甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌群落組成對(duì)不同配方緩釋肥的響應(yīng)

肖健　梁闐　楊尚東　譚宏偉

關(guān)鍵詞：甘蔗；緩釋肥；內(nèi)生細(xì)菌；高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

甘蔗（Saccharum officinarum L.）作為一種重要的糖料作物，在世界各地被用作生物燃料和可再生生物能源[1]。中國是世界第三大甘蔗生產(chǎn)國，自1993 年以來，廣西一直是中國最大的甘蔗生產(chǎn)和制糖省份[2]。由于甘蔗的生育期長達(dá)一年以上，使用常規(guī)化肥（尿素等）和復(fù)合肥等化學(xué)肥料，需要在7 月前再追肥2～3 次才能滿足甘蔗的生長需求[3]。同時(shí)，甘蔗僅追施常規(guī)化學(xué)肥料，會(huì)導(dǎo)致甘蔗生長后期養(yǎng)分供應(yīng)不足，亦會(huì)出現(xiàn)甘蔗含糖量及產(chǎn)量偏低等問題，還會(huì)導(dǎo)致土壤肥力下降和生態(tài)環(huán)境污染[4]。過度使用化肥，不僅對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響，還會(huì)破壞陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)的功能[5]。此外，由于近年來勞動(dòng)力成本較高，如何減少化肥的投入和勞動(dòng)力成本是我國甘蔗生產(chǎn)的迫切需求。緩釋肥不僅能有效滿足甘蔗對(duì)養(yǎng)分的需求，而且有助于節(jié)約甘蔗生產(chǎn)的人工成本。肖健等[1]研究發(fā)現(xiàn)施肥不僅會(huì)影響甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，還會(huì)影響甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌的代謝功能。開展不同配方緩釋肥處理后甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌群落組成分析，不僅有助于篩選科學(xué)的甘蔗專用緩釋肥配方和用量，還有利于甘蔗實(shí)際生產(chǎn)中緩釋肥的科學(xué)合理應(yīng)用。

緩釋肥是近年來發(fā)展起來的一種新型肥料，它不僅能使養(yǎng)分在較長時(shí)間內(nèi)緩慢釋放，符合作物的生理養(yǎng)分需求，而且還能通過減少肥料總量和施用量來提高肥料利用率[6-8]。此外，由于緩釋肥的氮素釋放速率更接近植物生理功能對(duì)氮素的需求。因此，緩釋肥有望成為常規(guī)肥料的替代品[9]。研究發(fā)現(xiàn)，與施用常規(guī)肥料相比，施用緩釋肥不僅可以減少土壤中的殘留養(yǎng)分，還可以提高作物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益[10-11]?，F(xiàn)階段，緩釋肥已經(jīng)開始應(yīng)用于桃樹[12]、槲櫟[13]、煙草[14]、蔬菜[15]、水稻[16]、玉米[17]、甘蔗[4]等經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)和種植。ZHANG 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在鎘污染的土壤中，緩釋肥可以提高蔬菜產(chǎn)量，還能降低小白菜的鎘濃度。DONG 等[18]還發(fā)現(xiàn)，施用緩釋肥可以減少稻田中的氮淋失。目前為止，雖然已有眾多關(guān)于緩釋肥應(yīng)用于甘蔗生產(chǎn)的研究報(bào)道，但大部分涉及甘蔗緩釋肥的研究主要集中在對(duì)甘蔗產(chǎn)量和質(zhì)量的影響等方面[19-20]。另一方面，植物內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物關(guān)系密切[21]，還在一定程度上具有指示植株健康生長以及抗性大小的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌具有溶磷、解鉀、固氮等作用以及產(chǎn)生鐵載體、抗菌活性物質(zhì)和植物生長激素等作用，具有促進(jìn)宿主植物生長、營養(yǎng)物質(zhì)積累和提高抗逆（抗病蟲害、高溫、鹽堿或干旱等）功能[1]。

雖然目前不同施肥技術(shù)對(duì)作物內(nèi)生細(xì)菌的影響已有研究，但緩釋肥對(duì)甘蔗內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究仍鮮見報(bào)道。為此，本研究分析不同配方緩釋肥處理甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌群落組成，探究不同配方緩釋肥對(duì)甘蔗生長、健康狀況以及抗性的影響，旨在篩選科學(xué)的甘蔗專用緩釋肥配方與用量，為甘蔗生產(chǎn)中科學(xué)合理地應(yīng)用緩釋肥提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)地概況試驗(yàn)地為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所隆安試驗(yàn)基地（107°52′36″E， 22°37′02″N）。土壤類型為黃壤土，地勢(shì)平坦，排灌條件良好，前茬作物為甘蔗。供試土壤基本理化性質(zhì)如下：pH 5.7，有機(jī)質(zhì)含量17.6 g/kg，全氮含量0.92 g/kg，全磷含量0.62 g/kg，全鉀含量8.9 g/kg，堿解氮含量85 mg/kg，速效磷含量35.3 mg/kg；速效鉀含量125 mg/kg。

1.1.2 試驗(yàn)材料供試甘蔗品種為‘桂糖42 號(hào)，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育；供試肥料為采用硫酸脲技術(shù)生產(chǎn)的42%甘蔗專用緩釋肥，N-P-K 含量為20-7-15，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供，共有6 個(gè)配方，其中配方A、B、C 分別添加長效劑（雙氰胺）120、150、235 g/t，配方D、E、F 分別添加增效劑（腐植酸）3、8、18 kg/t；45%復(fù)合肥（N-P-K 含量為15-15-15）、過磷酸鈣、氯化鉀和尿素均為國產(chǎn)，購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)資市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)開始于2016 年，以常規(guī)施肥（CK）為對(duì)照，即：施45%復(fù)合肥1800 kg/hm²（其中基肥300 kg/hm²，拔節(jié)肥1500 kg/hm²），過磷酸鈣750 kg/hm²作為基肥，氯化鉀（3 次施用）375 kg/hm²，尿素（3 次施用）375 kg/hm²。分別設(shè)置6 個(gè)不同配方緩釋肥處理，A：緩釋肥2250 kg/hm²+ 長效劑125 g/t ； B ： 緩釋肥2250 kg/hm²+ 長效劑150 g/t ； C ： 緩釋肥2250 kg/hm²+ 長效劑235 g/t ； D ： 緩釋肥2250 kg/hm²+增效劑3 g/t；E：緩釋肥2250 kg/hm²+增效劑8 g/t；F：緩釋肥2250 kg/hm²+增效劑18 g/t。

上述處理除施肥量不同外，其余田間管理措施（如灌溉和除草等）均相同。每種施肥模式作為1 個(gè)試驗(yàn)處理，共7 個(gè)處理，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，共21 個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)5 行，長10 m，寬1.2 m，小區(qū)面積60 m²。

此外，下種量為105 000 芽/hm²，選擇無病蟲害、蔗莖均勻、蔗芽飽滿的莖種按雙行品字形進(jìn)行擺種，蓋3～5 cm 厚細(xì)泥、覆蓋地膜。當(dāng)年3月種植甘蔗，5 月上中旬施分蘗肥，5 月下旬至6月中旬施拔節(jié)肥，翌年1—2 月采收。后續(xù)每年的施肥試驗(yàn)處理及田間管理措施均與2016 年一致。

1.2.2 樣品采集 試驗(yàn)處理的第4 年（2019 年）10 月上旬隨機(jī)采集甘蔗樣品。參照YANG 等[23]的方法采集樣品，具體操作如下：于各施肥處理下，使用75%乙醇噴灑消毒后的鐵鏟，隨機(jī)選取3 株長勢(shì)一致的甘蔗植株，然后以蔗莖為中心（直徑約60 cm）挖深度約40 cm，形成疏松、環(huán)形的根際圈。然后手握植株莖基部用力將整個(gè)植株連根帶土拔起，抖掉附著在根部的土壤，標(biāo)記后裝入無菌密封袋放入帶有冰袋的冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室。

參照DI 等[24]的方法對(duì)莖部進(jìn)行消毒處理。使用無菌水沖洗植株表面， 用軟毛刷輕輕擦拭2 min，去除表面雜質(zhì)和附著物，用無菌紙擦干，去除水分；然后用75%乙醇噴灑消毒后的剪刀采集植株莖部樣品，用無菌水洗滌樣品0.5 min，接著在75%乙醇中洗滌1 min，再用1% NaClO 溶液洗滌3 min ， 最后使用無菌水洗滌植物組織0.5 min，即視為對(duì)植物組織表面進(jìn)行無菌化處理。為確定外植體表面殺菌的成功與否，將洗凈莖部的100 μL 水置于Luria-Bertani（LB）瓊脂平板（NaCl 10 g/L，細(xì)菌用胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂20 g/L）上，25 ℃培養(yǎng)7 d。若平板中未見菌落，則證實(shí)已徹底消毒。將表面無菌化的甘蔗莖部樣片用于莖部內(nèi)生細(xì)菌檢測(cè)分析。

1.2.3 植株莖部內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成植株莖部樣品總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定。測(cè)序流程如下：使用FastDNA Spin Kit 試劑盒（MP Biomedicals，USA）對(duì)甘蔗植株莖部進(jìn)行總DNA 抽提，并使用NanoDrop2000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，USA）檢測(cè)DNA 濃度和純度，以提取的莖部內(nèi)生細(xì)菌DNA 為模板， 選擇799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1392R（5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′）引物對(duì)V5～V7可變區(qū)進(jìn)行第1 輪PCR 擴(kuò)增，選擇799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）引物對(duì)V5～V7 可變區(qū)進(jìn)行第2 輪PCR 擴(kuò)增；然后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel ExtractionKit（Axygen Biosci-ences， Union City， CA， USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Quantus Fluorometer（Promega， USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)； 使用NEXTFLEX RapidDNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫；最后利用Illumina 公司的MiseqPE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。參照肖健等[1]的研究方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Mothur（v.1.30.2）軟件計(jì)算細(xì)菌群落的Alpha 多樣性。選擇相似度為97%的OTU 表，并使用R 語言（v.3.3.1）工具進(jìn)行細(xì)菌群落組成分析和維恩圖分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪圖。使用LEfSe軟件對(duì)樣品按照基于分類學(xué)組成的不同分組條件進(jìn)行線性判別分析（LDA），以確定對(duì)樣品劃分有明顯差異影響的群組。使用BugBase 工具對(duì)微生物組進(jìn)行表型預(yù)測(cè)。使用PICRUSt（v.1.1.0）軟件對(duì)OTU 豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書，http：//www.genome.jp/kegg/）計(jì)算各功能類別的豐度。

數(shù)據(jù)采用Excel 2019 軟件進(jìn)行計(jì)算，采用IBM SPSS Statistics 21 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncans 法和秩和檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P<0.05），并利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger 云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用不同配方甘蔗專用緩釋肥甘蔗莖部內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

以Shannon 指數(shù)指示內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，Chao1 和Ace 指數(shù)指示內(nèi)生細(xì)菌的豐富度。Shannon、Chao1 和Ace 指數(shù)越大，說明樣品的物種多樣性和豐富度越高。由表1 可知，與CK 相比，緩釋肥C、D、F 處理均顯著提高了甘蔗莖部內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，緩釋肥A、E 處理則顯著降低了甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，緩釋肥B 處理與CK 之間無顯著性差異；此外，甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌豐富度，除緩釋肥A 和B 處理顯著降低外，其余處理與常規(guī)施肥之間均無顯著性差異。

基于OTU 水平的主坐標(biāo)分析（principalco-ordinates analysis， PCoA）發(fā)現(xiàn)（圖1），PC1的解釋度為49.14%，PC2 的解釋度為13.48%，PC1 和PC2 的總和大于50%，說明坐標(biāo)軸對(duì)內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)總體解釋度較好。結(jié)果表明，不同緩釋肥處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間存在顯著差異（P<0.05），但每組樣品聚類在一起，組間群落結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較小。

2.2 施用不同配方緩釋肥甘蔗植株莖部群落組成分析

2.2.1 內(nèi)生細(xì)菌門分類水平組成 門分類水平方面，不同緩釋肥A、B、C、D、E、F 和CK 處理下，甘蔗植株莖部中相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門分類水平數(shù)量分別為4、4、6、5、5、6、3 個(gè)（圖2）。其中，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）是7 個(gè)處理所共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。CK 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度大小排序依次為：放線菌門（Actinobacteria， 79.03%）、變形菌門（Proteobacteria， 16.41%）和厚壁菌門（Firmicutes， 2.27%）；緩釋肥A 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度大小排序依次為：放線菌門（Actinobacteria， 73.76%）、變形菌門（ Proteobacteria， 13.39% ）、擬桿菌門（Bacteroidetes， 9.94%）和厚壁菌門（Firmicutes，2.67%）；緩釋肥B 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度大小排序依次為：放線菌門（ Actinobacteria， 57.01% ）、變形菌門（Proteobacteria， 35.20%）、厚壁菌門（Firmicutes，4.74%）和酸桿菌門（Acidobacteria， 1.34%）；緩釋肥C 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度大小排序依次為：放線菌門（Actinobacteria，37.89% ）、變形菌門（ Proteobacteria，50.87%）、厚壁菌門（Firmicutes， 2.93%）、擬桿菌門（Bacteroidetes， 2.26%）、酸桿菌門（Acidobacteria，2.05%）、綠彎菌門（Chloroflexi， 1.82%）和其他門類（others， 2.18%）；緩釋肥D 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度大小順序依次為： 變形菌門（ Proteobacteria，71.66%）、放線菌門（Actinobacteria， 13.82%）、厚壁菌門（Firmicutes， 8.95%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，2.91%） 和酸桿菌門（ Acidobacteria，1.20%）；緩釋肥E 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度大小順序依次為：放線菌門（ Actinobacteria， 75.89% ）， 變形菌門（ Proteobacteria， 16.79% ）， 擬桿菌門（Bacteroidetes， 3.55%），厚壁菌門（Firmicutes，1.72%）和酸桿菌門（Acidobacteria， 1.28%）；緩釋肥F 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度大小順序依次為：變形菌門（Proteobacteria，67.15% ）， 放線菌門（ Actinobacteria，17.65%），厚壁菌門（Firmicutes， 9.27%），擬桿菌門（Bacteroidetes， 2.17%），酸桿菌門（Acidobacteria，1.83%）和綠彎菌門（Chloroflexi， 1.11%）。

上述結(jié)果表明，與CK 處理相比，雖然不同配方緩釋肥處理均不同程度地降低了放線菌門（Actinobacteria）細(xì)菌的相對(duì)豐度，但也不同程度地增加了其他優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門的數(shù)量。

2.2.2 內(nèi)生細(xì)菌屬分類水平組成 屬分類水平方面，不同配方緩釋肥處理下，甘蔗植株莖部中相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分類數(shù)量及豐度見圖3。其中，6 種不同緩釋肥配方（A～F）和CK處理下，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的數(shù)量分別為9、6、12、13、6、13 和4 個(gè)。

CK 處理下，甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度大小順序依次分別為：雷弗松氏菌屬（Leifsonia， 71.12%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia， 6.77%）、草螺菌屬（Herbaspirillum， 3.03%）、unclassified_f__Microbacteriaceae（1.87%）和其他（others，11.06%）；緩釋肥A 處理下，甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度大小順序依次分別為：雷弗松氏菌屬（Leifsonia， 70.22%）、生孢噬纖維菌屬（Sporocytophaga， 7.28%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，5.43%）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina， 1.79%）、unclassified_f__Microbacteriaceae（1.52%）、紅球菌屬（Rhodococcus， 1.22%）、纖維弧菌屬（Cellvibrio，1.13%）、假單胞菌屬（Pseudomonas， 1.11%）、泛菌屬（Pantoea， 1.03%）和其他（others， 6.20%）；緩釋肥B 處理下，甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的相對(duì)豐度大小順序依次為：雷弗松氏菌屬（Leifsonia，50.40%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-P araburkholderia， 24.32%）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina， 3.35%）、紅球菌屬（Rhodococcus， 1.68%）、泛菌屬（Pantoea， 1.51%）、unclassified_ f__Microbacteriaceae（1.02%）和其他（others， 12.70%）；緩釋肥C 處理下，甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的相對(duì)豐度大小順序依次為：雷弗松氏菌屬（Leifsonia， 26.23%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，26.02%）、假單胞菌屬（Pseudomonas， 1.87%）、費(fèi)氏丙酸桿菌屬（Cutibacterium， 1.75%）、泛菌屬（Pantoea， 1.48%）、馬賽菌屬（Massilia， 1.40%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas， 1.32%）、紅球菌屬（ Rhodococcus， 1.24% ）、norank_f__SC-I-84（ 1.19%）、norank_f__Neisseriaceae （ 1.08%）、norank_f__JG30-KF-AS9 （ 1.07%）、芽孢桿菌屬（Bacillus， 1.05%）和其他（others， 28.66%）；緩釋肥D 處理下，甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的相對(duì)豐度大小順序依次為：假單胞菌屬（Pseudomonas，28.88%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia， 18.47%）、泛菌屬（Pantoea， 4.72%）、芽孢桿菌屬（Bacillus， 3.33%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas， 2.83%）、雷弗松氏菌屬（Leifsonia， 2.32%）、勞爾氏菌屬（Ralstonia，1.85%）、紅球菌屬（Rhodococcus， 1.84%）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina， 1.76%）、鞘氨醇單胞菌屬（ Sphingomonas， 1.49% ）、費(fèi)氏丙酸桿菌屬（Cutibacterium， 1.20%）、腸桿菌屬（Enterobacter，1.16%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus， 1.12%）和其他（others， 25.20%）；緩釋肥E 處理下，甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的相對(duì)豐度大小順序依次為：雷弗松氏菌屬（Leifsonia， 68.95%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，5.17%）、克勞斯氏菌屬（Cloacibacterium，2.66%）、勞爾氏菌屬（Ralstonia， 2.33%）、unclassified_f__Microbacteriaceae（1.81%）、假單胞菌屬（Pseudomonas， 1.07%）和其他（others， 12.20%）；緩釋肥F 處理下，甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的相對(duì)豐度占比大小順序依次為：泛菌屬（Pantoea，27.98%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia， 12.47%）、勞爾氏菌屬（ Ralstonia， 8.40%）、紅球菌屬（Rhodococcus，6.70%）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina， 3.54%）、unclassified_f__Burkholderiaceae（3.27%）、異樣根瘤菌屬（ Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium， 2.76%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，2.12% ）、類芽孢桿菌屬（ Paenibacillus，2.02%）、費(fèi)氏丙酸桿菌屬（Cutibacterium， 1.57%）、芽孢桿菌屬（Bacillus， 1.32%）、Corynebacterium_1（1.30%）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium， 1.19%）和其他（others， 21.42%）。

草螺菌屬（Herbaspirillum）是CK 處理下甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；生孢噬纖維菌屬（Sporocytophaga）和纖維弧菌屬（Cellvibrio）是緩釋肥A 處理下甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；緩釋肥B 處理下甘蔗植株莖部無特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；norank_f__SC- I-84、norank_f__Neisseriaceae、norank_f__JG30- KF-AS9 和馬賽菌屬（Massilia）是緩釋肥C 處理下甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；短波單胞菌屬（Brevundimonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）是緩釋肥D 處理下甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；克勞斯氏菌屬（Cloacibacterium）是緩釋肥E 處理下甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；unclassified_f__Burkholderiaceae、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、異樣根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）、Corynebacterium_1、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）是緩釋肥F 處理下甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬。

另一方面，與CK 處理相比，雖然不同緩釋肥處理均不同程度地降低了雷弗松氏菌屬（Leifsonia）與unclassified_f__Microbacteriaceae屬內(nèi)生細(xì)菌的相對(duì)豐度，但也不同程度地增加了其他優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的數(shù)量。

2.3 施用不同配方甘蔗專用緩釋肥甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌LEfSe 分析

物種進(jìn)化分支圖從內(nèi)圈到外圈依次展示了樣本群落中從門到屬的所有等級(jí)關(guān)系，以及各分類單元在不同模式間的差異情況。通過LDA 值分布柱狀圖（篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，LDA score>2.0），可以發(fā)現(xiàn)不同施肥處理下的主要細(xì)菌類群。由圖4 可知，門分類水平，7 個(gè)不同施肥處理下甘蔗植株莖部均未發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門類；屬分類水平，勞爾氏菌屬（Ralstonia）細(xì)菌是緩釋肥F 處理下甘蔗植株莖部具有顯著優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌屬；unclassified_f__Microbacteriaceae 細(xì)菌是CK 處理下甘蔗植株莖部具有顯著優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌屬；此外，其他緩釋肥處理下，甘蔗植株莖部均未發(fā)現(xiàn)具有顯著優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌屬。

2.4 施用不同配方甘蔗專用緩釋肥甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌Venn 分析

由Venn 圖（圖5）可知，在屬分類水平上，6 種不同配方緩釋肥配方（A～F）和CK 處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌屬的總數(shù)量分別為187、212、358、275、233、253、285 個(gè)；其中，共有的內(nèi)生細(xì)菌屬數(shù)量為84 個(gè)，特有的內(nèi)生細(xì)菌屬數(shù)量分別為18、11、59、38、16、20、18 個(gè)；在種分類水平上，6 種不同緩釋肥配方（A～F）和CK處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌種的總數(shù)量分別為254、290、520、405、332、358、424 個(gè)，其中，7 種不同施肥處理下甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌共有的菌種為103 個(gè)，特有的內(nèi)生細(xì)菌種分別為29、18、105、64、24、37、41 個(gè)。

上述結(jié)果表明，與CK 相比，無論是屬或種分類水平，除緩釋肥C 處理外，其余緩釋肥處理均不同程度地降低了甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌屬、種分類水平的數(shù)量，說明緩釋肥C 處理有助于提升甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌屬、種分類水平數(shù)量。

2.5 Network 網(wǎng)絡(luò)分析

在門分類水平上，選取豐度前十的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門計(jì)算Spearman 系數(shù)繪制網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），反映不同施肥處理下甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌門之間的相互作用。由圖6 可知， 芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和Dependentiae 門內(nèi)生細(xì)菌，與其他門類內(nèi)生細(xì)菌之間聯(lián)系密切；其中，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）內(nèi)生細(xì)菌與變形菌門（Proteobacteria）、Dependentiae、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和厚壁菌門（Firmicutes）內(nèi)生細(xì)菌之間呈正相關(guān)，與放線菌門（Actinobacteria）內(nèi)生細(xì)菌之間呈負(fù)相關(guān)；Dependentiae 門內(nèi)生細(xì)菌與變形菌門（Proteobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria） 和綠彎菌門（Chloroflexi）內(nèi)生細(xì)菌之間呈正相關(guān)，但與放線菌門（Actinobacteria）呈負(fù)相關(guān)；此外，放線菌門（Actinobacteria）內(nèi)生細(xì)菌還與變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）呈負(fù)相關(guān)。

2.6 功能預(yù)測(cè)分析

BugBase 是一個(gè)可以識(shí)別微生物組樣本中存在的高水平表型，并能夠進(jìn)行表型預(yù)測(cè)的微生物組分析工具?；贐ugBase 分析發(fā)現(xiàn)，不同配方緩釋肥處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌表型包括：兼性厭氧性（facultatively anaerobic）、厭氧性（anaerobic）、形成生物膜（forms biofilms）、移動(dòng)元件（contains mobile elements）、革蘭氏陽性（gram positive）、潛在致病性（potentially pathogenic）、需氧性（aerobic）、革蘭氏陰性（gramnegative）和脅迫耐受（stress tolerant）等九大類（圖7）。與CK 相比，除緩釋肥A 處理外，其余緩釋肥處理下革蘭氏陽性（Gram positive）和兼性厭氧性（facultatively anaerobic）細(xì)菌豐度占比均不同程度地低于CK 處理；此外，除緩釋肥A處理外，其余緩釋肥處理下，革蘭氏陰性（gramnegative ）、需氧性（ aerobic ）、潛在致病性（potentially pathogenic）、脅迫耐受（stress tolerant）移動(dòng)元件（contains mobile elements）、形成生物膜（forms biofilms）、厭氧性（anaerobic）等細(xì)菌豐度均不同程度地高于常規(guī)施肥（CK）處理。

但采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組比較，以及使用FDR 對(duì)P 值進(jìn)行校正，然后使用Tukey-kramer 進(jìn)行Post-hoc 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，上述9 類不同表型細(xì)菌豐度占比在不同施肥處理中均不存在顯著差異。

另一方面，比對(duì)KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，不同緩釋肥和常規(guī)施肥處理下，甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的一級(jí)功能層共有6 類生物代謝通路，分別為：細(xì)胞過程（ cellular processes ）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、人類疾?。╤uman diseases）、代謝（metabolism）和有機(jī)系統(tǒng)（organismal systems）。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組比較，結(jié)果顯示，與CK 相比，6 類代謝通路豐度在7 種不同施肥處理間均無顯著差異（圖8A）。此外，不同緩釋肥和常規(guī)施肥處理下甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌基因二級(jí)功能層主要由發(fā)育（development）、細(xì)胞群落—真核生物（cellular community - eukaryotes）、信號(hào)分子與相互作用（signaling molecules and interaction）、細(xì)胞活性（cell motility）和核苷酸代謝（nucleotidemetabolism ） 等46 個(gè)子功能組成。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組比較，結(jié)果顯示，與CK 相比，46 類代謝通路豐度在7 種不同施肥處理間亦均無顯著差異（圖8B）。這一現(xiàn)象表明，雖然不同緩釋肥處理一定程度上改變了甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的功能，但并沒有導(dǎo)致甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌主體功能發(fā)生顯著變化。

3 討論

微生物是生態(tài)系統(tǒng)中功能活躍，開發(fā)潛力最大、最寶貴、最豐富的生物資源庫[25]。根際微生物與作物健康密切相關(guān)，其群落結(jié)構(gòu)的變化將直接影響到作物的生長，而內(nèi)生細(xì)菌除了具有防控病害發(fā)生的功能之外，還具有促進(jìn)植物生長的作用[22]。已有研究證實(shí)，無論是根際或內(nèi)生微生物，群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越豐富時(shí)，對(duì)抗病原菌的綜合能力越強(qiáng)[26-27]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理能不同程度地改變甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性[1]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，不同配方緩釋肥處理同樣不同程度地改變了甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和豐富度，其中緩釋肥C 處理的提升效果最顯著。

在門分類水平上，放線菌門（Actinobacteria），變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）均為不同施肥處理共有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門類；與常規(guī)施肥相比，不同配方緩釋肥處理均不同程度地增加了優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門類數(shù)量，其中緩釋肥C和F 處理的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門類數(shù)量最多。已有研究已證實(shí)，植物內(nèi)生放線菌不僅具有拮抗宿主植物病原菌的作用，而且可以產(chǎn)生植物激素和鐵載體，進(jìn)而促進(jìn)宿主植物的生長。此外，植物內(nèi)生放線菌還可以侵染宿主植物的根，形成根瘤并進(jìn)行生物固氮[22， 28]。表明不同配方緩釋肥處理并不會(huì)導(dǎo)致具有促生功能的放線菌門細(xì)菌缺失。

在屬分類水平上，與CK 相比，不同配方緩釋肥處理均不同程度地增加了甘蔗植株莖部優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的數(shù)量，其中緩釋肥C、D、F 處理增加數(shù)量最多；草螺菌屬（Herbaspirillum）是CK處理下甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；生孢噬纖維菌屬（Sporocytophaga）和纖維弧菌屬（Cellvibrio）是緩釋肥A 處理甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；緩釋肥B 處理甘蔗植株莖部無特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；norank_f__SC-I-84、norank_f__Neisseriaceae、norank_f__JG30-KF-AS9和馬賽菌屬（Massilia）是緩釋肥C 處理甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；短波單胞菌屬（Brevundimonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）是緩釋肥D 處理甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；克勞斯氏菌屬（Cloacibacterium）是緩釋肥E 處理甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬； unclassified_f__Burkholderiaceae、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、異樣根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）、Corynebacterium_1 和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）是緩釋肥F 處理甘蔗植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬。

草螺菌屬（Herbaspirillum）屬于革蘭氏陰性β-變形菌群[29]，大多數(shù)草螺菌具有固氮或產(chǎn)生植物激素的功能[30]；生孢噬纖維菌屬（Sporocytophaga）和纖維弧菌屬（Cellvibrio）都是纖維素降解菌[31-32]，其中生孢噬纖維菌能高效降解纖維素，同時(shí)還能生產(chǎn)多糖等生物活性物質(zhì)[32]；馬賽菌屬（Massilia）具有土壤修復(fù)和改良（防治土傳病害和殺滅線蟲、耐受多種重金屬、降解多環(huán)芳烴菲和氯乙酰胺類除草劑、溶磷功能）；產(chǎn)酶功能（甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶等多糖水解酶）；產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（紫色桿菌素和聚羥基烷酸酯）等功能和作用[33]；谷青等[34]研究發(fā)現(xiàn)，短波單胞菌屬能夠降解微囊藻毒素； 類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）具有固氮[35]、產(chǎn)脂肪酶[36]和甲殼素酶[37]等功能；金黃桿菌屬（Chryseobacterium）具有降解鄰苯二甲酸二丁酯類化合物的功能，在生物修復(fù)方面具有良好的應(yīng)用前景[38]。上述結(jié)果表明，不同配方緩釋肥處理，均有助于甘蔗植株莖部富集更多有益功能的內(nèi)生細(xì)菌屬類，從而有助于促進(jìn)甘蔗植株生長和提高植株抗性。

另外，不同配方緩釋肥處理甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌基因一級(jí)功能層和二級(jí)功能層代謝通路與常規(guī)施肥之間均無顯著差異。表明不同緩釋肥處理雖然改變了甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成，但并沒有顯著改變甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的主體功能。基于BugBase 表型預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn)，除緩釋肥A 處理外，其余不同配方緩釋肥處理（B～F）的甘蔗植株莖部脅迫耐受（stress tolerant）、生物膜形成（forms biofilms）等功能細(xì)菌豐度均高于CK；與之相反常規(guī)施肥甘蔗植株莖部兼性厭氧性（facultatively anaerobic）功能細(xì)菌豐度高于緩釋肥處理（B～F）。研究結(jié)果表明，除緩釋肥A 處理外，其余配方緩釋肥處理均有助于提升甘蔗植株的抗逆能力。

綜上所述，與CK 相比，施用添加長效劑（235 g/t）以及增效劑（3、18 g/t）的緩釋肥處理有助于顯著提高甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌多樣性，而施用不同配方緩釋肥均未顯著提升甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的豐富度；同時(shí)，除添加長效劑（150 g/t）的緩釋肥B 處理外，其余緩釋肥處理甘蔗植株莖部均富集了各自特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，雖然施用緩釋肥未顯著改變甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌的主體功能，但大部分緩釋肥處理（B～F）均有助于提升甘蔗植株的抗逆能力。其中，基于甘蔗植株莖部內(nèi)生細(xì)菌群落組成與功能而言，添加了長效劑（235 g/t）的緩釋肥C 處理對(duì)甘蔗植株具有最佳的促生和抗逆效果。