張玉琴　胡靜　尉繼強(qiáng)　葉全　劉剛　丁建國　張華德　王同勇　朱海波

關(guān)鍵詞：根際促生細(xì)菌：甘薯：幼苗生長；連作障礙：溶磷作用

中圖分類號：S531.01 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2023） 03-0051-07

甘薯（Ipomoea batatas L.）是我國重要的糧食、飼料以及工業(yè)原料作物之一，也逐漸成為一種新型能源作物，其產(chǎn)量的穩(wěn)步增長對相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。然而，由于多種原因，山東丘陵地區(qū)的甘薯產(chǎn)量往往較低，其中，最重要因素為多年連作導(dǎo)致的土壤肥力下降、土傳病害頻發(fā)等。Ali等研究表明，不適當(dāng)?shù)母髦贫葧M(jìn)一步加劇土壤肥力問題，導(dǎo)致土壤過度沖刷、養(yǎng)分淋失以及土壤結(jié)構(gòu)破壞。而向土壤中添加特定有益微生物類群，能夠有效改善寄主根際微生態(tài)環(huán)境，提高山地土壤質(zhì)量，有望實(shí)現(xiàn)甘薯的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。

國內(nèi)外研究表明，有益微生物能夠直接調(diào)控植物生長發(fā)育過程中的激素代謝、基因表達(dá)以及功能酶活性，同時改善寄主根際的微生態(tài)環(huán)境，提高其抵抗生物與非生物脅迫的能力，有效增加作物產(chǎn)量。根據(jù)微生物存在部位以及與寄主的互作形式，微生物被分為葉圍微生物、根際微生物、內(nèi)生菌三大類。相比于內(nèi)生性微生物，根際微生物可以有效定殖于土壤生態(tài)位點(diǎn)，對于解決土壤帶來的栽培生產(chǎn)問題有著極佳效果。目前，有關(guān)根際有益微生物促進(jìn)甘薯增產(chǎn)提質(zhì)的研究較少，且相關(guān)研究一般局限于固氮細(xì)菌、溶磷細(xì)菌以及叢枝菌根真菌的作用。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacens）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常見的根際有益細(xì)菌，可以提高土壤酶活性，協(xié)調(diào)土壤養(yǎng)分，誘導(dǎo)寄主植物相關(guān)抗病促生基因（PR1 a/c、H1N1、ctd1、ERF2等）表達(dá)，在促進(jìn)寄主作物生長以及病害防治方面具有廣泛應(yīng)用。本研究以分離自多年連作太子參健康土壤中的解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03為對象，利用體外平板試驗(yàn)對其促生能力進(jìn)行分析評價，并以甘薯為供試作物研究這兩株根際細(xì)菌對其幼苗生長前期的促生作用，分析兩株根際細(xì)菌對土壤理化性質(zhì)、土壤主要酶活性以及甘薯主要抗病促生基因的調(diào)控表現(xiàn)，以期為C05與G03在甘薯上的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年在青島市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所進(jìn)行。供試甘薯品種為煙薯25。供試根際微生物分離菌株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacens）C05與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）G03從多年連作太子參的健康土壤中分離得到，其對植物根系具有一定親和性，田間存活率高。

1.2根際細(xì)菌分離株的體外促生指標(biāo)測定

1.2.1產(chǎn)鐵載體能力測 定將解淀粉芽孢桿菌C05（下文簡稱C05）與枯草芽孢桿菌G03（下文簡稱G03）的菌液（OD₆₀₀=0.5，10μL）接種于CAS瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)結(jié)束后，測定平板中橙色區(qū)域以及菌落直徑，計算鐵載體產(chǎn)生指數(shù)（SPI）。計算公式如下：

SPI=（橙色區(qū)域+菌落直徑）／菌落直徑。

1.2.2無機(jī)磷酸鹽溶解能力測定 將C05與G03（OD600=0.5，10μL）接種于含0.5%磷酸三鈣的Pikovskaya（PVK）瓊脂培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)7d。培養(yǎng)結(jié)束后，通過計算溶解指數(shù)（SI）來定量評價分離株溶解無機(jī)磷酸鹽能力。計算公式如下：

SI=（透明光暈+菌落直徑）／菌落直徑。

1.2.3產(chǎn)蛋白酶活性測定 將C05與G03（OD60=0.5，10μL）接種于含1%脫脂奶粉的CYE瓊脂平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)Sd。培養(yǎng)結(jié)束后，計算產(chǎn)蛋白酶活性指數(shù)（PAI），進(jìn)而定量評價兩株根際細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶活性能力。計算公式如下：

PAI=（透明區(qū)域+菌落直徑）／菌落直徑。

1.2.4合成生長素（IAA）能力測定 將20μLC05與G03細(xì)菌懸浮液（OD600= 0.5）接種于含10mmol/L色氨酸的20 mL LB培養(yǎng)基中，并于28μ、150 r/min條件下孵育72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取1mL培養(yǎng)上清液（6000×g，10min）與100 mL正磷酸（10mmol/L）、2mL Salkowski試劑混合，在室溫下充分反應(yīng)20 min，隨后于530 nm波長下測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行絕對定量。

1.3盆栽促生試驗(yàn)設(shè)計及有關(guān)指標(biāo)測定

選擇甘薯作為寄主植物在溫室中進(jìn)行盆栽促生試驗(yàn)。栽培盆規(guī)格：底徑9.5cm，上口徑14.0cm，高11.2cm。盆中土壤取自青島市即墨區(qū)鰲山衛(wèi)鎮(zhèn)孫家白廟村田間，其基礎(chǔ)理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)8.5 mg/g、總氮1.2 mg/g、硝態(tài)氮8.7μg/g、銨態(tài)氮7.9μg/g、速效磷27.0μg/g、速效鉀105.7μg/g，電導(dǎo)率218.6μS/cm，pH值6.5。于4月20日每盆栽種3株。

試驗(yàn)設(shè)計：將C05與G03接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，之后離心（5000×g，5 min），收集菌體并重新溶解于無菌蒸餾水中得細(xì)菌懸浮液。將40 mL細(xì)菌懸浮液（OD₆₀₀=0.5）于4月30日接種在甘薯幼苗（苗齡20天）根際，對照加入等量水（CK）。在整個試驗(yàn)期間，保證充足水分供應(yīng)，養(yǎng)護(hù)溫度為25～28℃，相對濕度為70%，光照循環(huán)為12 h。

接菌后10、20 d進(jìn)行甘薯農(nóng)藝性狀（主蔓長、有效葉數(shù)、最大葉面積）調(diào)查，并收取甘薯莖葉、根系、土壤樣品，測定地上部鮮重與干重、地下部鮮重與干重、葉片葉綠素含量，土壤主要酶活性、理化性質(zhì)由江蘇博研生物科技有限公司測定。每處理60株甘薯，重復(fù)3次。

1.4基因相對表達(dá)量測定

利用RNA提取試劑盒Plant Total RNA Kit（北京莊盟生物）提取葉片總RNA，借助瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度與完整性，并利用反轉(zhuǎn)錄酶HiScript Ⅲ RT SuperMix（南京諾唯贊）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行基因相對表達(dá)量的測定。擴(kuò)增體系包括：DNA 1.0μL、SYBR qPCR Master Mix10.0μL，上、下游引物各0.4μL，無菌水補(bǔ)足20μL。采用2^-△△Ct法計算基因PR1 a/c、HIN1、ctd1與ERF2的相對表達(dá)量。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel與Origin軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 20.0軟件Duncans法進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1根際細(xì)菌體外促生能力分析評價

由平板試驗(yàn)結(jié)果（表1）可以看出，解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03均具有無機(jī)磷酸鹽增溶作用，SI值分別為4.46、2.97，表明C05溶解磷酸三鈣能力顯著強(qiáng)于G03。兩株根際細(xì)菌都具有產(chǎn)鐵載體與蛋白酶的能力，與溶磷作用類似，C05能力更強(qiáng)。C05產(chǎn)IAA濃度為49.72μg/mL，顯著高于G03（22.37μg/mL）。表明相對于G03，C05具有更高的促生潛力。

2.2盆栽甘薯根際細(xì)菌的促生效果與評價

如表2所示，與CK相比，根際接種解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03后20 d，薯苗主蔓長、最大葉面積、地上部鮮重和干重、地下部干重和葉片葉綠素a、b含量均顯著提高，以C05的促生效果最為顯著。10 d時，接種C05與G03的薯苗地下部鮮重與CK無顯著差異，20 d時接種C05的地下部鮮重顯著高于CK，這表明C05對甘薯塊莖生長有較大促進(jìn)作用，但這種作用是緩慢推進(jìn)。甘薯幼苗葉片中葉綠素a、b含量存在顯著差異，表明C05與G03能夠通過改善葉片的光合作用來促進(jìn)甘薯生長發(fā)育。

2.3根際細(xì)菌對土壤理化性質(zhì)的影響

與CK相比，接種解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03后盆栽甘薯土壤的總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀含量均顯著提高，而土壤電導(dǎo)率與pH值無顯著差異（表3）。其中，20 d時，接種C05土壤總氮（2.35mg/g）、硝態(tài)氮（23.17μg/g）、銨態(tài)氮（25.77μg/g）、有機(jī)質(zhì)（25.76mg/g）、速效磷（43.97μg/g）、速效鉀（225.3μg/g）含量均最高。表明，接種C05與G03可以改善土壤主要理化性質(zhì)，促進(jìn)總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等氮素釋放，利于甘薯幼苗快速生長。

2.4根際細(xì)菌對土壤酶活性的影響

由圖1A看出，根際接種兩株細(xì)菌均能顯著提高土壤脲酶活性，最優(yōu)處理為C05，10、20 d時較CK分別增加56.33%、121.77%，3個處理間差異顯著。土壤蔗糖酶可以將蔗糖水解成相應(yīng)單糖而被植物體吸收，其酶促作用產(chǎn)物與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量息息相關(guān)。如圖1B所示，10 d時，接種C05與G03的土壤蔗糖酶活性均顯著高于CK，20 d時C05土壤蔗糖酶活性（604 U/g）進(jìn)一步提高，且顯著高于G03（437 U/g）與CK（264U/g），與CK相比，10、20 d時接種C05與G03的土壤酸性磷酸酶活性均顯著提升（圖1C）。過氧化氫酶是土壤微生物代謝的重要酶類，在H202清除系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，與土壤有機(jī)質(zhì)含量、土壤肥力因子密切相關(guān)。接種C05與G03的土壤過氧化氫酶活性顯著增強(qiáng)，20 d時C05該酶活性為CK的2.28倍（圖1D）。表明，甘薯根際接種C05與G03后土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶活性均顯著增強(qiáng)，可以更加快速地水解轉(zhuǎn)化土壤中的主要營養(yǎng)成分，提高土壤肥力。

2.5根際細(xì)菌對甘薯葉片主要抗病、生長基因表達(dá)的影響

如圖2所示，接種解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03對甘薯葉片抗病基因PR1 a/c表達(dá)量沒有顯著影響，但可以顯著激活H1N1基因的表達(dá)，有利于提高甘薯幼苗的系統(tǒng)抗性，促進(jìn)其健康生長。與CK相比，接種C05、G03均顯著提高葉片促生基因ctd1、ERF2的相對表達(dá)量，其中，20 d時C05對兩個促生基因的激活達(dá)到最大值。說明，根際接種C05與G03之后，甘薯葉片中特定的抗病基因、促生基因可以被充分激活，為幼苗前期快速生長提供必要保障。

2.6土壤理化性質(zhì)與土壤酶活性的相關(guān)性分析

為了確定土壤理化性質(zhì)與土壤酶活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，對兩者的主要指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。接菌后10 d時土壤總氮含量與銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05，下同）；土壤硝態(tài)氮含量與土壤脲酶活性呈顯著正相關(guān)，這一相關(guān)性與土壤脲酶作用有關(guān)，因?yàn)橥寥离迕缚梢运饽蛩兀a(chǎn)生氨與碳酸，而土壤脲酶活性完全可以反映土壤氮素狀況；土壤有機(jī)質(zhì)含量與土壤過氧化氫酶活性呈顯著正相關(guān)，表明土壤有機(jī)質(zhì)含量的提高，與土壤微生物代謝密切相關(guān)（圖3A）。

如圖3B所示，接菌后20 d時土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶活性與pH值呈顯著正相關(guān)，表明土壤特定微生物代謝的改變，可以影響土壤主要酶活性，進(jìn)而有利于酸化土壤的改良；土壤硝態(tài)氮含量與脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶活性，土壤氨態(tài)氮含量與過氧化氫酶活性均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)關(guān)系。表明，土壤理化性質(zhì)的變化主要由土壤酶活性轉(zhuǎn)變所引起，而土壤酶活性高低又與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與演變密不可分。

3討論與結(jié)論

本研究通過平板試驗(yàn)分析了分離自連作太子參土壤的解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03的體外促生能力。首先，兩株根際細(xì)菌均具有優(yōu)異的轉(zhuǎn)化無機(jī)磷酸鹽能力，這與前人研究得出的其能高效持續(xù)地為寄主提供可溶性磷元素、促進(jìn)植物生長發(fā)育的結(jié)論一致。根際有益細(xì)菌另一種關(guān)鍵營養(yǎng)獲取方式主要依靠鐵載體進(jìn)行，鐵載體是由微生物產(chǎn)生的鐵螯合化合物，可有效減少植物缺鐵現(xiàn)象的出現(xiàn)。除了為寄主提供螯合鐵，根際有益細(xì)菌產(chǎn)生的鐵載體在植物中還具有多重作用，比如誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性、清除和隔離病原體中的鐵進(jìn)而控制病害發(fā)生。而本研究結(jié)果表明，C05與G03都可以產(chǎn)生鐵載體。生長素是一類重要的植物激素，能夠調(diào)節(jié)植物發(fā)育和生長。根際有益細(xì)菌可以產(chǎn)生一種自然形式的生長素IAA，其在細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用，促進(jìn)植物根系、莖葉的伸長。本研究發(fā)現(xiàn)兩株根際細(xì)菌菌株都能夠從色氨酸合成IAA，進(jìn)而顯著促進(jìn)寄主植物生長，而這一發(fā)現(xiàn)與前人研究結(jié)論一致。因此，甘薯幼苗主要農(nóng)藝性狀的改善可能得益于兩株根際細(xì)菌產(chǎn)生的IAA。除了促進(jìn)宿主生長外，IAA還與植物的多種發(fā)育過程有關(guān)，比如頂端優(yōu)勢、向地性感應(yīng)、繁殖等，這使得IAA成為最關(guān)鍵的植物激素之一。

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，甘薯幼苗根際接種C05與G03細(xì)菌后，主蔓長、最大葉面積、地上部鮮重和干重、地下部干重和葉片葉綠素a、b含量均顯著提升，從而有效促進(jìn)植株前期生長，利于培育壯苗。為了驗(yàn)證這兩株根際有益細(xì)菌對土壤的改良效果，測定了盆栽甘薯土壤的主要理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，C05與G03均可以促進(jìn)總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮釋放，改善土壤營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高連作土壤的可耕作性。相較于CK，接種根際細(xì)菌土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶活性均增強(qiáng)，土壤養(yǎng)分供給有所提高。本研究中，接種C05與G03甘薯葉片的抗病基因H1N1和促生基因ctd1、ERF2表達(dá)量均顯著升高，表明兩株根際細(xì)菌可以誘導(dǎo)植株體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)甘薯自身免疫，促進(jìn)其健康生長發(fā)育。而相關(guān)性熱圖結(jié)果顯示，多個土壤理化指標(biāo)與土壤酶活性表現(xiàn)出顯著正相關(guān)關(guān)系，這可能與土壤微生物類群的特定演變有關(guān)。

綜上看出，分離自連作太子參土壤的解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03具有體外促生能力，對甘薯幼苗有促生作用，可有效改善土壤營養(yǎng)構(gòu)成，提高土壤主要酶的活性，誘導(dǎo)甘薯抗病、促生基因的表達(dá)，增強(qiáng)寄主系統(tǒng)抗病性。利用植物根際細(xì)菌是綠色環(huán)保的生物防治方式，加大根際有益細(xì)菌的鑒定挖掘，可為微生物菌肥的開發(fā)利用提供更優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。