3株馬尾松外生菌根真菌菌絲最適生長條件探究*

孫啟彪，毛 瑩，錢 璐，季曉紅，何貞英，歐陽建萍，陳 曄，何 剛**

（1.九江學(xué)院 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332000；2.九江市真菌資源保育及應(yīng)用重點實驗室，江西 九江 332000；3.九江學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，江西 九江 332005）

外生菌根（Ectomycorrhizal，ECM）真菌是土壤中非常重要的一類活體營養(yǎng)型真菌，能與松科（Pinaceae）、殼斗科（Fagaceae）、樺木科（Betulaceae）等高等植物細(xì)根形成外生菌根共生體，在促進(jìn)植物水分和礦質(zhì)養(yǎng)分吸收及提高環(huán)境適應(yīng)性中發(fā)揮了重要作用，廣泛應(yīng)用于植樹造林、土壤重金屬污染修復(fù)及生態(tài)恢復(fù)[1]。多數(shù)ECM 真菌能夠形成大型子實體，且許多種類具有極高的食（藥）用價值[2-3]。然而，ECM 真菌在與植物共生演化過程中，其腐生能力不斷退化，如植物細(xì)胞壁相關(guān)降解酶基因丟失[4]。在自然界中，ECM 真菌主要依賴共生植物將蔗糖、淀粉等水解成單糖后吸收利用，而不能直接利用植物的光合產(chǎn)物，原因是這類真菌缺少相關(guān)的基因，如雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）的基因組缺乏雙糖運輸?shù)鞍住⒄崽寝D(zhuǎn)化酶等基因[5-6]。盡管多數(shù)種類可以離體培養(yǎng)，但菌絲生長緩慢，對人工合成菌根以及仿野生人工栽培造成了困難，限制了ECM真菌的開發(fā)應(yīng)用[7-8]。不同類型ECM 真菌的最適生長條件具有明顯差異，如正紅菇（Russula griseocarnosa）和橙黃硬皮馬勃（Scleroderma citrinum）的最適碳源為甘露醇，最適氮源均為硝酸鹽[9]；點柄粘蓋牛肝菌（Suillus granulatus）的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為銨鹽[10]。因而，探究不同ECM 真菌的營養(yǎng)條件有利于發(fā)掘其生態(tài)功能和食（藥）用價值。純培養(yǎng)是研究ECM 真菌的前提與基礎(chǔ)，包括菌種的擴(kuò)繁、菌劑的制作、菌根合成。

研究通過對小笠原須腹菌（Rhizopogon boninensis）、硬皮地星（Astraeus hygrometricus）和彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）3 種具有食（藥）用價值的ECM 真菌進(jìn)行菌絲生長最適溫度、pH、碳氮比的試驗和不同碳源、氮源利用效率的試驗，探究其純培養(yǎng)的最適營養(yǎng)和生長條件，掌握其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

小笠原須腹菌（S021）、硬皮地星（S180）和彩色豆馬勃（S202）菌種由九江市真菌資源保育及應(yīng)用重點實驗室提供，3 株真菌均分離自與馬尾松共生的子實體，采集地分別為九江市白鹿鎮(zhèn)觀音橋、上饒市銅鈸山和九江市廬山西海。

1.2 供試培養(yǎng)基

MMN（Modified Melin-Norkrans,MMN）培養(yǎng)基：CaCl20.05 g·L-1、（NH4）2HPO40.25 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1、NaCl 0.025 g·L-1、1% FeCl31.2 mL·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、VB1100 μg·L-1、葡萄糖10 g·L-1、麥芽浸膏0.5 g·L-1，pH 為5.5。

改良MMN 培養(yǎng)基：CaCl20.05 g·L-1、（NH4）2HPO40.25 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1、NaCl 0.025 g·L-1、1% FeCl31.2 mL·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、VB1100 μg·L-1、葡萄糖10 g·L-1，pH 為5.5。

試驗儀器：HDL-CJ-2NDI 超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LDZX-50KBS 壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；MJ-160BSH-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PHS-3C雷磁pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 最適pH 試驗

用1 mol·L-1HCl 或1 mol·L-1NaOH 溶液將改良MMN 培養(yǎng)基的pH 分別調(diào)節(jié)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在121 ℃、0.05 MPa 條件下滅菌20 min 后倒入培養(yǎng)皿（直徑60 mm）。將在固體MMN 培養(yǎng)基上活化復(fù)壯后的ECM 真菌菌落，用無菌打孔器（內(nèi)徑為5 mm）在菌落邊緣打取長勢旺盛的菌塊，接種于不同pH 的改良MMN 固體培養(yǎng)基中央，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)14 d，每天觀察其長勢，并用“十”字交叉法測量菌落直徑，每組處理設(shè)5 個重復(fù)。

1.3.2 最適溫度試驗

將活化后的試驗菌株接種于改良MMN 培養(yǎng)基，分別置于10 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)14 d，每組處理設(shè)5 個重復(fù)。接種和測量方式同1.3.1。

1.3.3 碳源利用試驗

將改良MMN 培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖分別替換為等量的果糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、微晶纖維素，每組處理設(shè)5 個重復(fù)。接種、培養(yǎng)和測量方式同1.3.1。

1.3.4 氮源利用試驗

將改良MMN 培養(yǎng)基中的氮源（NH4）2HPO4分別替換為含等量氮素的尿素、硝酸鈉、胰蛋白胨、甘氨酸、色氨酸，每組處理設(shè)5 個重復(fù)。接種、培養(yǎng)和測量方式同1.3.1。

1.3.5 最適碳氮比試驗

以改良MMN 固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，固定碳源的質(zhì)量，通過添加不同質(zhì)量的氮源（NH4）2HPO4使培養(yǎng)基的碳氮比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、40∶1，每組處理設(shè)5 個重復(fù)。接種、培養(yǎng)和測量方式同1.3.1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理均在Excel 2016 中完成，菌落圖片處理和圖表繪制分別使用Photoshop 2020 和Origin 2022 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 對ECM 真菌生長的影響

pH 是影響ECM 真菌菌絲生長和新陳代謝的重要因素之一，通常情況下，偏酸性環(huán)境更有利于真菌的生長。pH 對ECM 真菌菌絲生長的影響情況見圖1。

圖1 不同pH 條件下ECM 真菌培養(yǎng)14 d 菌落特征與生長過程的直徑變化Fig.1 Colony characteristics cultured for 14 days and diameters during cultivation of ectomycorrhizal fungi under different pH conditions

從圖1 可知，pH 對小笠原須腹菌、硬皮地星和彩色豆馬勃的生長具有顯著影響。小笠原須腹菌在pH 為4～9時均能生長，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，其中酸性條件更有利于菌絲生長，最適pH 為5，此條件下培養(yǎng)14 d 后菌落直徑為（4.60±0.10）cm。硬皮地星在pH 為5～7 時菌絲長勢較好，但菌落特征具有明顯差異，pH 為5～6 時菌絲絨毛狀，pH 為7 時菌絲致密，pH≥7 時培養(yǎng)基中產(chǎn)生褐色或棕色色素。彩色豆馬勃在不同pH 條件下的生長特征和硬皮地星相似，最適pH 為6，培養(yǎng)14 d 后菌落直徑為（2.13±0.06）cm。

2.2 溫度對ECM 真菌生長的影響

溫度是影響真菌代謝和生長的重要因素，溫度對ECM 真菌菌絲生長的影響情況見圖2。

圖2 溫度對ECM 真菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of temperature on themycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由圖2 可知，3 株真菌可生長溫度范圍具有明顯差異。小笠原須腹菌和硬皮地星在低溫（10 ℃）或高溫（35 ℃）條件下均不能生長，小笠原須腹菌最適生長溫度為25～30 ℃，硬皮地星最適生長溫度為25 ℃。彩色豆馬勃的溫度適應(yīng)性與小笠原須腹菌和硬皮地星具有明顯差異，溫度越高長勢越好，最適溫度為30～35 ℃，說明該菌屬于高溫型菌。

2.3 碳源對ECM 真菌生長的影響

碳源對ECM 真菌菌絲生長的影響結(jié)果見圖3。

圖3 碳源對ECM 真菌菌絲生長的影響Fig.3 Effect of carbonsource on the mycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由圖3 可知，小笠原須腹菌、硬皮地星和彩色豆馬勃可利用的碳源及對同種碳源的利用效率具有明顯差異，但均不能利用半乳糖。小笠原須腹菌幾乎不能利用乳糖和微晶纖維素，對蔗糖、果糖、淀粉和甘露醇的利用效果好，對葡萄糖和麥芽糖的利用效果次之。硬皮地星對蔗糖的利用效果最佳，培養(yǎng)14 d 后菌落直徑為3.30 cm；其次是葡萄糖、可溶性淀粉和甘露醇；對微晶纖維素利用效果較差。彩色豆馬勃最適碳源為葡萄糖，對蔗糖和甘露醇利用效果次之，不能利用微晶纖維素。

2.4 氮源對ECM 真菌生長的影響

氮素是組成真菌蛋白質(zhì)、核酸、酶類等必需的成分，氮源的利用效率顯著影響真菌的生長。氮源對ECM 真菌菌絲生長的影響結(jié)果見圖4。

圖4 氮源對ECM 真菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on the mycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由圖4 可知，小笠原須腹菌對磷酸氫二銨利用效果最好，培養(yǎng)14 d 后菌落直徑為（4.30±0.06）cm；對硝酸鈉和尿素的利用效果次之；不能利用甘氨酸、色氨酸等游離氨基酸。硬皮地星對磷酸氫二銨和硝酸鈉均有較好的利用效果，尿素和蛋白胨次之，不能利用甘氨酸和色氨酸。彩色豆馬勃對磷酸氫二銨、硝酸鈉和蛋白胨有較好的利用效果，對尿素的利用效果次之，幾乎不能利用甘氨酸，不能利用色氨酸。

2.5 碳氮比對ECM 真菌生長的影響

碳氮比對ECM 真菌菌絲生長的影響結(jié)果見圖5。

圖5 碳氮比對ECM 真菌菌絲生長的影響Fig.5 Effect of C/N ration on the mycelial growth of ectomycorrhizal fungi

由圖5 可知，碳氮比對ECM 真菌的生長具有顯著影響，小笠原須腹菌隨著碳氮比的升高越長越好。硬皮地星和彩色豆馬勃適合低碳氮比培養(yǎng)條件，但最適碳氮比有明顯差異。

3 結(jié)論與討論

通過試驗初步確定了小笠原須腹菌、硬皮地星和彩色豆馬勃的營養(yǎng)特點和培養(yǎng)條件，結(jié)果表明不同菌株最適生長條件具有顯著差異。溫度是影響ECM 真菌生長的重要因素，多數(shù)ECM 真菌最適生長溫度為25～30 ℃[9，11，13]。小笠原須腹菌和硬皮地星具有相似特點，最適生長溫度為25 ℃，但彩色豆馬勃喜高溫，35 ℃時長勢最佳。純培養(yǎng)獲得ECM 真菌的最適生長溫度不一定反應(yīng)自然土壤環(huán)境中的最適條件，菌絲生長與形成子實體所需的溫度具有差異，但本研究為離體菌株的擴(kuò)繁溫度提供了參考。一般而言，弱酸性環(huán)境有利于多數(shù)ECM 真菌生長，最適pH 為5.0～6.0[9，11-12]。3 株ECM 真菌在中性條件下生長情況也較好，其中小笠原須腹菌具有較強(qiáng)的堿性耐受能力。

碳素是ECM 真菌細(xì)胞的主要組分和代謝所需能源來源，由于不同ECM 真菌在進(jìn)化過程中對復(fù)雜有機(jī)質(zhì)的降解能力逐漸丟失，但仍保留部分腐生能力，因此對不同碳源的利用能力具有顯著差異[4]。研究中小笠原須腹菌的最適碳源為蔗糖、果糖、淀粉和甘露醇，硬皮地星最適碳源為蔗糖，彩色豆馬勃最適碳源為葡萄糖，三者對復(fù)雜多糖幾乎沒有利用能力。牛玉蓉等[10]、宋微等[11]和柴迪迪等[13]的研究也表明ECM 真菌對碳源的利用能力具有明顯差異。劉冬明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，正紅菇和橙黃硬皮馬勃的最適碳源為甘露醇，本研究中3 株真菌也對甘露醇表現(xiàn)出較好的利用能力。

氮源也是真菌生長的重要限制性因素，ECM 真菌主要以銨鹽作為無機(jī)氮源，有些種類對硝酸鹽也有較好利用能力[14-15]。研究中3 株ECM 真菌偏好銨態(tài)氮，其中彩色豆馬勃對蛋白胨、尿素等有機(jī)氮也有較好利用效果。碳氮比是影響真菌生長的因素之一，氮源比例過高易引起環(huán)境pH 偏高，碳源比例過高則容易形成較低的pH 環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)碳氮比與ECM 真菌的最適生長pH 具有明顯相關(guān)性。小笠原須腹菌偏好酸性，其在高碳氮比條件下長勢明顯優(yōu)于低碳氮比條件；而硬皮地星和彩色豆馬勃最適pH為弱酸性或中性，則在低碳氮比條件下生長較好。ECM 真菌的純培養(yǎng)條件研究對菌種擴(kuò)繁、菌劑生產(chǎn)應(yīng)用及其與植物共生機(jī)制的研究具有重要價值。研究初步揭示了小笠原須腹菌、硬皮地星和彩色豆馬勃的最適生長條件，但其中的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探究。