生防菌株銅綠假單胞菌和糞產(chǎn)堿菌對奇異根串珠霉菌的防效測定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

劉雙龍　余鳳玉　宋薇薇　楊德潔　牛曉慶

關(guān)鍵詞：椰子病害；奇異根串珠霉菌；拮抗細(xì)菌；生物防治

中圖分類號：S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

椰子（Cocos nucifera）屬于棕櫚科椰子屬，為典型的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，是海南的“三棵樹”之一[1]。2018 年海南省的椰子種植面積高達(dá)3.36 萬hm²，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值達(dá)3.86 億元，帶動多地農(nóng)戶脫貧致富[2]。近幾年隨著椰子種植面積的增加，由奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）引起的椰子瀉血病逐年加重，該病害主要危害椰子樹干，病部流出紅色液體，后期則變成鐵銹色，現(xiàn)已成為椰子主要病害之一[3]，目前海南省各市（縣）椰子瀉血病均有發(fā)生，部分市縣發(fā)病率達(dá)40%，死亡率達(dá)5%，給椰子種植戶帶來極大的損失[4]。此外，溫碧柔等[5]從腐爛椰果中分離并驗證奇異根串珠霉菌也是導(dǎo)致椰子果腐的“真兇”。目前關(guān)于椰子瀉血病和椰子奇異根串珠霉果腐病的防治多集中于化學(xué)防治[4]，極易使致病菌產(chǎn)生抗性，并且隨著化學(xué)藥劑使用量的不斷加大，導(dǎo)致其大面積殘留，給環(huán)境造成嚴(yán)重的威脅[6]，因此尋找防治椰子瀉血病的生物防治方法具有重要意義。目前已報道的奇異根串珠霉菌生防菌包括淺灰鏈霉菌（Streptomycesgriseolus）、鼠灰鏈霉菌（S. murinus）等[3]，為豐富奇異根串珠霉菌生防菌的資源，本研究采用平板對峙法測定2 株生防菌對奇異根串珠霉菌的抑制效果，對其抑菌作用進(jìn)行初步研究，并對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為椰子瀉血病的生物防治提供安全、有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試生防菌：糞產(chǎn)堿菌brj-21（Alcaligenes faecalis）、銅綠假單胞菌wrj-2-5（Pseudomonas aeruginosa）由本實驗室分離保存；供試病原菌：奇異根串珠霉菌（T. paradoxa）、椰子灰斑病菌（Pestalotiopsis palmarum）、椰子可可毛色二孢果腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）和椰子心腐病菌（Pestalotiopsis sp.）由本實驗室分離保存。實驗所用椰果為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所‘文椰3 號品種。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、NYBD 液體培養(yǎng)基等，以上培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的抑制作用測定 采用平板對峙法[9-10]測定2 株生防菌對奇異根串珠霉菌、椰子灰斑病菌、椰子可可毛色二孢果腐病菌和椰子心腐病菌的抑制效果。其中，對奇異根串珠霉菌的抑制效果通過生防菌菌塊與菌液進(jìn)行測定，對其他病原菌的抑制效果通過生防菌菌塊測定。

抑菌率=（對照組菌落直徑－測試組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%

1.2.2 室內(nèi)防治效果實驗 采用椰果刺傷接種[11]進(jìn)行室內(nèi)防效驗證。選取健康且大小一致的椰果作為接種對象，先將椰果用清水沖洗干凈，晾干后用75%酒精消毒30 s，再用無菌水將椰果清洗3 次，晾干后使用一次性注射器針頭將果柄處椰果扎破，每個重復(fù)扎20～30 次，用滅菌吸水紙、紗布蓋于傷口處。預(yù)防試驗（處理1～3）：用無菌槍頭吸取NYBD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生防菌菌液（2×10⁷CFU/mL）100 μL 接種于果柄針刺處，然后分別在接種1、3、5 d 后將奇異根串珠霉菌菌絲塊（5 mm²）接于椰果傷口處；治療試驗（處理4～6）：先將奇異根串珠霉菌菌絲塊（5 mm²）接于椰果傷口處，然后分別在接種2、4、6 d 后在果柄處接種NYBD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生防菌菌液（2×10⁷CFU/mL），共進(jìn)行6 組處理。以對應(yīng)處理的生防菌液換成NYBD 液體培養(yǎng)基作為對照，每處理3 次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，光照周期為12 h 光照、12 h 黑暗，每天連續(xù)觀察并記錄椰果發(fā)病情況。病斑面積S=1/4π×長×寬，測量長、寬的方法：每個病斑量其最長和最寬處（二者成直角）[12]。

1.2.3 生防菌發(fā)酵條件優(yōu)化 （1）種子液的制備。挑取生防菌株單菌落于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

（2）發(fā)酵時間對生防菌株的影響。使用LB培養(yǎng)基，分別在12、24、36、48、60、72 h 測量細(xì)菌濃度，在0～12 h 內(nèi)每間隔2 h 測量1 次，12～24 h 每間隔4 h 測量1 次。24 h 后每12 h 測1 次，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制細(xì)菌的生長曲線。

（3）轉(zhuǎn)速對生防菌株的影響。采用上述優(yōu)化的發(fā)酵條件，分別調(diào)整轉(zhuǎn)速為120、150、180、210、240 r/min，培養(yǎng)24 h 后測量菌液濃度，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速。

（4）溫度對生防菌株的影響。采用上述優(yōu)化的發(fā)酵條件，分別設(shè)置溫度為24、28、32、36 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定不同溫度的菌液濃度。

（5）初始pH 對生防菌株的影響。采用上述優(yōu)化的發(fā)酵條件，分別配置pH 為4.0、6.0、7.0、8.0、10.0 的培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 后，測定不同pH 環(huán)境中細(xì)菌生長情況，以確定最佳初始pH。

（6）始初接菌量對生防菌株的影響。采用上述優(yōu)化的發(fā)酵條件，分別接種含量為2%、4%、6%、8%、10%的種子液。28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 后，測量各培養(yǎng)基中不同初始接菌量的細(xì)菌濃度，以確定最佳的初始接菌量[7-8]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics Version 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，并且使用Duncans 法進(jìn)行顯著性檢驗（P<0.05），使用GraphPad prim 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌對奇異根串珠霉菌的抑制作用

通過平板對峙實驗， 發(fā)現(xiàn)菌株brj-21 和wrj-2-5 菌體對奇異根串珠霉菌的抑菌率分別為74.33%和71.00%，抑菌帶寬分別為5.83、7.00 mm；菌液對奇異根串珠霉菌的抑菌率分別為78.00%和69.00%，抑菌帶寬分別為9.17、6.39 mm（圖1，表1）。

2.2 生防菌對其他病原菌的抑制作用

2 株生防菌brj-21 和wrj-2-5 對椰子心腐病、椰子灰斑病和椰子可可毛色二孢果腐病的病原菌均有一定的抑制效果，其中wrj-2-5 對椰子灰斑病菌的抑制作用最強，達(dá)83.78%，brj-21 對椰子灰斑病菌的抑制作用最強，達(dá)81.08%，2 株生防菌對椰子心腐病菌和椰子可可毛色二孢果腐病菌的抑菌率均在70%以上（表2）。

2.3 離體椰果實驗

在離體椰果上接種生防菌對奇異根串珠霉菌的擴(kuò)展有很好的抑制作用（圖2）。其中，在接種wrj-2-5 和brj-21 菌株5 d 后再接種病原菌奇異根串珠霉菌，對奇異根串珠霉菌抑制效果最好，病斑面積分別為0.76、0.79 cm²，顯著小于對照（3.14 cm²）；在接種病原菌2 d 后接種生防菌wrj-2-5 和brj-21 的效果最好，病斑面積分別為1.26、1.77 cm²，顯著小于對照（4.45 cm²）。綜上，生防菌wrj-2-5 和brj-21 對奇異根串珠霉菌的擴(kuò)展有很好的抑制作用，且接種生防菌越早，其效果越好（表3）。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 菌株wrj-2-5 和brj-21 生長曲線 菌株wrj-2-5 和brj-21 的生長曲線如圖3 所示。菌株wrj-2-5 的OD₆₀₀值在0～36 h 內(nèi)隨時間延長而增大，菌數(shù)呈指數(shù)增加進(jìn)入對數(shù)期并在36 h 時達(dá)到最大值，在36 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。菌株brj-21 的OD₆₀₀值在0～24 h 內(nèi)隨時間延長而增大，進(jìn)入對數(shù)期并在24 h 時達(dá)到最大值，在24 h 后OD₆₀₀值隨培養(yǎng)時間延長而降低，整個群體進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。

2.4.2 轉(zhuǎn)速對菌株wrj-2-5 和brj-21 生長的影響不同轉(zhuǎn)速對菌株wrj-2-5 和brj-21 生長具有顯著差異。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120～180 r/min 時，wrj-2-5 和brj-21 菌液濃度均隨轉(zhuǎn)速增加而增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速提高到180 r/min 以上時，菌液濃度無顯著差異（圖4）。

2.4.3 溫度對菌株wrj-2-5 和brj-21 生長的影響在不同溫度下，菌株wrj-2-5 和brj-21 均能生長，菌株wrj-2-5 在28 ℃時生長最快，菌液濃度顯著高于其他溫度；高于28 ℃時，菌液濃度呈逐漸下降趨勢。菌株brj-21 在28～32 ℃時生長最快，且在此溫度范圍內(nèi)無顯著差異；高于32 ℃時，菌液濃度呈逐漸下降趨勢（圖5）。溫度過高或過低對菌株的生長均有不良影響，最終確定菌株wrj-2-5的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃，菌株brj-21 的最佳發(fā)酵溫度為28～32 ℃。

2.4.4 初始pH 對菌株wrj-2-5 和brj-21 生長的影響 不同初始pH 對菌株wrj-2-5 和brj-21 生長的影響存在顯著性差異。當(dāng)初始pH 為6.0～8.0 時，菌株wrj-2-5 和brj-21 生長均較好，在此范圍內(nèi)無顯著性差異。當(dāng)pH 為10 時，菌株wrj-2-5 和brj-21的菌液濃度相對較低，生長緩慢；當(dāng)pH 為4.0 時，菌株wrj-2-5 和brj-21 基本不生長（圖6）。說明過酸或過堿的環(huán)境對菌株wrj-2-5 和brj-21 的生長均有抑制作用，因此確定菌株wrj-2-5 和brj-21 的最適pH 為6.0～8.0。

2.4.5 初始接種量對菌株wrj-2-5 和brj-21 生長的影響 當(dāng)初始接種量為8%時，菌株wrj-2-5 和brj-21 在經(jīng)過24 h 振蕩培養(yǎng)后濃度最高，其次是接種量為10%和6%的菌液濃度（圖7）。

3 討論

研究結(jié)果表明，生防菌糞產(chǎn)堿菌brj-21 和銅綠假單胞菌wrj-2-5 對奇異根串珠霉菌有較強的抑菌作用，抑菌率菌均在70%以上，對其他病原菌也有很好的抑制作用。已有研究證明，銅綠假單胞菌對番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、甜瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）及番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）均有較好的抑制作用，對番茄枯萎病盆栽防效達(dá)81%[13-14]，對煙草青枯病的防治效果優(yōu)于農(nóng)用鏈霉素，防效為60%[15]。在銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理方面，有研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌可通過產(chǎn)生吩嗪-1-羧酸、藤黃綠膿菌素、3，4-二羥基-N-甲基-4-苯并二氫吡喃酮-丁酰胺等抑制病原菌生長[16-17]，同時還可產(chǎn)生鐵載體，通過螯合自然界中的微量鐵元素，用特異的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)移至體內(nèi)，以促進(jìn)其鐵元素的吸收[18]。而有關(guān)糞產(chǎn)堿菌的研究報道較少，現(xiàn)有研究表明糞產(chǎn)堿菌可對多種有害物質(zhì)，如亞砷酸鹽、苯酚、硫化氫進(jìn)行降解，還可產(chǎn)生羥胺類等抑菌物質(zhì)[19]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)糞產(chǎn)堿菌51-A和51-B 對根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）具有較強的抑制作用，盆栽實驗表明，51-A和51-B 可顯著抑制根癌瘤的形成，對向日葵根癌病的防效分別為98.0%和97.0%[20]。YUEN[21-22]研究發(fā)現(xiàn)，糞產(chǎn)堿菌對鐮刀菌（Fusarium oxysporum）也有較強的抑制作用。

在離體椰果接種實驗中， 菌株brj-21 和wrj-2-5 的預(yù)防作用較優(yōu)于治療作用，在病原菌侵染前3～5 d 進(jìn)行接菌，其預(yù)防效果最佳。初步推測可能是因為奇異根串珠霉菌侵染椰果之前，生防菌搶占了病原菌的侵染位點，或激發(fā)了植物自身的免疫應(yīng)答系統(tǒng)[23]，從而減弱發(fā)病程度。下一步將重點研究生防菌在椰子內(nèi)的定殖及其相關(guān)基因的表達(dá)。本研究還對生防菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，生防菌在生長過程中能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，在適宜的發(fā)酵條件下，其抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量將更豐富，還能提高生物農(nóng)藥制劑的抑菌效果，進(jìn)而節(jié)約生產(chǎn)成本[24]。研究得出，銅綠假單胞菌wrj-2-5的最佳發(fā)酵條件為接種量8%、轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度28 ℃，初始pH 為6.0～8.0，培養(yǎng)36 h，這與盧曉虹等[14]對銅綠假單胞菌確定的發(fā)酵條件有所差異，可能是由于菌株來源、生境、用途等不同造成的，后續(xù)將進(jìn)一步驗證。

本研究中的生防菌株wrj-2-5 和brj-21 在防治由奇異根串珠霉菌引起的椰子病害中有較大的生防潛力，生防菌株的應(yīng)用將對椰子病害的防治提供更為綠色安全的方法。今后將加強對生防菌株wrj-2-5 和brj-21 次生代謝產(chǎn)物、菌株在植物體內(nèi)定殖和植物內(nèi)在抗性反應(yīng)等方面的研究。