng)機(jī)體的感染應(yīng)激過程。此外，TMBIM 6還可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的功能中發(fā)揮重要作用。本研究中，尼羅羅非魚的肝臟、頭腎和腦組織在無乳鏈球菌刺激后，Tmbim6的表達(dá)量在初期有所下降，可能是缺乏TMBIM 6后，淋巴細(xì)胞內(nèi)胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子水平升高，導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能出現(xiàn)障礙，故抑制了細(xì)胞免疫[10]。在溶藻弧菌感染暗紋東方鲀[15]及鰻弧菌感染克氏螯蝦[16]后，Tmbim6的表達(dá)量也顯著上調(diào)，與本研究結(jié)果類似。綜上，尼羅羅非魚TMBIM 6參與了無乳鏈球菌感染應(yīng)激過程，其參與的細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)作用因器官或組織不同而有所差別。

本研究中，經(jīng)Poly I：C刺激后，尼羅羅非魚各組織中Tmbim6的表達(dá)量在3～6 h時(shí)顯著上升，且呈時(shí)間依賴性表達(dá)，說明TMBIM 6在響應(yīng)病毒刺激時(shí)較細(xì)菌刺激更迅速且敏捷。值得注意的是，Poly I：C模擬病毒刺激后，腦組織中Tmbim6的表達(dá)量比其他組織低且波動(dòng)不大，這可能是由于魚類血腦屏障的存在，阻止有害物質(zhì)入侵，維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[31]。據(jù)相關(guān)研究顯示，石斑魚虹彩病毒感染斜帶石斑魚、白斑綜合征病毒感染克氏螯蝦及急性病毒性壞死癥病毒感染櫛孔扇貝后，Tmbim6的表達(dá)量皆顯著升高[14，16-17]，這表明TMBIM 6參與了抗病毒應(yīng)激的細(xì)胞凋亡和免疫過程，與本研究結(jié)果類似。有趣的是，試驗(yàn)魚被Poly I：C與無乳鏈球菌感染后，各組織中的Tmbim6表達(dá)量有所差異，可能是不同的刺激源誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激類型、細(xì)胞凋亡程度或者凋亡途徑有所不同[32]。TMBIM 6的主要功能是保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其在尼羅羅非魚中的高表達(dá)表明，TMBIM 6是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡具有重要意義。

綜上，尼羅羅非魚TMBIM 6參與了Poly I：C刺激和無乳鏈球菌感染應(yīng)激過程，在響應(yīng)應(yīng)激過程中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及免疫的功能。

4 結(jié)論

1)從尼羅羅非魚中克隆并鑒定了Tmbim6基因，生物信息分析表明，尼羅羅非魚TMBIM 6蛋白與其他物種的TMBIM 6蛋白相似，含有6個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)保守的C-末端基序，說明TMBIM 6在進(jìn)化上高度保守。

2)亞細(xì)胞定位顯示，尼羅羅非魚TMBIM 6主要位于細(xì)胞質(zhì)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Tmbim6過表達(dá)后極顯著性抑制NF-κB通路。說明尼羅羅非魚TMBIM 6 與其他物種的TMBIM 6 具有相似的結(jié)構(gòu)與功能特征。

3)尼羅羅非魚Tmbim6基因在所檢測(cè)組織中廣泛分布，其中，在肝臟和肌肉中的表達(dá)量最高，在腸道、腦、皮膚和鰓中的表達(dá)水平相對(duì)較高，表明該基因在免疫應(yīng)答中起重要作用。

4)在無乳鏈球菌和Poly I：C病毒類似物刺激后，尼羅羅非魚Tmbim6的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明TMBIM 6參與了尼羅羅非魚無乳鏈球菌感染和病毒刺激后的細(xì)胞應(yīng)激過程和免疫反應(yīng)。