桃紅四物湯對(duì)急性腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積的影響研究

錢麗華 晁海鵬 岳豪祥

急性缺血性腦卒中具有病情危重、臨床處理難度大、并發(fā)癥較多等特點(diǎn),已成為導(dǎo)致人類殘疾和死亡的重要原因［1］。對(duì)于急性缺血性腦卒中,臨床堅(jiān)持疏通堵塞血管、堵塞血管再灌流的治療原則,但易出現(xiàn)神經(jīng)損傷等不良事件,影響預(yù)后效果［2,3］。臨床研究發(fā)現(xiàn),桃紅四物湯具有活血養(yǎng)血、抗血栓、改善微循環(huán)等作用,已廣泛用于治療急性缺血性腦卒中［4］。本研究就桃紅四物湯在小鼠急性CIR 中的作用進(jìn)行分析,詳細(xì)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取2020 年10 月～2022 年10 月90 只健康小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨機(jī)分為假手術(shù)組、CIR 模型組、桃紅四物湯組,每組30 只。小鼠均來自于南京君科生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及給藥方法

1.2.1.1 模型建立方法 CIR 模型組、桃紅四物湯組小鼠使用大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)建立缺血模型,具體方法為：取0.1 ml/10 g 的4%水合氯醛注入小鼠腹腔,完成腹腔注射麻醉處理后固定小鼠的背部,沿著頸正中線做一個(gè)手術(shù)切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,結(jié)扎、電凝游離頸外動(dòng)脈。頸總動(dòng)脈近心端進(jìn)行結(jié)扎處理,找準(zhǔn)頸外動(dòng)脈接近頸總動(dòng)脈分叉位置,利用顯微動(dòng)脈夾阻斷血流,使用剪刀沿著頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端剪一小切口,沿著小切口插入頭段用硅橡膠包裹的尼龍線(美國Docol 公司,直徑約為0.21 mm),松開動(dòng)脈夾,將尼龍線緩慢推入至大腦中動(dòng)脈起始端(自頸外動(dòng)脈分叉處算起8～9 mm),結(jié)扎固定。手術(shù)過程中小鼠體溫保持37℃,利用多普勒血流儀監(jiān)測(cè)血流情況,梗死2 h后采用乙醚進(jìn)行吸入麻醉后,緩慢拔出尼龍線,隨后電凝頸外動(dòng)脈,松開頸總動(dòng)脈結(jié)扎線后進(jìn)行再灌。假手術(shù)組只進(jìn)行血管分離,不進(jìn)行其他操作。

1.2.1.2 給藥方法 ①桃紅四物湯組：桃紅四物湯組方為桃仁、當(dāng)歸、紅花、遠(yuǎn)志、川芎、丹參、白芍、天麻及陳皮各10 g,熟地黃15 g,地龍6 g,將上述藥物混合倒入砂鍋中,砂鍋中加入1000 ml 清水,開大火進(jìn)行煎煮,煎煮至濃度為1 g/ml 的藥液后關(guān)火,放在溫度為4℃的冰箱中冷藏。小鼠給予1 ml/(100 g·d)桃紅四物湯灌胃,1 次/d,連續(xù)15 d。②假手術(shù)組、CIR 模型組：兩組均采用等體積蒸餾水進(jìn)行灌胃,1 次/d,連續(xù)15 d。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定方法 三組小鼠分別根據(jù)3 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)［MCAO 前(手術(shù)前)及MCAO 再灌后24 h、1 周(CIR 24 h、1 周)］再分配后進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的測(cè)定,每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)分配10 只小鼠。

1.2.2.1 小鼠腦血流測(cè)定方法 利用激光多普勒血流測(cè)定儀測(cè)量局部腦血流,操作方法為：將光纖探頭放在小鼠顱骨上矢狀縫左側(cè)3.5 mm、冠狀縫后1 mm 位置,將其作為缺血中心區(qū),利用多普勒血流測(cè)定儀配套的固定器固定光纖探頭檢測(cè)手術(shù)前及CIR 24 h、1 周腦血流值,穩(wěn)定5 min 后開始記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.2 小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)定方法 利用Longa5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估三組手術(shù)前及CIR 24 h、1 周小鼠神經(jīng)功能缺損程度,具體標(biāo)準(zhǔn)為：小鼠未存在神經(jīng)功能缺失癥狀,可以正常活動(dòng),評(píng)定為0 分；小鼠不能伸展對(duì)側(cè)前爪,評(píng)定為1 分；小鼠爬行時(shí)出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象,視為2 分；小鼠行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒,視為3 分；小鼠不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失,評(píng)定為4 分。分?jǐn)?shù)越高,評(píng)定為小鼠神經(jīng)功能缺損程度越嚴(yán)重。

1.2.2.3 小鼠腦梗死體積測(cè)定方法 利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法測(cè)定小鼠腦梗死體積,詳細(xì)方法為：三組于3 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)各取5 只小鼠于手術(shù)前及CIR 24 h、CIR 1 周完成腦血流值、神經(jīng)功能缺損評(píng)定測(cè)定后快速斷頭取腦,獲取腦組織后在-20℃的冰箱中速凍30 min,然后去掉嗅球、小腦和低位腦干部位,腦組織從額極向后做連續(xù)冠狀切成5 片,將腦片放入溫度為37℃的TTC 燃料中進(jìn)行溫浴,溫浴時(shí)間控制在30 min。染色結(jié)果中的白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ涝?紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織。使用數(shù)碼相機(jī)拍照,利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死面積,計(jì)算腦梗死體積占大腦總體積的百分比。

1.2.2.4 小鼠腦含水量測(cè)定方法 三組于3 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)各取另外5 只小鼠于手術(shù)前及CIR 24 h、CIR1 周完成腦血流值、神經(jīng)功能缺損評(píng)分測(cè)定后對(duì)小鼠進(jìn)行深度麻醉處理后斷頭取腦,去掉嗅球、小腦和低位腦干,稱取大腦濕重,在溫度為105℃的環(huán)境中烘烤48 h,直至恒重為止,精確稱量干重,計(jì)算含水量。

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組腦血流值、神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦含水量,分別記錄手術(shù)前及CIR 24 h、1 周患者的腦血流值、神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦含水量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn),多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠腦血流值比較 手術(shù)前,三組小鼠腦血流值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CIR 24 h、CIR 1 周,CIR 模型組、桃紅四物湯組小鼠腦血流值均低于假手術(shù)組,但桃紅四物湯組小鼠高于CIR 模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 三組小鼠腦血流值比較(,ml/min)

表1 三組小鼠腦血流值比較(,ml/min)

注：與假手術(shù)組比較,aP＜0.05；與CIR 模型組比較,bP＜0.05

2.2 三組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 手術(shù)前、CIR 24 h、CIR 1 周,三組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0 分；CIR 24 h、CIR 1 周,假手術(shù)組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0 分,未見神經(jīng)功能缺損。CIR 24 h、CIR 1 周,桃紅四物湯組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為(2.65±0.11)、(0.38±0.06)分,均低于CIR 模型組的(3.12±0.67)分、(0.98±0.23)分,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 三組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(,分)

表2 三組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(,分)

注：與CIR 模型組比較,aP＜0.05

2.3 三組小鼠腦梗死體積比較 手術(shù)前、CIR 24 h、CIR 1 周,三組小鼠腦梗死體積均為0；CIR 24 h、CIR 1 周,假手術(shù)組小鼠腦梗死體積均為0。CIR 24 h、CIR 1 周,桃紅四物湯組小鼠腦梗死面積分別為(20.63±1.59)%、(12.78±1.03)%,均低于CIR 模型組的(26.75±2.14)%、(16.73±1.56)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 三組小鼠腦梗死體積比較(,%)

表3 三組小鼠腦梗死體積比較(,%)

注：與CIR 模型組比較,aP＜0.05

2.4 三組小鼠腦含水量比較 手術(shù)前,假手術(shù)組、CIR 模型組、桃紅四物湯組小鼠的腦含水量分別為(76.14±3.12)%、(76.36±3.28)%、(76.72±3.49)%,比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；CIR 24 h、CIR 1 周,桃紅四物湯組小鼠的腦含水量分別為(78.14±0.23)%、(77.85±0.11)%,假手術(shù)組分別為(80.59±1.02)%、(78.64±0.57)%,CIR 模型組分別為(76.15±0.63)%、(76.11±0.24)%,桃紅四物湯組、CIR 模型組小鼠的腦含水量高于假手術(shù)組,但桃紅四物湯組小鼠低于CIR 模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 三組小鼠腦含水量比較(,%)

表4 三組小鼠腦含水量比較(,%)

注：與假手術(shù)組比較,aP＜0.05；與CIR 模型組比較,bP＜0.05

3 討論

急性缺血性腦卒中在臨床較為常見,是指在多種因素共同作用下使得腦部組織血液供應(yīng)障礙,導(dǎo)致局部腦組織缺血、缺氧性壞死的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,臨床上表現(xiàn)為意識(shí)模糊、偏癱、昏迷、失語等癥狀［5,6］。溶栓、血管內(nèi)介入術(shù)是臨床治療缺血性腦卒中的重要方案,有利于提高血管再通率,但在某些情況下缺血后再灌注并未達(dá)到使缺血組織受益的目的,反而會(huì)加重功能障礙和病情惡化,引發(fā)CIR,影響預(yù)后結(jié)局［7］。因此,如何抑制急性腦缺血再灌注中神經(jīng)損傷、改善預(yù)后結(jié)局是臨床研究的熱門課題。

由于臨床尚未完全明確急性CIR 的發(fā)病機(jī)制,故對(duì)于其側(cè)重于對(duì)癥支持、西醫(yī)藥物治療為主,但效果不理想。隨著傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的發(fā)展,中醫(yī)療法成為疾病治療的重要手段,引起臨床的廣泛關(guān)注。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性CIR 的主要病機(jī)為瘀血阻滯,臨床治療的關(guān)鍵為養(yǎng)血活血、祛瘀生新［8］。桃紅四物湯是臨床治療腦缺血疾病的重要中藥組方,組方中的桃仁、川芎能活血祛瘀；當(dāng)歸可以活血止痛、補(bǔ)血調(diào)經(jīng)；紅花能活血通經(jīng)、散瘀止痛；遠(yuǎn)志可以養(yǎng)心安神、祛痰止咳；丹參能祛瘀止痛、活血；白芍可以養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛；天麻能息風(fēng)止痙、祛風(fēng)通絡(luò)；陳皮可以燥濕化痰、健脾開胃；熟地黃能滋陰補(bǔ)血；地龍可以清熱息風(fēng)、止咳平喘；諸藥合用具有養(yǎng)血活血、祛瘀生新的作用［9-11］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),桃紅四物湯對(duì)血小板的聚集具有抑制作用,可有效改善微循環(huán),發(fā)揮抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保護(hù)神經(jīng)功能等作用［12］。隨著桃紅四物湯在臨床應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大,桃紅四物湯保護(hù)神經(jīng)功能的藥理作用逐漸受到重視。本次結(jié)果顯示,CIR 24 h、CIR 1 周,桃紅四物湯組的腦血流值高于CIR 模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CIR 24 h、CIR 1 周,桃紅四物湯組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于CIR 模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CIR 24 h、CIR 1 周,桃紅四物湯組的腦梗死面積小于CIR 模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CIR 24 h、CIR 1 周,桃紅四物湯組的腦含水量低于CIR 模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此提示桃紅四物湯能增加急性CIR小鼠的腦血流值,減輕神經(jīng)功能缺損程度,縮小腦梗死體積。

綜上所述,桃紅四物湯在小鼠急性CIR 中效果顯著,有利于增加腦血流值,減輕神經(jīng)功能缺損程度,縮小腦梗死體積,減少腦含水量,值得臨床推廣應(yīng)用。