崔瑋琪 馮曉 宋瑞強(qiáng) 楊勛 楊雙 蘇兆軍

摘 要：為全面、系統(tǒng)地了解濱州市地區(qū)凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）苗種攜帶蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）及爆發(fā)情況，對濱州地區(qū)37家凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘隨機(jī)采集對蝦苗種樣本，根據(jù)SC/T 7232-2020 《蝦肝腸胞蟲病診斷規(guī)程》采用套式PCR法進(jìn)行對蝦苗種蝦肝腸胞蟲的檢測，檢測結(jié)果表明濱州地區(qū)蝦肝腸胞蟲陽性檢測率為4.84%，同時監(jiān)測蝦肝腸胞蟲病發(fā)病池和未發(fā)病池的水質(zhì)，發(fā)現(xiàn)發(fā)病池的水體中pH值、COD等指標(biāo)并沒有顯著差異，說明蝦肝腸胞蟲病爆發(fā)并不是由于養(yǎng)殖池水質(zhì)導(dǎo)致的。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）；蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）；PCR；檢出率

近年來由于對蝦疫病的頻繁爆發(fā)，使得對蝦養(yǎng)殖業(yè)受到了較大的沖擊。其中有一種常見的疾病在泰國、印度、越南和中國等國家中流行，可造成對蝦苗種生長極其緩慢或停止［1］，其病原微生物為蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。

EHP的流行率較高，已經(jīng)成為威脅我國養(yǎng)殖業(yè)的一個嚴(yán)重病原。我國于2013年在浙江臺州養(yǎng)殖的凡納濱對蝦的肝胰腺中首次檢出EHP，此后在我國沿海地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大量EHP感染病例。2015年遼寧營口的對蝦EHP檢出率為34.6%［2］；粵西地區(qū)養(yǎng)殖對蝦EHP檢出率為41.38%［3］；浙江舟山養(yǎng)殖對蝦EHP檢出率為85.19%［4］，檢出率逐年上升。本文就濱州地區(qū)EHP的發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查分析，以期為建立有效防控技術(shù)方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

調(diào)查區(qū)域包括濱州市沾化區(qū)、無棣縣、博興縣凡納濱對蝦工廠化養(yǎng)殖池，隨機(jī)抽取37家苗種養(yǎng)殖場進(jìn)行抽檢（選取苗種日期相近的養(yǎng)殖場）。此次調(diào)查從3月開始到7月結(jié)束，每七天為一個周期進(jìn)行取樣檢測，共計得到樣品195份。

1.2 樣品EHP檢測

1.2.1 樣品前處理 取凡納濱對蝦蝦苗全蝦在已滅菌的研缽中研磨，將研磨后的組織放在無菌的離心管中，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 總DNA的提取 取研磨好的樣品約20 mg左右，采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 DNA提取試劑盒進(jìn)行對蝦樣品總DNA的提取，提取后采用-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 檢測 根據(jù)SC/T 7232-2020《蝦肝腸胞蟲病診斷規(guī)程》采用套式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，套式PCR擴(kuò)增體系所需引物序列見表1，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，30個循環(huán)，最后4 ℃保溫。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測后， 送至生工生物工程（濟(jì)南） 股份有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步的基因序列對比，進(jìn)一步驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

將兩輪陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中EHP的致病基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增出的陽性片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的EHP致病基因的序列相似度為98%。部分對蝦樣品的電泳圖見圖1和圖2。

3 討論

3.1 濱州地區(qū)EHP感染情況

本研究對2022年3—7月期間濱州地區(qū)的凡納濱對蝦苗種養(yǎng)蝦池EHP的感染情況進(jìn)行了調(diào)查與分析，結(jié)果表明，EHP的發(fā)病率在4.84%，主要集中在4—5月。通過對發(fā)病池和未發(fā)病池的水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，其pH值、COD等指標(biāo)并沒有顯著差異。

3.2 病因分析

蝦肝腸胞蟲?。‥nterocytozoon hepatopenaei disease）也稱作肝胰腺微孢子蟲?。℉epatopancreatic microsporidiosis， HPM），最早是在馬來西亞養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦的肝胰腺中發(fā)現(xiàn)的［5-6］，2004年研究人員發(fā)現(xiàn)泰國養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦體中也存在微孢子感染，Tourtip等 （2009）將這類感染對蝦肝胰腺的微孢子蟲正式命名蝦肝腸胞蟲，此后在越南、印度、中國、委內(nèi)瑞拉等國家?guī)缀跬瑫r檢測出EHP，目前EHP已經(jīng)成為危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。

蝦肝腸胞蟲在分類上屬微孢子綱（Microsporea），腸胞蟲科 （Enterocytozoonidae） ，腸胞蟲屬（Enterocytozoon）［7］，是一種可感染多種真核生物的專型細(xì)胞內(nèi)寄生真菌。成熟的蝦肝腸胞蟲的孢子呈橢圓形，具有極絲、1個細(xì)胞核和1 個后位空泡，由幾丁質(zhì)構(gòu)成的孢包裹，大小為（1.1±0.2）μm×（0.7±0.1）μm［8］?；疾ξr肝胰腺和腸道顏色較深，嚴(yán)重者肝胰腺萎縮，生長緩慢，個體明顯偏小，感染群體生長差異明顯增大。正常養(yǎng)殖條件下，攝食正常，腸胃充滿食物，不出現(xiàn)大量、急性死亡。體長相同時，發(fā)病群里的平均體重約為EHP陰性的70%。

濱州地區(qū)EHP發(fā)病率為4.84%，相對較低，造成原因有兩個方面，一是EHP的傳播有兩種形式：一種是垂直傳播，即通過親蝦傳播給子代；另一種是水平傳播，即攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環(huán)境中的孢子體而感染［9-10］。通過對發(fā)病池和未發(fā)病池水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著，可能是由于采集的樣品為蝦苗，尚未攝食鮮活餌料，因此未發(fā)生水平傳播，沒有造成大范圍的傳染。二是由于2020年起，為從源頭嚴(yán)格控制重大水生疫病的傳播，山東省開始實行水產(chǎn)苗種產(chǎn)地檢疫工作，加大對出廠苗種的管控力度，提高了水產(chǎn)苗種質(zhì)量，降低了疫病發(fā)生率。

3.3 防控措施

苗種作為最重要的投入品，處于養(yǎng)殖生產(chǎn)中的首要環(huán)節(jié)，實施苗種檢疫可以從源頭切斷疫病的傳播途徑，因此養(yǎng)殖企業(yè)購買苗種時應(yīng)購買具有資質(zhì)的檢測機(jī)構(gòu)檢測合格的苗種。

水質(zhì)是對蝦養(yǎng)殖過程中第二個重要環(huán)節(jié)。水質(zhì)管理的好壞，直接決定著對蝦養(yǎng)殖的成敗，因此養(yǎng)殖池中的水要進(jìn)行徹底消毒后方可使用，且要時時監(jiān)測養(yǎng)殖水的指標(biāo)。

出現(xiàn)對蝦生長緩慢現(xiàn)象的養(yǎng)殖池要進(jìn)行徹底的清塘和消毒，防止病毒繼續(xù)傳播。

參考文獻(xiàn)：

[1]

BIJU N，SATHIYARAJ G，RAJ M，et al.High prevalence of Enterocytozoon hepatopenaei in shrimps Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei sampled from slow growth ponds in India[J].Diseases of aquatic organisms，2016，120（3）：22-30.

[2] 王博雅，王力，劉美如，等.凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區(qū)的流行情況分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2017，32（2）：150-154.

[3] 陳祿芝.粵西地區(qū)凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調(diào)查[J].漁業(yè)研究.2016.38（4）：273-280.

[4] 施慧，許文軍，謝建軍，等.舟山地區(qū)大棚凡納濱對蝦生長緩慢病因的調(diào)查分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2017，24（2）：387-394.

[5] ANDERSON I G，SHARIFF M，NASH G.A hepatopancreatic microsporidian in pond-reared tiger shrimp，Penaeus monodon from Malaysia[J].Journal of Invertebrate Pathology，1989， 53（2）：278-280.

[6] ARANGUREN L F， HAN J E， TANG K F J.Enterocytozoon hepatopenaei （EHP） is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease （AHPND） and septic hepatopancreatic necrosis （SHPN） in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J].Aquaculture，2017，471：37-42.

[7] 胡吉卉，李正民，段健誠，等.蝦類肝腸胞蟲流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2020，41（11）：1-4，10.

[8] 王維娜，王安利，陳麗，等.斑節(jié)對蝦體內(nèi)微孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)[J].動物學(xué)報，2001（47）：78-81.

[9] 許杰，鄧威，李軍，薛淑霞，等.蝦肝腸胞蟲（EHP）流行病學(xué)與檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國動物檢疫，2018，35（2）：64-68.

[10] 駱云慧，石堅，方磊，等.蝦肝腸胞蟲TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（7）：847-852.

（收稿日期：2023-02-15；修回日期：2023-02-24）