程秋如　劉子凡　曾憲海

關(guān)鍵詞：油棕；C2H2 型鋅指蛋白；基因家族；低溫脅迫

中圖分類號(hào)：S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

鋅指蛋白（zink finger protein， ZFP）是一類廣泛存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，最早在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，具有手指狀結(jié)構(gòu)，通過與Zn2+結(jié)合來穩(wěn)定此結(jié)構(gòu)[1]。根據(jù)鋅指蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中組氨酸（H）和膀胱氨酸（C）的數(shù)目和位置，可將其劃分為C2H2、C3H、C2C2、C4、C6、C8、C2HC、C2HC5 等類型[2]。C2H2 型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子是目前研究最多的鋅指蛋白，廣泛存在于真核生物中， C2H2 型鋅指蛋白中含有特殊的X2-Cys-X（2-4）-CysX12-His-X（3-5）-His 保守結(jié)構(gòu)域，其中C 表示半胱氨酸，H 表示組氨酸，X 表示任意氨基酸，P 表示苯丙氨酸，L 表示亮氨酸[3-4]。多數(shù)C2H2 鋅指蛋白含有植物特有的一段高度保守的QALGGH 基序，該基序?qū)NA 的結(jié)合活性至關(guān)重要，C2H2 型鋅指蛋白不僅能與DNA、RNA結(jié)合還可以與蛋白質(zhì)相互作用，在植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA 代謝等途徑中發(fā)揮重要功能[5-8]。

C2H2型鋅指蛋白最早在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)[9]，隨后在其他植物的研究中逐漸增多，如擬南芥[10]，水稻[11]，楊樹[12]，煙草[13]，小麥[14]，番茄[15]、木薯[16]，馬鈴薯[17]，大麻[18]等，這些都證明C2H2型鋅指蛋白參與了植物的營養(yǎng)生長、生殖發(fā)育及對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。C2H2 型鋅指蛋白在植物的抗寒中發(fā)揮重要作用。SAKAMOTO 等[7]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥C2H2 家族的STZ、AZF1 和AZF3 基因在低溫脅迫下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。過表達(dá)ZAT12 基因可以有效的提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐低溫能力[19]。ZHANG 等[20] 研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達(dá)SlCZFP1 基因可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐低溫能力。在枳中發(fā)現(xiàn)PtrZPT2-1 基因在低溫脅迫下表達(dá)量顯著升高，且過表達(dá)PtrZPT2-1 基因的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性[21]。在大豆中發(fā)現(xiàn)C2H2 型鋅指蛋白家族的SCOF-1 基因可以誘導(dǎo)下游COR 基因的表達(dá)，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒能力[22]。矮牽牛中ZPT2-2 基因可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐低溫能力[23]。在煙草中轉(zhuǎn)OSISAP1 基因可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒能力[24]。在水稻中ZFP245、ZFP18 基因在低溫下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)[25]，過表達(dá)OsZFP151 可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的耐低溫能力[26]，上述研究結(jié)果說明，C2H2 基因在響應(yīng)植物的低溫脅迫過程中發(fā)揮著積極作用，而油棕C2H2 型鋅指蛋白家族是否參與低溫脅迫的應(yīng)答尚不明析。因此，在油棕基因組中鑒定C2H2 型鋅指蛋白并明確其在低溫脅迫中的功能對(duì)油棕抗寒研究是非常重要的。

油棕（Elaeis guineensis Jacq.）是一種重要的熱帶木本油料作物，也是世界上產(chǎn)油效率最高的油料作物，年均產(chǎn)油量高達(dá)4.27 t/hm2，被譽(yù)為“世界油王”[27]。油棕原產(chǎn)于熱帶非洲，喜高溫多雨的氣候，適宜在年均氣溫為25～28 ℃的地區(qū)生長[28]，我國熱區(qū)地處熱帶北緣，年平均氣溫19.0～25.4 ℃，極端最低溫達(dá)0～5 ℃，熱量低于油棕原產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重影響了油棕的生長發(fā)育和產(chǎn)量[29]。本研究以擬南芥C2H2 氨基酸序列作為探針，在油棕基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行本地BLASTP 比對(duì)，篩選出油棕C2H2 型鋅指蛋白家族，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR 方法分析油棕C2H2 家族基因在低溫脅迫下的表達(dá)情況，以期為后續(xù)油棕C2H2 家族基因的低溫脅迫研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為本課題組前期篩選的云南大理（東經(jīng)100°72′，北緯25°50′，海拔1381 m，年均溫14.9 ℃，極端最低溫–3.3～2.3 ℃[30]）抗寒高產(chǎn)油棕成齡樹的自交子一代耐寒材料和冷敏感材料各3 株[31]，苗齡約為3 年，現(xiàn)存葉片數(shù)為5～10片，株高100～150 cm。

將耐寒材料和冷敏感材料放置于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所冷庫中進(jìn)行4 ℃低溫處理（每天光照時(shí)間12 h），分別在低溫處理0、1、3、5 d 時(shí)進(jìn)行取樣。采集植株第2～3 片葉葉軸中部兩邊的小葉作為樣品，將葉樣用去離子水洗凈后再用錫箔紙嚴(yán)密包裹然后放到液氮中速凍，最后轉(zhuǎn)移到–80 ℃超低溫冰箱保存，用于總RNA 提取，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

本研究將耐寒材料命名為CT（cold tolerance），冷敏感材料命名為CS（cold sensitive），CT 低溫處理0、1、3、5 d 的樣品命名為CT0、CT1、CT3、CT5，CS 低溫處理0、1、3、5 d 的樣品命名為CS0、CS1、CS3、CS5，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 油棕C2H2 家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析從 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站下載油棕基因組序列和基因組蛋白質(zhì)序列，從TAIR數(shù)據(jù)庫中下載176 個(gè)擬南芥C2H2 型鋅指蛋白家族氨基酸序列，以擬南芥C2H2 氨基酸序列作為探針，在油棕基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行本地BLASTP比對(duì)，閾值設(shè)置為1e–5，獲得與擬南芥C2H2 型鋅指蛋白相似度高的油棕蛋白質(zhì)全長序列。將獲得的油棕C2H2 基因序列在pfam（http：//pfam.xfam.org/）、Batch Web CD-Search Tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi ） 和SMART9.0（http：//smart.embl-heidelberg.de/）等在線軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，篩選含有C2H2 結(jié)構(gòu)域的蛋白序列確定為油棕C2H2 型鋅指蛋白家族成員。在ExPASy 網(wǎng)站（ http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)獲得的油棕C2H2 型鋅指蛋白家族成員進(jìn)行氨基酸數(shù)、分子量（MW）、等電點(diǎn)（pI）、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)分析。使用WOLFPSORT網(wǎng)站（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及染色體定位 將獲得的油棕和擬南芥的C2H2 型鋅指蛋白序列使用MEGA7.0 軟件基于NJ（Neighbor join）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 值為1000 次。以油棕基因組注釋信息為依據(jù)，使用TBtools 軟件[33]進(jìn)行油棕C2H2 鋅指蛋白家族基因的染色體定位。

1.2.3 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析 使用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，并使用TBtools 軟件[32]進(jìn)行可視化圖片的輸出。保守基序使用在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/）分析，并使用TBtools 軟件[32]進(jìn)行可視化圖片的輸出。

1.2.4 啟動(dòng)子順式元件分析 使用 TBtool 軟件[32]提取油棕C2H2 型鋅指蛋白家族成員的啟動(dòng)子序列， 使用PlantCARE （ http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm）在線網(wǎng)站進(jìn)行順式元件預(yù)測，并使用TBtools 軟件[32]進(jìn)行可視化圖片的輸出。

1.2.5 低溫脅迫下EgC2H2 基因家族成員的表達(dá)分析 根據(jù)前期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（未發(fā)表數(shù)據(jù)）的結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中提取油棕C2H2 型鋅指蛋白家族成員的FPKM 值，利用TBtools 軟件[32]繪制熱圖。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選16 個(gè)顯著差異表達(dá)的EgC2H2 基因進(jìn)行qRT-PCR 分析。采用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量，使用Agilent2100 對(duì)RNA 的濃度和A260/A280 進(jìn)行檢測。使用thermo scientific RevertAid First StrandcDNA Kit 試劑盒進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄。使用CFX96Real-time PCR System（Bio-Rad， United States）儀器進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體積為20 μL，包括ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 10.0 μL、正向及反向引物（10 umol/L）各0.4 μL、cDNA（10 ng/L）1.0 μL 以及ddH2O8.2 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。Egβ-actin 為內(nèi)參基因[33]，利用NCBI 中的primer-BLAST 設(shè)計(jì)特異性引物，并由擎科生物科技有限公司海南分公司合成，引物序列見表1。采用2–CT 方法，計(jì)算基因的表達(dá)量，使用Originpro2018 軟件進(jìn)行繪圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DPS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Duncans法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油棕C2H2家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

根據(jù)擬南芥C2H2 氨基酸序列在油棕基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTP 比對(duì)、篩選和驗(yàn)證，共獲得73 個(gè)油棕C2H2 型鋅指蛋白家族成員，并將其命名為EgC2H2-01～EgC2H2-73，如表2。在油棕C2H2 基因編碼的蛋白質(zhì)中，氨基酸的數(shù)目為128～556 個(gè)，分子量為14 176.73～58 983.30 Da，等電點(diǎn)為4.99～9.62，不穩(wěn)定系數(shù)為38.84～86.01，除EgC2H2-67 屬于穩(wěn)定蛋白，其他均為不穩(wěn)定蛋白，親水性為-1.154～-0.226，亞細(xì)胞定位顯示C2H2 基因家族所有成員均定位于細(xì)胞核。

2.2 C2H2 家族成員進(jìn)化樹分析

利用MEGA7.0 軟件對(duì)油棕和擬南芥C2H2 氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖1），可以將C2H2 基因分成4 個(gè)亞家族，分別命名為Ⅰ～Ⅳ。擬南芥和油棕C2H2 基因在4 個(gè)亞家族中均有分布，第Ⅰ亞家族C2H2 基因最多，有59 個(gè)成員，第Ⅱ亞家族有56 個(gè)成員，第Ⅲ亞家族有12 個(gè)成員，第Ⅳ亞家族最少，有9個(gè)成員。油棕C2H2 與擬南芥C2H2 發(fā)生明顯聚類，表明C2H2 型鋅指蛋白在進(jìn)化上具有保守性。

2.3 油棕C2H2 基因家族染色體定位

根據(jù)油棕基因組注釋文件，利用TBtools 軟件對(duì)油棕C2H2 家族基因的染色體位置進(jìn)行可視化圖片的輸出。如圖2 所示，73 個(gè)油棕C2H2 家族中的55 個(gè)基因不均勻的分布于16 條染色體上，其中Chrom04、Chrom05 和Chrom11 染色體上分布的基因數(shù)目最多，均分布有6 個(gè)EgC2H2 基因，Chrom02 和Chrom15 染色體上均分布5 個(gè)EgC2H2基因，Chrom08、Chrom13 和Chrom16 染色體上均分布有4 個(gè)EgC2H2 基因，Chrom03 染色體上分布有3 個(gè)EgC2H2 基因，Chrom01、Chrom07、Chrom10、Chrom12 和Chrom14 染色體上均分布有2 個(gè)EgC2H2 基因，Chrom06 和Chrom09 染色體上基因數(shù)目最少，均分布有1 個(gè)EgC2H2 基因，18 個(gè)EgC2H2 基因未確定染色體位置。

2.4 油棕C2H2 基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

本研究對(duì)EgC2H2 家族基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析（圖3），73 個(gè)EgC2H2 基因含有1～4 個(gè)外顯子，EgC2H2-42 和EgC2H2-66 含有2 個(gè)外顯子，EgC2H2-19 和EgC2H2-33 含有3 個(gè)外顯子，EgC2H2-31 、EgC2H2-32 、EgC2H2-53 和EgC2H2-54 含有4 個(gè)外顯子，其他EgC2H2 基因僅含有1 個(gè)外顯子。此外，9 個(gè)EgC2H2 基因含有內(nèi)含子，其他均無內(nèi)含子。

2.5 油棕C2H2 基因家族保守基序分析

利用在線網(wǎng)站MEME 搜索獲得了73 個(gè)EgC2H2 基因的10 個(gè)保守基序（圖4），其中Motif1、Motif 2 和Motif 6 含有C2H2 型鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域，都存在典型的QALGGH 基序，屬于Q型C2H2 鋅指蛋白；Motif 1 和Motif 2 含有21 個(gè)保守氨基酸，Motif 6 含有26 個(gè)保守氨基酸。EgC2H2 基因家族成員含有1 個(gè)或多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中Motif 1 在EgC2H2 基因家族分布最廣，62 個(gè)EgC2H2 基因含有Motif 1，說明Motif 1 在EgC2H2 基因家族發(fā)揮關(guān)鍵作用，7 個(gè)EgC2H2 基因同時(shí)具有Motif 1、Motif 2 和Motif 6。此外Motif7、Motif 9 和Motif 5 在EgC2H2 基因家族中也分布較多，說明EgC2H2 基因家族保守結(jié)構(gòu)域的種類和數(shù)量比較豐富。Motif 10 和Motif 5 為第Ⅰ亞家族所特有，且每個(gè)成員均含1 個(gè)Motif 5，Motif8 為第Ⅲ亞家族特有，同一亞家族成員的保守結(jié)構(gòu)域具有較高的一致性。

2.6 油棕C2H2 基因家族啟動(dòng)子順式元件分析

對(duì)油棕C2H2 基因家族起始位點(diǎn)上游2000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式元件分析（圖5），結(jié)果表明，油棕C2H2 基因家族含有多種啟動(dòng)子順式元件，除EgC2H2-36 和EgC2H2-06 外，所有C2H2啟動(dòng)子均含有1 個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子順式元件。光響應(yīng)元件在EgC2H2 基因家族分布最廣，除EgC2H2-36、EgC2H2-41、EgC2H2-21 和EgC2H2-06 外，其他EgC2H2 基因均含有光響應(yīng)元件，此外，EgC2H2 基因家族還含有大量與植物激素和逆境脅迫有關(guān)的響應(yīng)元件，如83.6%的EgC2H2 家族成員含有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，75.3%的EgC2H2家族成員含有脫落酸響應(yīng)元件，47.9%的EgC2H2家族成員含有生長素響應(yīng)元件，58.9%的EgC2H2家族成員含有赤霉素響應(yīng)元件，69.9%的EgC2H2家族成員含有茉莉酸甲酯誘導(dǎo)響應(yīng)元件，54.8%的EgC2H2 家族成員含有干旱響應(yīng)元件，50.7%的EgC2H2 家族成員含有水楊酸響應(yīng)元件，42.5%的EgC2H2 家族成員含有低溫響應(yīng)元件，此外，部分EgC2H2 家族成員還含有防御與脅迫響應(yīng)元件。表明EgC2H2 家族在響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

2.7 油棕C2H2 基因家族表達(dá)分析

對(duì)耐寒材料和低溫敏感材料低溫脅迫0、1、3、5 d 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用TBtools 軟件繪制油棕C2H2 基因家族表達(dá)模式的熱圖（圖6）。結(jié)果顯示，低溫脅迫下，EgC2H2 基因在不同材料之間和同一材料不同處理時(shí)間之間的表達(dá)量有明顯差異，說明EgC2H2 家族基因能夠被低溫誘導(dǎo)。低溫脅迫下，EgC2H2 基因家族中有10個(gè)基因未表達(dá)，其他基因均有表達(dá)，且在CT 的表達(dá)量變化較CS 顯著，上調(diào)表達(dá)基因中大量基因在CT3 和CT5 中表達(dá)量相對(duì)較高，少量基因在CS3 和CS5 中表達(dá)量高，下調(diào)表達(dá)基因中大量基因在CT0 和CT1 中表達(dá)量高，少量基因在CS0和CS1 中表達(dá)量高。隨低溫脅迫時(shí)間的延長，EgC2H2-11、EgC2H2-07、EgC2H2-23、EgC2H2-17、EgC2H2-21、EgC2H2-33、EgC2H2-67、EgC2H2-16和EgC2H2-28 的表達(dá)量在CT 中持續(xù)升高，在CT5處理下表達(dá)量最高。EgC2H2-25、EgC2H2-26 和EgC2H2-30 的表達(dá)量在CS 中持續(xù)升高，在CS5處理下表達(dá)量最高。隨低溫脅迫時(shí)間的延長，EgC2H2-43、EgC2H2-39、EgC2H2-66、EgC2H2-69、EgC2H2-14 和EgC2H2-50 表達(dá)量持續(xù)降低，在低溫處理5 d 時(shí)表達(dá)量最低。

2.8 油棕C2H2 基因家族成員在低溫脅迫下qRT-PCR 分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選了16 個(gè)顯著差異表達(dá)的EgC2H2 基因進(jìn)行熒光定量PCR 分析（圖7）。結(jié)果表明，低溫脅迫處理后，16 個(gè)EgC2H2基因在同一材料不同處理時(shí)間下差異顯著，且變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致，EgC2H2-20、EgC2H2-24、EgC2H2-71、EgC2H2-27 和EgC2H2-19 基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長在CT 中呈先升高再降低的趨勢，在低溫處理3 d 時(shí)達(dá)到最高水平，且表達(dá)量明顯高于CS，但在CS中則呈持續(xù)升高的趨勢。EgC2H2-07、EgC2H2-26、EgC2H2-11、EgC2H2-73、EgC2H2-17、EgC2H2-16、EgC2H2-30、EgC2H2-21、和EgC2H2-23 基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長呈升高的趨勢，其中EgC2H2-26 和EgC2H2-30 基因低溫脅迫后在CS 中的表達(dá)量高于CT，EgC2H2-11、EgC2H2-17、EgC2H2-16、EgC2H2-21 和EgC2H2-23 基因低溫脅迫后在CT 中的表達(dá)量顯著高于CS，且升高的幅度較大，低溫脅迫5 d 時(shí)表達(dá)量分別是CS 的2.0、3.7、2.4、5.5 和1.4 倍。EgC2H2-11、EgC2H2-17、EgC2H2-21、EgC2H2-19 和EgC2H2-23 基因低溫脅迫下表達(dá)量上升的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他基因，可能與耐寒材料較強(qiáng)的抗寒能力有關(guān)。

3 討論

鋅指蛋白是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，C2H2 型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子是目前研究較多的鋅指蛋白，在植物的生長發(fā)育以及高鹽、低溫、干旱等非生物脅迫響應(yīng)中扮演重要作用[23， 34-35]。目前國內(nèi)外關(guān)于C2H2 型鋅指蛋白在其他植物中的報(bào)道越來越多，如矮牽牛、擬南芥、水稻、楊樹、小麥、馬鈴薯等[9-12， 14， 17]，然而油棕C2H2型鋅指蛋白家族的研究還未見報(bào)道。本研究對(duì)油棕C2H2 型鋅指蛋白家族的全基因組鑒定，共獲得73 條含有C2H2 鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域的油棕C2H2 基因，比擬南芥（176 個(gè)）[10]、煙草（116個(gè)）[13]、水稻（189 個(gè)）[11]、小麥（122 個(gè)）[14]、楊樹（109 個(gè)）[12]、番茄（92）[15]和木薯（85）[16]的C2H2 基因家族成員數(shù)目少，說明不同物種間數(shù)量差異較大，C2H2 基因在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因復(fù)制。

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，油棕C2H2 基因家族可以分為4 個(gè)亞家族，每個(gè)亞家族的結(jié)構(gòu)域類型存在高度的一致性，第Ⅲ、Ⅳ亞家族的EgC2H2基因均含有zf-C2H2 結(jié)構(gòu)域，而第Ⅰ、Ⅱ亞家族的EgC2H2 基因均含有典型的zf-C2H2-6 結(jié)構(gòu)域，且第Ⅰ和第Ⅱ亞家族成員數(shù)量占總數(shù)的85%，說明zf-C2H2-6 結(jié)構(gòu)域是油棕C2H2 家族中發(fā)揮作用的重要結(jié)構(gòu)域。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，每個(gè)成員均至少含有1 個(gè)鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域，不同亞家族motif 類型和數(shù)量存在明顯差異，但同一亞家族C2H2 成員的保守基序和數(shù)量具有較高的一致性，推測同一亞家族基因功能接近或相同。Motif1、Motif 2 和Motif 6 結(jié)構(gòu)域中均含有植物C2H2鋅指蛋白特有的一段高度保守的QALGGH 基序，早期研究報(bào)道QALGGH 基序是與DNA 的結(jié)合的重要基序，在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[7-8]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，油棕C2H2 基因家族的基因結(jié)構(gòu)簡單，大部分成員含有1 個(gè)外顯子，且數(shù)量差異較小，僅極少數(shù)成員含有內(nèi)含子，屬于內(nèi)含子缺失型，說明油棕C2H2 基因家族在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了內(nèi)含子丟失的現(xiàn)象，這與在大麻、木薯、小麥、煙草等植物中的研究結(jié)果類似[13-14， 16， 18]。C2H2 基因家族的外顯子和內(nèi)含子數(shù)目在不同物種間具有較高的保守性，有研究報(bào)道，內(nèi)含子缺失型基因可以更快速地響應(yīng)逆境脅迫[36]。啟動(dòng)子順式元件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)油棕C2H2家族含有大量與植物激素和逆境脅迫有關(guān)的響應(yīng)元件，這些結(jié)果與其他植物發(fā)現(xiàn)的順式元件結(jié)果類似[12， 14， 35]，進(jìn)一步說明油棕C2H2 基因家族參與非生物脅迫過程。

大量研究表明，C2H2 型鋅指蛋白在植物的抗寒中發(fā)揮重要作用。過表達(dá)C2H2 基因可以增強(qiáng)擬南芥、水稻、煙草等多種植物的抗寒性[19-21， 24-26]。本研究對(duì)不同低溫處理時(shí)間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，油棕C2H2 基因家族成員中63 個(gè)基因在不同處理時(shí)間之間的表達(dá)量有明顯差異，說明油棕C2H2 基因家族響應(yīng)低溫脅迫，這些基因大多數(shù)在耐寒材料中高表達(dá)，而在冷敏感材料中低表達(dá)，這可能與耐寒材料較強(qiáng)的抗寒能力有關(guān)。qRT-PCR 結(jié)果顯示，16 個(gè)EgC2H2 基因在低溫脅迫下的表達(dá)量均發(fā)生了顯著變化，除EgC2H2-26、EgC2H2-09 和EgC2H2-30 外，其他基因的表達(dá)量變化趨勢均顯著高于冷敏感材料，推測EgC2H2基因在耐寒材料中感受低溫的速度快于冷敏感材料，耐寒材料可能通過增加EgC2H2 基因的快速表達(dá)加快了低溫信號(hào)的傳遞，并誘導(dǎo)下游冷響應(yīng)基因的表達(dá)，從而使植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒能力。本研究還發(fā)現(xiàn)， EgC2H2-11 、EgC2H2-17 、EgC2H2-21、EgC2H2-19 和EgC2H2-23 顯著上調(diào)表達(dá)與谷子中SiC2H2-78 的表達(dá)模式類似[37]，且表達(dá)量顯著高于冷敏感材料，表明耐寒材料可能通過提高這些基因的表達(dá)量來抵御低溫傷害，預(yù)示著這些基因在低溫脅迫中起正向調(diào)控作用，可以作為抗寒候選基因進(jìn)一步深入研究。