陳祥宇，張晶涵，賴嘉豪，張文麗，梅志剛*，聶慧芳*

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學(xué)·

基于數(shù)據(jù)挖掘的益氣活血類方防治腦缺血再灌注損傷用藥規(guī)律及其作用機(jī)制研究

陳祥宇1, 2，張晶涵1, 2，賴嘉豪1, 2，張文麗3，梅志剛1, 2*，聶慧芳1, 2*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

探討急性缺血性卒中溶栓治療后使用益氣活血類方劑干預(yù)的用藥規(guī)律，預(yù)測(cè)核心藥物防治腦缺血再灌注損傷的潛在作用機(jī)制。檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬方、維普和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中急性缺血性卒中溶栓治療后使用益氣活血類方有效干預(yù)的文獻(xiàn)，對(duì)方中使用的藥物進(jìn)行頻數(shù)、聚類及關(guān)聯(lián)分析，依據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則選取置信度和支持度最高的核心藥物，構(gòu)建核心藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。共篩選納入232篇文獻(xiàn)，涉及中藥處方177首，包含中藥119味，累計(jì)使用頻次1903，以黃芪為首的高頻藥物28味，所有藥物按功效可分為16種，藥味總頻次191，歸經(jīng)總頻次292。高頻藥物聚類分析得到5個(gè)聚類，關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得到20組支持度較高的中藥組合，其中支持度與置信度最高的二聯(lián)藥物組合為“黃芪-川芎”，三聯(lián)藥物組合為“黃芪-川芎-地龍”。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析收集黃芪、川芎、地龍的活性成分30個(gè)；篩選“黃芪-川芎”防治腦缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)91個(gè)，“黃芪-川芎”-地龍防治腦缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)34個(gè)；主要涉及癌癥相關(guān)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路、微小RNAs（microRNAs）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路。益氣活血類方治療急性缺血性卒中的核心藥物為黃芪、川芎和地龍，KEGG通路富集分析表明核心藥物防治腦缺血再灌注損傷涉及多條信號(hào)通路，為指導(dǎo)臨床采用益氣活血法防治缺血性卒中提供依據(jù)，并為研發(fā)相關(guān)創(chuàng)新藥物提供數(shù)據(jù)參考。

缺血性卒中；腦缺血再灌注損傷；益氣活血；數(shù)據(jù)挖掘；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；配伍規(guī)律；黃芪-川芎；黃芪-川芎-地龍

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的高速發(fā)展，高壓力、快節(jié)奏的生活方式導(dǎo)致卒中的發(fā)病率逐年升高，對(duì)國(guó)民健康水平造成嚴(yán)重威脅[1]。其中，缺血性卒中最為多見，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[2-3]，盡快進(jìn)行血流再通、恢復(fù)缺血半暗帶區(qū)域的血供、延緩腦組織損傷是臨床治療的首要原則[4]。然而，腦缺血后的血流再通會(huì)繼發(fā)更為嚴(yán)重的二次損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI），進(jìn)一步加重病情[5]。因此，防治CIRI成為治療缺血性卒中的焦點(diǎn)。CIRI的病理過程極其復(fù)雜，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)，目前暫無特別理想高效的治療手段與藥物。中醫(yī)理論認(rèn)為，CIRI屬于“中風(fēng)”范疇，主要病機(jī)為氣虛血瘀，益氣活血為治療缺血性卒中的主要治法[6]。中醫(yī)藥治療具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多層次的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為探索更佳治療效果的熱門領(lǐng)域。諸多研究均已證明，以益氣活血立法的益氣活血類方在防治CIRI中具有一定的療效。本研究利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，綜合系統(tǒng)分析近10年來急性缺血性卒中溶栓治療后益氣活血類方的用藥規(guī)律，進(jìn)一步挖掘其用藥特點(diǎn)，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)挖掘所得的核心藥物的關(guān)鍵活性成分進(jìn)行篩選，闡明活性成分與CIRI交集靶點(diǎn)相互作用及通路，以期為中醫(yī)藥通過益氣活血法防治CIRI提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

檢索中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、萬方、維普和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)收集急性缺血性卒中溶栓治療后使用益氣活血類方有效干預(yù)的文獻(xiàn)。CNKI檢索式：SU＝'腦梗死'＋'缺血性中風(fēng)'＋'中風(fēng)'＋'腦卒中' AND SU＝'益氣' AND SU＝'活血'；萬方檢索式：主題：（"腦梗死" or "缺血性中風(fēng)" or "腦卒中" or "中風(fēng)"）and "益氣" and "活血"；維普檢索式：U＝（腦梗死OR缺血性中風(fēng)OR腦卒中OR中風(fēng)）AND U＝益氣AND U＝活血；PubMed檢索式：（ischemic stroke）AND [（Yiqi）OR（tonifying）]AND[（Huoxue）OR（promoting blood circulation）OR（activating blood）]，檢索年限為2012年1月1日—2022年11月8日，文獻(xiàn)類型選擇期刊論文和學(xué)位論文。

1.2 處方篩選

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 急性缺血性卒中溶栓治療后使用益氣活血類中藥內(nèi)服復(fù)方（湯劑、顆粒劑、膠囊、丸劑等）的臨床觀察試驗(yàn)、臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)以及中西醫(yī)結(jié)合治療方案中用到益氣活血類中藥內(nèi)服復(fù)方的文獻(xiàn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 綜述類、Meta分析類、理論探討類、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)類、細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等不屬于臨床觀察的文獻(xiàn)；非治療急性缺血性卒中的文獻(xiàn)；治療急性缺血性卒中伴有其他合并癥的文獻(xiàn)；發(fā)表在不同期刊上的重復(fù)文獻(xiàn)等。不同文獻(xiàn)中出現(xiàn)組成相同的方劑，取其中1首。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 文獻(xiàn)管理 將各數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出的文獻(xiàn)導(dǎo)入文獻(xiàn)管理軟件NoteExpress，在NoteExpress中剔除重復(fù)文獻(xiàn)，查閱文獻(xiàn)標(biāo)題、摘要及全文，根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)中的中藥處方錄入Excel 2016中建立數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)文獻(xiàn)名稱、處方名稱、處方藥物組成、藥物的性味歸經(jīng)等內(nèi)容進(jìn)行整理。數(shù)據(jù)庫(kù)所有信息均由本研究人員嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，并認(rèn)真核對(duì)。

1.3.2 數(shù)據(jù)規(guī)范化處理 以《中國(guó)藥典》2020年版[7]、《中藥學(xué)》“十四五”規(guī)劃教材[8]的中藥命名為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)涉及的中藥藥名進(jìn)行統(tǒng)一，如將“川穹”規(guī)范為“川芎”，“山萸肉”規(guī)范為“山茱萸”，“仙靈脾”規(guī)范為“淫羊藿”等；統(tǒng)一炮制方法對(duì)中藥的功效及性味歸經(jīng)影響不大的藥物名稱，如“焦山楂”規(guī)范為“山楂”，“法半夏”“姜半夏”“清半夏”規(guī)范為“半夏”等；同一中藥因不同炮制方法使其功效發(fā)生變化的歸為不同藥物，如“甘草”“炙甘草”和“生地黃”“熟地黃”等。檢查數(shù)據(jù)并正確匯總后，統(tǒng)計(jì)藥物的功效及性味歸經(jīng)，若1味中藥有多種性味歸經(jīng)，則全部記錄在內(nèi)。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 采用IBM SPSS Modeler18.0和IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分別進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類分析，并繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖和聚類樹狀圖。關(guān)聯(lián)規(guī)則是反映一個(gè)事物與其他事物之間的相互依存性，用來說明2種藥物之間的關(guān)聯(lián)性，選擇Apriori算法進(jìn)行建模處理挖掘藥物與藥物之間的潛在規(guī)律，支持度反映2種藥物同時(shí)出現(xiàn)的概率，置信度反映一種藥物出現(xiàn)后另一種藥物出現(xiàn)的概率，提升度反映一種藥物的出現(xiàn)對(duì)另一種藥物的出現(xiàn)概率產(chǎn)生的變化。聚類分析是將數(shù)據(jù)分類到不同的類或簇，同一簇中的事物有很大的相似性，不同簇間的事物有很大的相異性，用來說明幾種藥物之間的共性。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(kù)（TCM@TAIWAN，http://tcm.cmu.edu.tw/ zh-tw/）中查找核心藥物的全部活性成分，通過評(píng)價(jià)活性成分的體內(nèi)過程，用口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18進(jìn)行篩選[9]。利用PubChem（https:// pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）找到活性成分的規(guī)范化學(xué)結(jié)構(gòu)式，并使用SwissTargetPrediction（http://www. swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，歸納整理出藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。在OMIM（http://www. omim.org/）和Genecard（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)采集與CIRI相關(guān)的基因靶點(diǎn)，建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。運(yùn)用Venny2.1.0工具（https://bioinfogp. cnb.csic.es/tools/venny/）繪制藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖，并獲得交集靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件將交集靶點(diǎn)進(jìn)行可視化，繪制核心藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，生物種屬選擇“homo sapiens”，將最低相互作用閾值設(shè)置為“high confidence（0.700）”，并隱藏游離蛋白，其他參數(shù)保持默認(rèn)。運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// david.ncifcrf.gov/）對(duì)藥物防治CIRI的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并運(yùn)用微生信在線作圖平臺(tái)（http://www.bioinformatics. com.cn/）進(jìn)行可視化，用以說明相關(guān)靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)納入情況

初步檢索文獻(xiàn)共計(jì)1825篇，根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終共納入232篇急性缺血性卒中溶栓治療后使用益氣活血類方的文獻(xiàn)，得到中藥處方177首，篩選流程見圖1。

2.2 中藥頻次分析

177首有效中藥處方共涉及119味中藥，所有藥物累計(jì)使用頻次1903次。其中，累計(jì)使用頻次≥15次的中藥28味，累計(jì)使用頻次1644次，占比86.4%。使用頻次排名前10位的中藥依次是黃芪、川芎、地龍、當(dāng)歸、赤芍、紅花、丹參、桃仁、水蛭、全蝎，見表1。

2.3 中藥功效分析

119味中藥按照藥物功效共分為16種，總頻次1903次，其中使用最多的為活血化瘀藥（648次，34.1%），其次為補(bǔ)虛藥（491次，25.8%），見圖2。

圖1 急性缺血性卒中溶栓后使用益氣活血類方治療文獻(xiàn)的篩選流程

表1 28味高頻藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.4 中藥性味歸經(jīng)分析

對(duì)119味中藥進(jìn)行性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)和分類，同一味中藥的不同性味歸經(jīng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將中藥藥性為微寒、微溫者統(tǒng)計(jì)為寒、溫。結(jié)果顯示，藥性總頻次119次，溫（49次，41.18%）和寒（33次，27.73%）居多；藥味總頻次191次，以苦（60次，31.41%）和甘（57次，29.84%）居多；歸經(jīng)總頻次292次，以肝經(jīng)（68次，23.29%）和脾經(jīng)（48次，16.44%）居多，見圖3。

圖2 119味中藥功效分布

2.5 高頻藥物的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

利用SPSS Modeler 18.0中的Apriori算法對(duì)28味高頻藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置最低支持度75%、最低置信度75%，最大前項(xiàng)數(shù)2，提升度大于1等條件挖掘中藥之間的配伍規(guī)律，共得到2項(xiàng)關(guān)聯(lián)藥物12組，見表2，3項(xiàng)關(guān)聯(lián)藥物8組，見表3，同時(shí)構(gòu)建28味高頻中藥的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。

圖3 119味中藥性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)

表2 高頻藥物2項(xiàng)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.6 高頻藥物的聚類分析

利用SPSS Statistics 25軟件對(duì)28味高頻藥物進(jìn)行聚類分析，選擇組間聯(lián)接、皮爾遜相關(guān)性算法，最大聚類數(shù)為10，最小聚類數(shù)為5，經(jīng)軟件運(yùn)算分析后得出高頻藥物聚類分析圖，以組間距離21為界，可以將高頻藥物分為5組，第1組：半夏、瓜蔞、茯苓、炙甘草、白術(shù)、甘草、天麻、石菖蒲、膽南星；第2組：雞血藤、僵蠶、葛根、生地黃；第3組：丹參；第4組：赤芍、牛膝、紅花、桃仁、當(dāng)歸、黃芪、地龍、川芎、全蝎、蜈蚣、水蛭、桂枝；第5組：黨參、三七，見圖5。

2.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

由關(guān)聯(lián)規(guī)則分析可知，高頻藥物中共同出現(xiàn)頻次最高、支持度與置信度最高、關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的二聯(lián)藥物組合是“黃芪-川芎”，三聯(lián)藥物組合是“黃芪-川芎-地龍”，由此可知，黃芪、川芎、地龍作為益氣活血類方的核心藥物治療急性缺血性卒中的可能性最大，因此，對(duì)核心藥物開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，探討“黃芪-川芎”藥對(duì)以及“黃芪-川芎”藥對(duì)和地龍加味治療CIRI的藥理學(xué)作用機(jī)制。

2.7.1 核心藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出黃芪的活性成分19個(gè)，川芎的活性成分7個(gè)，地龍的活性成分5個(gè)，見表4；預(yù)測(cè)到可能性值＞0的“黃芪-川芎”藥物靶點(diǎn)583個(gè)，地龍藥物靶點(diǎn)210個(gè)，篩選出相關(guān)性分值（relevance score）≥10的疾病靶點(diǎn)497個(gè)。韋恩圖分析得到“黃芪-川芎”與CIRI交集靶點(diǎn)91個(gè)，見圖6；“黃芪-川芎-地龍”與CIRI交集靶點(diǎn)106個(gè)，見圖7；“黃芪-川芎”-地龍-CIRI交集靶點(diǎn)34個(gè)，見圖8。針對(duì)以上交集靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2繪制出“黃芪-川芎”-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)中共有118個(gè)節(jié)點(diǎn)，352條邊，見圖9；“黃芪-川芎-地龍”-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)中共有139個(gè)節(jié)點(diǎn)，416條邊，見圖10。其中，黃色六邊形代表核心藥物，紅色四邊形代表化學(xué)成分，藍(lán)色橢圓代表交集靶點(diǎn)。

表3 高頻藥物3項(xiàng)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

圖4 28味高頻藥物關(guān)聯(lián)強(qiáng)度網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 28味高頻藥物聚類樹狀圖

2.7.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與GO和KEGG富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)生成PPI網(wǎng)絡(luò)圖，“黃芪-川芎”與CIRI的91個(gè)交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中共有91個(gè)節(jié)點(diǎn)，198條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.35，平均聚類系數(shù)為0.419，＜1.0×10?16，見圖11；“黃芪-川芎”-地龍與CIRI的34個(gè)交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中共有34個(gè)節(jié)點(diǎn)，69條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.06，平均聚類系數(shù)為0.554，＜1.0×10?16，見圖12，說明靶點(diǎn)基因之間的相互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Excel 2016?Cytoscape 3.7.2打開導(dǎo)出的“TSV”格式文件，繪制交集靶點(diǎn)網(wǎng)狀圖，顏色越紅，表示該靶點(diǎn)基因度值越大，說明通過該靶點(diǎn)防治CIRI的可能性越大，見圖13、14。分別將91個(gè)和34個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，經(jīng)＜0.01篩選后，選取前10個(gè)生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目可視化，見圖15、16。選取前20個(gè)KEGG通路富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖17、18。

3 討論

西醫(yī)所屬CIRI與中醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)”的臨床表現(xiàn)相似，臨床多將CIRI歸屬于“中風(fēng)”“卒中”范疇。卒中的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，歷代醫(yī)家對(duì)其病因病機(jī)的研究由來已久。早在《靈樞·刺節(jié)真邪論》提到：“虛邪偏客于身半，其入深，內(nèi)居營(yíng)衛(wèi)，營(yíng)衛(wèi)稍衰，則真氣去，邪氣獨(dú)留，發(fā)為偏枯?！敝赋稣鏆獠蛔?，邪氣則留居于身，說明卒中的發(fā)病與氣虛緊密相關(guān)[10]；《素問·玉機(jī)真藏論》中“急虛身中卒至，五藏絕閉，脈道不通，氣不往來”直接指出患者正氣暴虛，則外邪中人，氣機(jī)閉塞，脈道瘀阻[11]；《諸病源候論》[12]云：“半身不遂，脾胃氣弱，血?dú)馄摗⑽讣热?，水谷精微?rùn)養(yǎng)不周，至血?dú)馄?，而為風(fēng)邪所侵，故半身不遂也?！薄毒霸廊珪穂13]也提出“中風(fēng)麻木不仁等證，因其血?dú)獠恢?，所以痛癢，蓋氣虛則麻，血虛則木，麻木不已，偏枯痿廢，漸至日增。”說明氣血虧虛是造成半身不遂的內(nèi)在因素?！督饏T要略》中記載：“夫風(fēng)之為病，當(dāng)半身不遂，或但臂不遂者，此為痹。脈微而數(shù)，中風(fēng)使然?！币蚱渫ǔ０l(fā)病急，變化多，多以“風(fēng)性善行數(shù)變”比類[14]。王清任采各家之所長(zhǎng)，在《醫(yī)林改錯(cuò)》[15]中提出：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”，認(rèn)為氣虛導(dǎo)致血瘀，又云：“半身不遂，虧損元?dú)?，是其本源”，明確提出了“氣虛血瘀”為“中風(fēng)”之主要病機(jī)，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)制了益氣活血名方補(bǔ)陽還五湯[16]。因此，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為“中風(fēng)”發(fā)病多與內(nèi)傷積損、素體虧虛、氣血虧而邪中、飲食不節(jié)、作息不律等相關(guān)，再加虛、風(fēng)、火、痰、瘀、氣、血等相互影響。病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以氣虛為致病的根本原因，血瘀為疾病發(fā)生發(fā)展的核心，最終致使機(jī)體的氣血逆亂，臟腑和陰陽失衡[17-18]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)氣虛血瘀的病機(jī)多為認(rèn)同，缺血導(dǎo)致體內(nèi)陰陽失衡，氣血逆亂而生風(fēng)火痰瘀，最終使腦脈瘀阻[19]。益氣活血法的實(shí)施能夠通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等作用增強(qiáng)腦缺血再灌注后的腦部血流供應(yīng)，改善腦部微循環(huán)，促進(jìn)腦組織神經(jīng)血管單元再生，發(fā)揮腦保護(hù)作用[20]。臨床上，采用益氣活血法治療可有效提升腦卒中患者神經(jīng)功能和生活能力，療效顯著[21-22]。

表4 核心藥物活性成分信息

*來源于TCM@TAIWAN數(shù)據(jù)庫(kù)，其余化合物來源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)

*were derived from TCM@TAIWAN database, and the other compounds were derived from TCMSP database

圖6 “黃芪-川芎”成分與CIRI的交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖7 “黃芪-川芎-地龍”成分與CIRI的交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖8 “黃芪-川芎”-地龍-CIRI的靶點(diǎn)韋恩圖

圖9 “黃芪-川芎”主要活性成分及作用靶點(diǎn)

圖10 “黃芪-川芎-地龍”主要活性成分及作用靶點(diǎn)

圖11 “黃芪-川芎”-CIRI交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

本研究藥物頻次分析顯示，急性缺血性卒中溶栓治療后使用的益氣活血類方劑的常用藥物有黃芪、川芎、地龍、當(dāng)歸、赤芍、紅花、丹參、桃仁等。高頻藥物中四氣以溫、寒、平為主，五味以苦、甘、辛為主，歸經(jīng)以肝、脾、肺經(jīng)為主。中醫(yī)理論認(rèn)為苦入心，有泄熱、燥濕、堅(jiān)陰的作用，甘入脾，有補(bǔ)益、和中、調(diào)和藥性和緩急止痛的作用，辛入肺，有發(fā)散、行氣、行血的作用。脾主運(yùn)化、肝主疏泄、肺朝百脈、心主血脈。配合藥之性味功效，可補(bǔ)瀉兼施，推動(dòng)血脈，條暢氣機(jī)，共奏滋養(yǎng)補(bǔ)虛、活血化瘀之功。聚類分析得到的5個(gè)核心藥物組合，第1組為半夏、瓜蔞、茯苓、炙甘草、白術(shù)、甘草、天麻、石菖蒲、膽南星，主要為祛濕化痰息風(fēng)的藥物組合；第2組為雞血藤、僵蠶、葛根、生地黃，主要為補(bǔ)血滋陰的藥物組合；第3組為丹參，發(fā)揮活血祛瘀之功；第4組為赤芍、牛膝、紅花、桃仁、當(dāng)歸、黃芪、地龍、川芎、全蝎、蜈蚣、水蛭、桂枝，主要為益氣活血化瘀通絡(luò)的藥物組合，實(shí)為補(bǔ)陽還五湯加減；第5組為黨參、三七，具有益氣活血化瘀之效。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析顯示，高頻藥物組合前7位的是黃芪-川芎、黃芪-地龍、黃芪-當(dāng)歸、川芎-地龍、川芎-當(dāng)歸、黃芪-川芎-地龍、黃芪-川芎-當(dāng)歸。上述藥味中主要為補(bǔ)氣藥和活血藥，黃芪為益氣良藥，補(bǔ)氣養(yǎng)血兼行血，川芎活血行氣，當(dāng)歸、赤芍、紅花、丹參、桃仁活血化瘀，地龍息風(fēng)通絡(luò)，共奏益氣活血化瘀通絡(luò)之功?！包S芪-川芎”“黃芪-川芎-地龍”分別是關(guān)聯(lián)規(guī)則中頻次最高、支持度與置信度最高、關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的二聯(lián)和三聯(lián)藥物。

圖12 “黃芪-川芎”-地龍-CIRI交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖13 “黃芪-川芎”-CIRI交集靶點(diǎn)網(wǎng)狀圖

圖14 “黃芪-川芎”-地龍-CIRI交集靶點(diǎn)網(wǎng)狀圖

圖15 91個(gè)潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

圖16 34個(gè)潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

圖17 91個(gè)潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析氣泡圖

由網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可以看出，黃芪、川芎及地龍的生物活性成分能夠通過多種途徑作用于多靶點(diǎn)防治CIRI。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，AKT1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartic protease-3，Caspase-3）等是黃芪、川芎和地龍防治CIRI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。GO和KEGG富集分析顯示涉及多種共同的信號(hào)通路，BP主要涉及對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、分子功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、含磷化合物代謝過程、磷代謝過程、細(xì)胞通訊的調(diào)控、信號(hào)監(jiān)管、蛋白質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)、代謝過程的正向調(diào)節(jié)等；CC主要涉及細(xì)胞表面、突觸、質(zhì)膜的固有成分、神經(jīng)元的一部分、細(xì)胞外空間等；MF主要涉及酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、碳水化合物衍生物結(jié)合、陰離子結(jié)合、小分子結(jié)合、離子結(jié)合等；信號(hào)通路主要涉及癌癥相關(guān)通路、MAPK信號(hào)通路、微小RNAs（microRNAs）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路等，說明黃芪、川芎、地龍可能通過這幾條通路發(fā)揮抗CIRI的作用。

圖18 34個(gè)潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析氣泡圖

黃芪、川芎和地龍是補(bǔ)陽還五湯的經(jīng)典組方藥物，這些藥物對(duì)缺血性卒中以及CIRI的治療作用被大量研究證實(shí)。黃芪注射液能激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)CIRI大鼠的腦血管再生[23]。黃芪注射液聯(lián)合亞低溫能夠通過降低炎癥反應(yīng)及抗氧化作用改善急性腦梗死患者溶栓術(shù)后的CIRI[24]，黃芪注射液分別與奧扎格雷鈉[25]、刺五加注射液[26]、丹紅注射液[27]、血塞通注射液[28]聯(lián)用治療急性腦梗死取得較好的療效。黃芪甲苷是黃芪的質(zhì)量控制成分，能夠改善能量代謝、清除氧自由基、抑制炎癥反應(yīng)、緩解細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)血腦屏障等干預(yù)CIRI的發(fā)生發(fā)展過程，減輕CIRI[29]。川芎有效成分、藥對(duì)、復(fù)方以及中藥制劑對(duì)缺血性腦卒中具有良好的腦保護(hù)作用[30]。川芎嗪是川芎的特征性生物堿，川芎嗪注射液治療急性缺血性腦卒中療效確切[31]。丹參川芎嗪注射液聯(lián)合重組組織型纖溶酶原激活劑能增強(qiáng)急性缺血性卒中患者溶栓療效并能延長(zhǎng)溶栓治療時(shí)間，縮小腦梗死面積，減輕缺血、缺氧引起的再灌注損傷[32]。藁本內(nèi)酯具有強(qiáng)大的抗氧化和有效的神經(jīng)保護(hù)特性[33]，能明顯降低CIRI引起的炎癥反應(yīng)[34]。地龍及其主要活性物質(zhì)如地龍纖維蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓膠原酶、地龍素等其他蛋白質(zhì)和肽類成分具有抗凝、溶栓、抗炎、促進(jìn)神經(jīng)再生和改善神經(jīng)功能的作用，在治療腦缺血疾病方面應(yīng)用廣泛[35]?！包S芪-川芎”藥對(duì)能夠顯著降低腦缺血再灌注大鼠血清白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平，減輕多糖包被和血腦屏障損傷，改善神經(jīng)功能[36]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血藥對(duì)“黃芪-川芎”可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路等多個(gè)途徑改善缺血性腦卒中病理?yè)p傷[37]。黃芪甲苷配伍川芎嗪能夠修復(fù)神經(jīng)血管單元[38]，抑制鈣內(nèi)流，增加細(xì)胞活力[39]，起到抗炎、抗氧化、抗凋亡[40-42]作用，改善CIRI。自擬益氣活血方[43]、益氣通竅活血湯[44]、龍蛭湯[45]、腦心通膠囊、復(fù)方地龍片[46]等均含有黃芪、川芎和地龍，本研究團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人葛金文教授防治卒中的專利處方（發(fā)明專利號(hào)ZL201110178359. 4）腦泰方[47-48]是在此3味中藥的基礎(chǔ)上加僵蠶組成，此類益氣活血方藥對(duì)急性缺血性卒中具有良好的治療作用。

許多炎癥因子可通過酪氨酸蛋白激酶2（Janus kinase，JAK2）/STAT3信號(hào)通路來誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[49]。STAT3/PI3K/Akt信號(hào)通路能夠通過調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與分化[50]、凋亡[51]、缺血神經(jīng)元的恢復(fù)和存活[52]、神經(jīng)炎癥、血管生成等途徑發(fā)揮對(duì)缺血性卒中和CIRI的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，常春藤皂苷元能夠通過抑制混合譜系激酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）信號(hào)通路，激活MAPK和NF-κB信號(hào)通路，降低CIRI誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和炎癥因子的表達(dá)[53]。刺芒柄花素能夠抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用[54]，下調(diào)Bcl-2相關(guān)的X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）與B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）比值，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡作用[55]。黃芪異黃酮能夠激活雌激素受體-PI3K-Akt信號(hào)通路[56]，對(duì)CIRI發(fā)揮保護(hù)作用。異鼠李素能夠抑制CIRI小鼠髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平[57]，激活A(yù)kt/SIRT1/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/ 血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）信號(hào)通路緩解氧糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)元細(xì)胞HT22細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[58]。毛蕊異黃酮通過降低Caspase-3的表達(dá)[59]，上調(diào)磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）/ERK的表達(dá)，激活ERK1/2通路[60]，聯(lián)合芍藥苷激活PI3K/Akt信號(hào)通路[61]，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡。山柰酚通過調(diào)節(jié)p-Akt、Nrf2、p-NF-κB的表達(dá)，抑制CIRI過程中的神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥應(yīng)激[62]。阿魏酸能夠降低CIRI大鼠血清和腦組織中的炎性因子水平[63]，抑制鈣離子內(nèi)流、活性氧生成、Caspase-3和Bax水平，提高Bcl-2水平，通過抗氧化和細(xì)胞凋亡對(duì)體內(nèi)外缺血損傷發(fā)揮明顯的保護(hù)作用[64]。鳥苷能夠抑制IL-8的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用減輕大鼠CIRI[65]。益氣活血名方補(bǔ)陽還五湯能夠通過激活PI3K/Akt通路，抑制細(xì)胞自噬減輕大鼠CIRI[66]，激活PI3K/Akt信號(hào)通路提高HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)損傷的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞新生[67]。本課題組亦有研究證實(shí)具有益氣活血作用的腦泰方能夠通過激活STAT3/PI3K/Akt信號(hào)通路減輕神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮對(duì)CIRI的腦保護(hù)作用[68]。

CIRI引發(fā)的一系列繼發(fā)病理反應(yīng)進(jìn)一步加重神經(jīng)元損傷，阻礙缺血性腦卒中患者的康復(fù)，是臨床亟待解決而又尚未解決的難題?；凇皻馓撗觥辈C(jī)的益氣活血法在臨床應(yīng)用廣泛，益氣補(bǔ)充虧損之元?dú)?，使其運(yùn)血有力；活血疏通瘀血阻滯的脈道，保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)正常輸布于腦髓；益氣活血共奏修復(fù)既損腦神之功，通過多靶點(diǎn)、多途徑整體干預(yù)CIRI發(fā)生的病理進(jìn)程。目前，臨床上CIRI的治療很難達(dá)到預(yù)期的理想效果，益氣活血法防治CIRI的機(jī)制研究更多體現(xiàn)在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，在臨床上應(yīng)用益氣活血法治療缺血性卒中長(zhǎng)期處于輔助地位。盡管如此，益氣活血法及益氣活血類方藥在抑制CIRI過程中的病理反應(yīng)、減輕腦缺血再灌注帶來的神經(jīng)損傷、修復(fù)受損的神經(jīng)血管單元、恢復(fù)正常生理功能方面仍然具有極大的研究開發(fā)潛力，值得研究者進(jìn)行更多、更深入的科學(xué)探索與研究，為臨床采用益氣活血法治療缺血性卒中提供充實(shí)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Medication rules and mechanisms of invigoratingand activating blood prescriptions in prevention and treatment of cerebral ischemia reperfusion injury based on data mining

CHEN Xiang-yu1, 2, ZHANG Jing-han1, 2, LAI Jia-hao1, 2, ZHANG Wen-li3, MEI Zhi-gang1, 2, NIE Hui-fang1, 2

1. College of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To investigate the medication rules of invigoratingand activating blood prescriptions after thrombolytic therapy for acute ischemic stroke, and to predict the potential mechanism of core drugs in the prevention and treatment of cerebral ischemia reperfusion injury.The literature on effective interventions with invigoratingand activating blood prescriptions after thrombolytic therapy for acute ischemic stroke was retrieved from CNKI, Wanfang, VIP and PubMed. The drugs were subjected to frequency, clustering and association analyses. According to the association rules, the core drugs with the highest confidence and support were selected to construct the core drugs-active ingredients-intersection targets network diagram. The gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed on the intersection targets.A total of 232 articles were included, involving 177 traditional Chinese medicine (TCM) prescriptions, including 119 TCMs with a total of 1903 frequencies, including 28 high frequency drugs. All drugs could be classified into 16 kinds according to their efficacy, with a total of 191 frequencies of flavours and 292 frequencies of meridian. The clustering analysis of high frequency drugs yielded five clusters, and the association rule analysis yielded 20 groups of TCM combinations with high support, among which the binomial association drugs with the highest support and confidence was “Huangqi ()-Chuanxiong ()” and the three association drugs was “--Dilong ()”. The network pharmacological analysis collected 30 active ingredients from,and, and screened 91 intersectional targets of “-”-cerebral ischemia reperfusion injury and 34 intersectional targets of “-”--cerebral ischemia reperfusion injury. They were mainly involved in cancer-related pathways, mitogen activated protein kinases (MAPK), microRNAs, phosphatidylinositol-3-hydroxykinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) and tumor necrosis factor (TNF) signaling pathways.The core drugs of invigoratingand activating blood prescriptions in the treatment of acute ischemic stroke were,and. The enrichment analysis of KEGG pathway showed that the prevention and treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury by the core drugs involved multiple signaling pathways, which provided the basis for guiding the clinical treatment of ischemic stroke by invigoratingand activating blood circulation, and provided data reference for the research and development of related innovative drugs.

ischemic stroke; cerebral ischemia reperfusion injury; invigoratingand activating blood circulation; data mining; network pharmacology; compatibility rules;-;--

R285

A

0253 - 2670(2023)10 - 3221 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.020

2022-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82174167）；湖南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2021JJ30499）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（22B0354）；湖南省衛(wèi)健委一般項(xiàng)目（D202303077508）；湖南省國(guó)內(nèi)一流培育學(xué)科中西醫(yī)結(jié)合開放基金項(xiàng)目（2020ZXYJH63）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2021CX63）

陳祥宇（1997—），男，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治腦病作用機(jī)制研究。E-mail: cxy173557124@163.com

聶慧芳（1984—），女，博士，講師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治腦病作用機(jī)制研究。E-mail: 003783@hnucm.edu.cn

梅志剛（1977—），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治腦病作用機(jī)制研究。E-mail: meizhigang@hnucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 潘明佳]