陳佩 胡小云

已知多種中草藥具廣譜抗病毒作用,尤其是清熱解毒類中藥,包括板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、穿心蓮和野菊花等,對多種病毒具抑制作用,如呼吸道合胞病毒(HSV)、甲型流感病毒、單純皰疹病毒和登革熱病毒(DEN)等。這些藥物的活性成分或直接作用于病毒,或通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)實現(xiàn)抗病毒作用。迄今為止,已報道的活性成分以化學(xué)物質(zhì)為主,例如板藍(lán)根中的靛藍(lán)對HSV 具顯著抑制效果；魚腥草中的黃酮類成分可抑制多種病毒,其中金絲桃苷可有效抑制DEN；野菊花中的野菊花黃酮對人類免疫缺陷病毒(HIV)的抑制效率甚至高于病毒唑［1］。

MicroRNA 是一類內(nèi)源性的、長度為21～25 nt 的單鏈小分子RNA,廣泛存在于真核生物中,具高度保守性；在生物體內(nèi),microRNA 通過與mRNA 完全或不完全互補,在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生理作用。從2002 年證實植物中microRNA 的存在以來,植物microRNA 領(lǐng)域研究進展迅猛。在藥用植物領(lǐng)域,自從2015 年Zhou等［2］發(fā)現(xiàn)金銀花來源的植物microRNA,miR2911 可通過口服途徑進入動物體并抑制水痘-帶狀皰疹病毒的復(fù)制,植物microRNA 對動物體的“跨界調(diào)控”作用逐漸成為研究熱點。多種藥用植物中具跨界調(diào)控活性的microRNA 被發(fā)現(xiàn)。邵紅偉等［3］報道,甘草miRNA 對人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的生長具有促進作用,并能顯著增加HLA-DR+細(xì)胞亞群的比例；Yang 等［4］發(fā)現(xiàn),丹參中的Sal-miR-1 和Sal-miR-3 可在小鼠中調(diào)節(jié)OTUD7B/KLF4/NMHC ⅡA 軸,抑制血管重構(gòu)。

然而,上述對具跨界調(diào)控活性植物microRNA 的研究皆屬于對作用機理的探索,含活性植物microRNA 受試物的制備僅限于實驗室規(guī)模,經(jīng)驗尚不能支持工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn),亦不清楚將活性植物microRNA 作為有效成分的工業(yè)規(guī)模產(chǎn)品在質(zhì)量控制和有效性方面的可行性。本研究以含miR2911 的清熱解毒類中藥為原料,確立了一套以miR2911 為有效成分的新型抗病毒產(chǎn)品的制備工藝,并對以本制備工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品進行了質(zhì)量及穩(wěn)定性研究,皆獲得了積極結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣本中miR2911 含量的檢測

1.1.1 樣本處理 取1～10 g 樣本,200 ml 沸水溶解,過濾后取50 μl 上清提取,600 μl 水洗脫。TRizol 法提取核酸。

1.1.2 實時熒光定量核酸擴增檢測(qPCR)條件 引物、探針序列：R ：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgg atacgactcccag；UR：agtgcagggtccgaggtatt；F：aatacggggga cgggct。

1.1.3 逆轉(zhuǎn)錄體系(共10 μl) dNTPs,1 μl;RNA 模板(1/1000),2 μl;HS-1R(1/500),1 μl;M-mlv,0.3 μl;(5×Buffer),2 μl;DEPC 水,3.7 μl。

1.1.4 qPCR反應(yīng)體系(共20 μl) 2×SYBR Green Master Mix,10 μl；正向引物 (HS-1F1/500),1 μl；反向引物 (UR1/500),1 μl；模板DNA,2 μl；DEPC 水,6 μl。

1.1.5 反應(yīng)程序 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：(分段) 65℃5 min →4℃ 2 min →4℃+∞→42℃ 60 min →70℃10 min →4 ℃+∞。qPCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min →40 循環(huán)(95℃ 10 s →60℃ 30 s →72℃ 20 s)→95℃15 s →60℃ 60 s →95℃ 30 s。

1.2 原料粉碎粒徑研究 將原料采用手工磨碎、破壁機磨碎以及粉碎機粉碎等三種粉碎法制粉(粒徑差異大),或?qū)⒃戏謩e粉碎10、15、20、30 s 后,比較樣本miR2911 溶出效果差異。

1.3 提取料液比研究 包括變料(原料)定液(提取液)和定料變液研究。將提取液體積固定,不斷加大原料投料量,研究提取液溶出上限。然后,將原料投料量固定,研究不同體積提取液對提取的影響。

1.4 提取溫度、方式和時間研究 其他提取條件不變,研究70℃熱水、沸水兩種提取溫度條件對原料中miR2911 溶出的影響。同時,研究浸泡和煎煮兩種提取溫度維持方式下miR2911 溶出效果的差別。在選定上述兩種條件后,研究0～12 min 提取時長范圍內(nèi)每延長2 min 對miR2911 溶出的影響。

2 研究結(jié)果

2.1 原料篩選 檢測多種中草藥飲片中miR2911 含量,參考各飲片中miR2911 含量進行原料篩選。檢測數(shù)據(jù)顯示：各飲片中miR2911 含量不同,其中金銀花最高,野菊、綠茶、大青葉、桂花、黃柏等含量較高。選擇miR2911 含量較多的飲片進行提取工藝研究。因綠茶來源多、有效成分變化較大,不利于質(zhì)量控制,故舍棄。此外,甜菊葉是花草茶常用的調(diào)味劑之一,其所含甜菊糖具有高甜度、低熱量的特點；且其含有較高水平的miR2911,即可能也具抗病毒活性,因此將其納入配方中。候選組合配方包括：金銀花、甜菊葉、野菊、大青葉、桂花。

2.2 提取工藝初步研究 基于金銀花單方進行提取工藝初步研究,包括原料粉碎粒徑、提取料液比及提取溫度、方式和時間。

2.2.1 原料粉碎粒徑 采用粉碎機粉碎、破壁機磨碎和手工磨碎的原料,miR2911 含量檢測結(jié)果(MEAN CT：2.61、13.57、15.54)表明,粒徑越細(xì)越容易溶出,結(jié)合生產(chǎn)可行性,暫定粒徑≥200 目。

2.2.2 提取料液比

2.2.2.1 變料定液 將浸出液體積固定為200 ml,不斷加大金銀花投料量,研究浸出液溶出上限,結(jié)果顯示200 ml 提取液,金銀花投料上限約為5 g。保持此料液比不變,做6 倍的等比放大工藝研究,結(jié)果與前述結(jié)論基本一致,因此將金銀花的投料上限暫定為4 g。見表1。

表1 變料定液

2.2.2.2 定料變液 在前期樣本處理方法研究中,已發(fā)現(xiàn)當(dāng)飲片粉末與純水之比過高時,檢測結(jié)果已超出PCR 方法的最適范圍,導(dǎo)致無法繼續(xù)研究,并測得料液比最高值為1∶20。在此,將金銀花投料量固定為1 g,研究不同體積(100、200、400、800、1600 ml)提取液對提取效果的影響。結(jié)果(MEAN CT：23.78、22.89、24.39、25.05、26.40)顯示,當(dāng)料液比在1∶1600 范圍內(nèi),樣品檢測有效,并能顯示出濃度差異。但1∶1600時檢測值接近水背景,不再予以考慮。1∶200～1∶100溶出基本穩(wěn)定飽和。因此料液比設(shè)定在1∶200～1∶100,甚至更高程度為宜,但要低于1∶20。

2.2.3 提取溫度、方式和時間 首先確認(rèn)沸水相較于70℃熱水的提取優(yōu)勢明顯。結(jié)果顯示,提取樣本中miR2911 含量差異高達8～32 倍。然后,研究浸泡和煎煮兩種方式下提取效果的差異。結(jié)果顯示,兩種方式下,miR2911 的溶出量并無差別。

在已選定的提取方法,即沸水浸泡的基礎(chǔ)上,研究不同浸泡時長(0、2、4、6、8、10、12 min)對miR2911提取效果的影響；結(jié)果(MEAN CT：20.71、18.90、16.09、14.11、16.27、15.92、16.13)顯示,浸泡時間＜4 min 時,對溶出有明顯幫助。因此選取最佳浸泡時長為2～8 min。

2.2.4 提取工藝初步小結(jié) 基于金銀花單種原料的提取工藝初步研究建立的條件包括：采用粉碎機粉碎,樣本粉碎粒徑≥200 目；金銀花與浸出液投料比為1∶200～ 1∶20；沸水浸泡2～8 min。

3 提取工藝優(yōu)化和確認(rèn)

利用在飲片篩選時確定的候選組合配方,即原料包括：金銀花、甜菊葉、野菊、大青葉、桂花,對上述初步提取工藝進行確認(rèn)?；诮Y(jié)果2.2.1,進一步驗證主要原料金銀花在200 ml 提取液中的提取上限。保持野菊(1 g)和甜菊葉(0.1 g)重量不變,不同重量金銀花(2、3、4、5、6 g)的組合配方,提取樣本中miR2911 含量(MEAN CT)分別為19.00、19.11、17.31、18.24、19.92。結(jié)果顯示,在組合配方中,金銀花的最佳重量仍為4 g?；谏鲜鼋Y(jié)果,繼續(xù)研究其他成分不同重量時的組合配方的miR2911 提取效果。結(jié)果顯示,當(dāng)金銀花為4 g 時,甜菊葉0.1 g、野菊0.5 g、大青葉0.1 g、桂花0.2 g 的組合有效成分提取效果最佳。

稱取配方為“金銀花(4 g)+甜菊葉(0.1 g)+野菊(0.5 g)+大青葉(0.1 g)+桂花(0.2 g)”的組合原料,及配方為“金銀花(4.9 g)”的單方原料,分別粉碎10 s后裝入茶包中,加入200 ml 100℃的純水,浸泡5 min后,對浸出液進行miR2911 的提取和檢測,檢測結(jié)果(MEAN CT：17.97、16.63)顯示,組合配方優(yōu)于單方。

采用上述組合配方的原料對提取工藝進行優(yōu)化和確認(rèn),得到原料粒徑20～200 目,原料與提取液投料比為1∶320～1∶20,溫度在80～90℃,浸泡時間在5～10 min。

4 產(chǎn)品定型及質(zhì)量研究

針對袋泡茶和飲料兩種產(chǎn)品類型,進一步開展產(chǎn)品定型研究,主要包括滅菌工藝、調(diào)味、包裝材料、使用方式等。

4.1 袋泡茶 基于提取工藝研究結(jié)果,以提取液中miR2911 含量到達頂峰為指標(biāo),選定配方為金銀花4～8 g、甜菊葉0.1～0.2 g、野菊0.5～1.0 g、大青葉0.1～0.2 g、桂花0.2～0.4 g,即本品單位總重為10 g 左右,符合市場同類產(chǎn)品一般規(guī)格。浸泡時長5～10 min,提取液中miR2911 濃度最高。

4.1.1 沖泡體積 將選定配方的原料按經(jīng)確認(rèn)的工藝處理后,用不同體積(100、200、400、800、1600 ml)的沸水沖泡5 min 后,檢測茶湯中miR2911 含量,結(jié)果(MEAN CT：17.85、17.72、20.79、22.26、23.08) 顯示,200 ml 以內(nèi)沸水沖泡可以保持穩(wěn)定的近飽和狀態(tài),1600 ml 沖泡后濃度較低。

4.1.2 包裝材料 調(diào)查市場常用的三種材質(zhì)濾袋分別為無紡布濾袋、尼龍濾袋及濾紙濾袋,選取120 目左右的濾袋進行實驗。各制備12 份茶包沖泡2 min,檢測miR2911 含量,結(jié)果(MEAN CT：18.85、17.73、16.31)顯示,尼龍濾袋效果最好,濾紙次之,無紡布效果最差。結(jié)合材質(zhì)特征分析,認(rèn)為三種材質(zhì)皆可用作濾袋,其中優(yōu)選孔徑≥120 μm 的濾紙和尼龍濾袋,最優(yōu)選為尼龍濾袋。

經(jīng)用法及包材研究,最終選定配方為金銀花4～8 g,甜菊葉0.1～0.2 g,野菊0.5～1.0 g,大青葉0.1～0.2 g,桂花0.2～0.4 g；用法為沸水200 ml,沖泡5～10 min,一次飲用；包材可為孔徑≥120 μm 的濾紙和尼龍濾袋,最優(yōu)選為尼龍濾袋。

4.1.3 穩(wěn)定性 基于36 份袋泡茶產(chǎn)品進行檢測,最終將出廠標(biāo)準(zhǔn)中的miR2911 含量定為＜16.79 CT+2 SD。

對袋泡茶產(chǎn)品進行4 個月的質(zhì)量穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)：前兩個月袋泡茶含量穩(wěn)定,第3、4 個月開始含量降低,考慮可能為系統(tǒng)背景降低導(dǎo)致的整體數(shù)據(jù)后移。因此,將袋泡茶產(chǎn)品的保質(zhì)期定為2 個月。見表2。

表2 袋泡茶穩(wěn)定性

4.2 飲料

4.2.1 滅菌工藝 考慮飲料一般采用后滅菌工藝,產(chǎn)品需經(jīng)歷高溫高壓過程,因此研究高溫高壓過程對miR2911 成份的影響,結(jié)果顯示,在121℃高溫高壓滅菌條件下,制品中的miR2911 含量在0、3、5、10、20、30 min 時幾乎沒有變化。

4.2.2 調(diào)味 在飲料原液中加入A、B 兩種風(fēng)味添加劑調(diào)味,攪拌均勻后,檢測miR2911 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加劑調(diào)味后對檢測影響非常大,不能正常評估m(xù)iR2911 含量(MEAN CT：A 風(fēng)味,28.89;B 風(fēng)味,28.57；水,23.80),因此飲料不添加食品添加劑。

4.2.3 穩(wěn)定性 基于54 份飲料進行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立,最終確定飲料的出廠標(biāo)準(zhǔn)中miR2911 含量為CT 值＜17.84 CT+1.2 SD。對飲料進行3 個月的穩(wěn)定性研究,確認(rèn)飲料的保質(zhì)期為3 個月。見表3。

表3 飲料穩(wěn)定性

4.3 與市售產(chǎn)品的比較 將各種市售產(chǎn)品采用一次口服用量兌200 ml水溶解,飲片以1 g兌300 ml沸水粉碎。250 μl 提取,60 μl 洗脫,結(jié)果表明,金銀花中miR2911含量有絕對優(yōu)勢,在市的食品/藥品中僅××感冒通片具有可觀含量,但是含miR2911 量至少較金銀花飲片低10 倍以上,且與以本研究制備工藝制得的袋泡茶或飲料相比,miR2911 的含量都顯著不足。見表4。

表4 市售產(chǎn)品miR2911 含量檢測

5 討論

經(jīng)過一系列工藝研究,本研究確立了包括金銀花的中草藥單方和/或復(fù)方組合物為原料的提取工藝,以及袋泡茶和飲料產(chǎn)品的完整制備工藝。提取工藝參數(shù)主要包括：原料粒徑20～200 目,原料與提取液投料比在 1∶320～1∶20 范圍內(nèi),溫度為80～90℃,浸泡時間為5～10 min。袋泡茶最終選定配方為金銀花4～8 g,甜菊葉0.1～0.2 g,野菊0.5～1.0 g,大青葉0.1～0.2 g,桂花0.2～0.4 g；用法為沸水200 ml,沖泡5～10 min,一次飲用；包材可為孔徑≥120 μm 的濾紙和尼龍濾袋,最優(yōu)選為尼龍濾袋。飲料制備工藝采用中草藥飲片復(fù)配提取、終端滅菌,不添加食品添加劑。以本研究制備工藝制得的袋泡茶和飲料產(chǎn)品,其miR2911 含量遠(yuǎn)高于市售產(chǎn)品,且可在2 或3 個月內(nèi)保持質(zhì)量穩(wěn)定。

在本研究之前,藥用植物中的microRNA 研究發(fā)現(xiàn)并證實了具跨界調(diào)控活性植物microRNA 的作用機理,提出了一套評估藥用植物治療活性的新理論。本研究基于這些發(fā)現(xiàn)和理論,首次研究了以具跨界調(diào)控活性植物microRNA 為活性成分產(chǎn)品的制備工藝,并證實了以本工藝制得產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性優(yōu)勢,對上述新理論的實際應(yīng)用具有重要意義。