H3 G34突變型彌漫性半球膠質(zhì)瘤的臨床和病理學特征分析

古家美，蒙志平，王蘇杰，劉秀峰，王芳，查顯豐，吳小延

1.暨南大學附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗中心，廣東 廣州 510060；2.中山大學腫瘤防治中心分子診斷科，廣東 廣州 510060；3.貴港市人民醫(yī)院檢驗科，廣西 貴港 537000；4.中山大學腫瘤防治中心生物治療，廣東 廣州 510060

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2022年11月期間經(jīng)中山大學腫瘤防治中心診斷為DHG-G34 的患者共計13例(依據(jù)2021年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準[14])，13 例標本經(jīng)HE 染色及分子病理檢測由經(jīng)驗豐富的神經(jīng)病理學家診斷為伴有H3 G34R/V 突變的DHG。

1.2 組織病理學

1.2.1 切片與烤片 使用徠卡公司的切片機(型號：RM2235LEICA RM2235)將石蠟組織塊冷凍后切割成3 μm厚組織切片，在70℃下干燥30 min。

1.2.2 脫蠟與水化 使用羅氏公司ΒenchMark XT全自動免疫組織化學儀器染色機進行脫蠟。組織切片置于二甲苯中20 min，脫蠟兩次，然后放入無水酒精5 min兩次，再分別放入95%酒精、80%酒精各5 min逐步入水，蒸餾水沖洗5 min。

1.2.3 抗原修復(fù) 將切片置于盛有抗原修復(fù)液(抗原修復(fù)液用蒸餾水按照1∶50稀釋，配制一定量工作液于不銹鋼鍋中)，置于電磁爐上功率調(diào)至最低(保溫)，將置于耐高溫染色架上的切片甩去水分，放入上述抗原修復(fù)液中修復(fù)20 min；關(guān)閉電磁爐，不銹鋼鍋移開電磁爐自然冷卻1 h 至室溫。切片磷酸緩沖鹽溶液(PΒS)沖洗3次，每次5 min。

1.2.4 加即用型一抗 采用Envision二步法進行免疫組織化學染色，每次操作均包括陽性和陰性對照。除去PΒS 液，加即用型一抗，室溫下孵育60 min，用PΒS 沖洗3 次×3 min。檢測一抗包括：H3K27M 購自基因科技(上海)有限公司、p53 及突觸素(Syn)購自蘇州百道醫(yī)療科技有限公司、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司、Olig-2 及ATRX 購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司、Ki-67購自丹麥Dako公司。

1.2.5 加即用型酶標二抗 除去PΒS 液，加即用型酶標二抗，室溫下孵育15 min，PΒS 沖洗3 次×3 min。

1.2.6 DAΒ 顯色 除去PΒS 液，加配制好的DAΒ[按照1(色原)：20(底物)配制]，顯色5 min，必要時可在顯微鏡下觀察掌握染色時間，陽性染色為棕黃(褐)色，PΒS沖洗2次×3 min。二抗及顯色系統(tǒng)購自徠卡公司自動免疫組化機配套試劑盒。

將膈上肋骨（第1～10肋）從腋前線和腋后線由后向前分為背段、腋段和前段，肋軟骨為一段，膈下肋骨不作分段。

1.2.7 復(fù)染、脫水、透明、封片 除去水分，使用Gill 蘇木素染色15～30 s，流水沖洗干凈；PΒS 沖洗返藍，流水沖洗干凈；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠和蓋玻片封片。

1.3 H3F3A G34 突變分析 利用核酸提取試劑盒(基因科技股份有限公司)從福爾馬林固定的石蠟樣品中提取DNA。使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供的3500xl DNA 遺傳分析儀對IDH1 基因的132 密碼子、IDH2 基因的172 密碼子、H3F3A 基因的34 密碼子以及TERT 基因啟動子的C228 和C250 熱點突變，進行PCR 擴增后Sanger 測序。應(yīng)用美國AΒI 公司7500 實時熒光定量PCR 儀對ΒRAF 基因的600 密碼子及MGMT啟動子甲基化檢測，操作步驟嚴格按照北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司試劑盒說明書進行。

1.4 治療和隨訪方法 13例患者中12 例行腫瘤切除術(shù)治療，另1 例行神經(jīng)導(dǎo)航輔助右額葉病變切除活檢術(shù)。通過醫(yī)院隨訪系統(tǒng)或打電話對患者進行隨訪，詢問患者的治療情況、無進展生存期(PFS)及總生存時間(OS)。無進展生存時間是指患者從治療開始至疾病進展或者死亡之間的這段時間。總生存時間是指從治療開始至患者因疾病死亡或末次隨訪時間。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示。采用Kaplan-Meier 法評估患者的總OS。

2 結(jié)果

2.1 患者的腫瘤特征 根據(jù)WHO 2021 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準，13 例病例均呈4 級膠質(zhì)母細胞瘤形態(tài)，其中1 例的部分區(qū)域含原始神經(jīng)外胚層腫瘤形態(tài)。13 例患者中男性6 例，女性7 例；平均診斷年齡為19.7 歲(13～25 歲)，大多數(shù)患者的年齡≤20 歲，見表1和表2。

表1 13例H3 G34突變型彌漫半球膠質(zhì)瘤患者的臨床特征及影像學特點Table 1 Clinical and imaging features of 13 patients with H3 G34-mutant diffuse hemispheric glioma

表2 13例H3 G34突變型彌漫半球膠質(zhì)瘤患者的病理特征及預(yù)后Table 2 Pathological features and prognosis of 13 patients with H3 G34-mutant diffuse hemispheric glioma

2.2 組織形態(tài)學 13例患者均為膠質(zhì)母細胞瘤，鏡下見異型細胞呈彌漫片狀生長，細胞核異型性顯著，可見多量瘤巨細胞(圖1Β、1E)，核分裂象易見，間質(zhì)小血管增生明顯(圖1A、1D)，可見灶性柵欄狀壞死及鈣化(圖1C、1F)；其中1例部分為原始神經(jīng)外胚層腫瘤，鏡下見異型細胞呈巢片狀分布，細胞胞漿少至中等，核分裂象易見，可見壞死，間質(zhì)伴血管內(nèi)皮增生。

圖1 伴有H3 G34突變的彌漫半球膠質(zhì)瘤組織形態(tài)學特征Figure 1 Histomorphological characteristics of diffuse hemispheric glioma with H3 G34 mutation

2.3 免疫組化檢測結(jié)果 免疫組化示：ATRX 在6/13 例(46.2%)中表達缺失(圖2A)；GFAP 全部為陽性表達(圖2Β)；Syn 有不同程度陽性；Ki-67 陽性指數(shù)為20%～80% (圖2C)；Olig2 免疫染色在10/13 例(76.9%)中完全表達陰性(圖2D)，在3/13 例(23.1%)中少量陽性；TP53 在9/11 例(81.8%)中染色陽性(圖2E)，所有病例均不表達H3K27M(圖2F)。

圖2 伴有H3 G34突變的彌漫半球膠質(zhì)瘤免疫組織化學染色結(jié)果Figure 2 Immunohistochemical staining results of diffuse hemisphere glioma with H3 G34 mutation

2.4 基因檢測結(jié)果 分子檢測結(jié)果顯示：全部13例H3G34 突變型DHG 患者檢測到H3F3A 基因34 處密碼子突變(圖3)。其中，10例患者(76.9%)具有G34R突變(p.Gly34Arg，c.103G＞A)，其余3例患者(23.1%)具有G34V 突變(p.Gly34Val，c.104G＞T)。13 例患者中IDH1/2 及TERT 啟動子C228T/C250T 基因全部為陰性，MGMT啟動子均發(fā)生甲基化。

圖3 Sanger測序結(jié)果Figure 3 Sanger sequencing results

2.5 影像學特征 13 例患者均以頭痛頭暈或肢體乏力起病。頭顱磁共振成像(MRI)檢查結(jié)果提示，病變位于額葉的患者5例，頂葉1例，額葉及頂葉1例，顳葉2 例，頂葉及胼胝體1 例，額葉及胼胝體1 例，額葉、頂葉及島葉1例，顳葉及頂葉1例(圖4)。

圖4 伴有H3 G34突變的彌漫半球膠質(zhì)瘤影像學特征Figure 4 Imaging characteristics of diffuse hemisphere glioma with H3 G34 mutation

2.6 生存情況 所有患者均于術(shù)后隨訪，隨訪截止時間2022 年11 月15 日，4 例患者存活，最長隨訪時間為術(shù)后52個月，術(shù)后存活最短時間1.6個月，最長存活52 個月，中位總生存時間為22.1 個月，平均26.1 個月。13 例H3G34突變型DHG患者的1、2、3年生存率分別為84.6%、46.2%、38.5%(圖5)。

圖5 13例彌漫半球膠質(zhì)瘤患者的1、2、3年生存率分別為84.6%、46.2%、38.5%Figure 5 The 1,2,and 3-year survival rates of 13 patients with diffuse hemispheric glioma were 84.6%,46.2%,and 38.5%,respectively

3 討論

DHG-G34 是一種罕見的腦腫瘤，通常發(fā)生于兒童和青少年[11，17-18]。以往研究表明，發(fā)生G34R/V 突變的膠質(zhì)瘤患者平均年齡略高于發(fā)生K27M 突變的膠質(zhì)瘤患者，G34R/V 突變的膠質(zhì)瘤患者的年齡為9～42歲，中位年齡為18歲，K27M突變的膠質(zhì)瘤患者年齡為5～23 歲，中位年齡為10.5 歲[19]。本研究中，13 例DHG-G34 患者的年齡為13～25 歲，中位年齡為20 歲，與以上研究結(jié)果一致。

Korschunov 等[13]對81例H3 G34 突變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者進行研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者最常受累部位為顳葉和頂葉，高達80%。Yoshimoto等[19]也報道G34突變患者發(fā)病部位主要為頂葉，可累及基底節(jié)。本研究中，所有患者的腫瘤部位都位于大腦半球，其中4例伴有2個或多個腦葉的侵犯，而且病灶多位于額葉或顳島葉皮質(zhì)下，影像學顯示，T1WI呈等、低信號，T2WI呈等、稍高信號，DWI呈稍高信號，增強掃描明顯強化。

本研究表明DHG-G34 患者都顯示出統(tǒng)一的分子病理學特征，包括IDH 野生型、Olig2—/ATRX—、p53陽性、GFAP 強陽性，頻發(fā)O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)啟動子甲基化，并且缺乏TERT 啟動子突變。這些發(fā)現(xiàn)與之前報道的結(jié)果一致[9，19-24]。另外，轉(zhuǎn)錄因子Olig2 低表達與Olig2位點的高甲基化有關(guān)，并且在74%～100%的H3 G34突變型膠質(zhì)瘤中均有報道[11，25]。MGMT是一種DNA修復(fù)酶，與腦膠質(zhì)瘤的耐藥性有一定的關(guān)系，可以修復(fù)O6-MG(O6-Methyguanine)，是一種由烷化劑和鳥嘌呤形成的加合物，可能影響患者預(yù)后。本研究13例DHG-G34患者中頻繁發(fā)生MGMT 啟動子甲基化，說明DHG-G34 患者的腫瘤細胞對替莫唑胺等烷化劑類藥物化療效果敏感。p53作為抑癌基因會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，本研究81.8%的病例有p53 突變，突變率與之前報道的88%相似[13，26]。本研究13例DHG-G34患者的基因檢測結(jié)果顯示，IDH及TERT啟動子基因均未檢測到突變，H3F3A 基因中，10 例患者為G34R突變，3例患者為G34V突變。這與以往研究報道的G34R/V 突變中主要突變位點為G34R，而G34V 突變極為罕見(比率8∶1[27])的結(jié)論一致。值得一提的是，這些突變類型似乎是有組織特異性的，比如G34W 或G34L 突變在骨巨細胞瘤中極為常見，但罕見有G34R/V突變[28]。

在組織學方面，與具有H3 K27M變異的彌漫中線膠質(zhì)瘤的形態(tài)學相對均一性相反，DHG-G34表現(xiàn)出明顯異質(zhì)性，可呈現(xiàn)PNET樣或經(jīng)典的GΒM樣形態(tài)[13]，這兩種腫瘤被認為在臨床和生物學上是不同的，并且也接受了不同的治療策略[29-30]。本研究13例DHG-G34患者中，所有患者的組織呈膠質(zhì)母細胞瘤形態(tài)，其中1例患者的組織含PNET 樣形態(tài)。雖然DHG-G34 可以呈現(xiàn)不同的組織病理學外觀，但均一的分子病理學特征表明其是單一的生物起源。

文獻報道，G34R/V突變患者的預(yù)后優(yōu)于K27M突變患者[5，17，31]，中位生存期為12～36 個月[11，13，18，32]，2年生存率為27.3%[33-34]。本研究13 例DHG-G34 患者的中位生存期為22.1 個月，2 年生存率為46.2%，略高于以上研究。綜合以往研究顯示，DHG-G34 患者的臨床、影像、組織及分子病理學特征與H3K27M突變型彌漫中線膠質(zhì)瘤、IDH 突變型和IDH 野生型膠質(zhì)母細胞瘤有很大不同，因此，這些發(fā)現(xiàn)都支持DHG-G34 被歸類為新的WHO 4級腫瘤類型[35]。

盡管DHG-G34 的發(fā)病機制仍然不清楚，但H3G34突變已被證明會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子MYCN的上調(diào)，并通過SETD2 削弱H3 K36 甲基化，從而促進異常的PRC2 活性并推動腫瘤發(fā)生[36-38]，使DHG-G34 具有靶向治療的機會。此外，有研究表明，PDGFRA 信號傳導(dǎo)在H3G34 突變阻止細胞向神經(jīng)元分化中起主要作用，PDGFRA 激活突變(主要在細胞外結(jié)構(gòu)域)可以促進DHG-G34向星形膠質(zhì)細胞樣分化并且是有效的致癌驅(qū)動因子[31]。綜上所述，靶向MYCN、DNA低甲基化[10]、ALT[5，24]和PDGFRA 信號[31]可能是未來DHG-G34的新治療策略。

總之，本文評估的DHG-G34 顯示出一致的分子遺傳特征，具有ATRX 陰性、p53 陽性、Olig2 陰性、MGMT甲基化及TERT野生型的高級別膠質(zhì)瘤的單一生物起源和獨特亞型。本研究樣本量有限，需要獨立的和更大的數(shù)據(jù)進行驗證，及進一步的研究來確認DHG-G34的臨床特征和靶向治療。