梁偉 劉鴻 鄒克興 陳義昌 王小東 孫會(huì)忠 蔡聯(lián)合 蘇贊 胡逸超

摘要 本文以醇化煙葉為材料，采用平板分離技術(shù)分離培養(yǎng)出26株細(xì)菌活體純培養(yǎng)物，依次編號(hào)為GXZY1～GXZY26，純化菌株通過牛奶瓊脂培養(yǎng)基的鑒別培養(yǎng)，初篩出GXZY3、GXZY7和GXZY9 3株具有明顯的水解圈，初步定性為產(chǎn)蛋白酶功能細(xì)菌。對(duì)GXZY3、GXZY7和GXZY9菌株連續(xù)60 h的連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3株菌發(fā)酵液中的蛋白酶活性均呈現(xiàn)先高后低的變化規(guī)律，酶活性的最大值均出現(xiàn)在發(fā)酵后18 h；GXZY9菌株發(fā)酵液中的酶活性持續(xù)保持高位，最大值達(dá)到18.2 U/g，且酶活性下降幅度最小，而GXZY3和GXZY7則在發(fā)酵36 h后持續(xù)下降到較低水平。對(duì)菌株GXZY13的多相鑒定結(jié)果表明，其隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），命名為Bacillus subtilis GXZY9。菌株GXZY9對(duì)烤煙蛋白質(zhì)含量具有較強(qiáng)的調(diào)控功能，可作為煙葉醇化微生物制劑開發(fā)的良好備用菌株。

關(guān)鍵詞 煙葉醇化；附生菌；蛋白酶；篩選

中圖分類號(hào) S47? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）03-0021-05

Isolation， Screening and Activity Evaluation of Protease Producing

Bacteria from Alcoholized Tobacco Leaves

LIANG Wei1? ?LIU Hong1? ?ZOU Kexing1? ?CHEN Yichang1? ?WANG Xiaodong2? ? SUN Huizhong2

CAI Lianhe1? ?SU Zan1? ?HU Yichao1

（1Technical Center of Guangxi China Tobacco Industry Co.， Ltd.， Nanning Guangxi 530000;

2College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang Henan 471023）

Abstract Twenty-six strains of pure bacteria in vivo were isolated and cultured from alcoholized tobacco leaf by plate separation technology， which were numbered GXZY1-GXZY26. The purified strains were identified by milk AGAR medium and GXZY3， GXZY7 and GXZY9 had obvious hydrolytic circles， and were preliminarily identified as protease-producing functional bacteria. The protease activity of GXZY3， GXZY7 and GXZY9 strains in the fermentation broth of GXZY3， GXZY7 and GXZY9 strains increased at first and then decreased， and the maximum value of enzyme activity occurred at 18 h after fermentation. The enzyme activity in the fermentation broth of GXZY9 strain remained high， reaching the maximum value of 18.2 U/g， and the enzyme activity decreased the least， while the enzyme activity of GXZY3 and GXZY7 continued to decrease to a low level after 36 h of fermentation. Polyphase identification of strain GXZY13 showed that it belonged to Bacillus subtilis GXZY9. Strain GXZY9 had strong regulation function on protein content of flue-cured tobacco and could be used as a good standby strain for the development of tobacco mellow microbial preparation.

Keywords tobacco mellow; pick the fungus; protease; screening

煙葉醇化是卷煙生產(chǎn)過程中的重要一環(huán)，與卷煙風(fēng)格和特色形成關(guān)系密切，其核心原理是通過醇化可以消除煙葉天然存在的刺激性大、青雜氣重、煙氣粗糙、余味澀口、香氣顯露不足的品質(zhì)缺陷[1-3]。大量研究證明[2-5]，煙葉醇化是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，醇化風(fēng)格和特色的形成受多種因素的影響，醇化過程中煙葉化學(xué)成分和其他物理化學(xué)特征的分化和定型，對(duì)微生物及其產(chǎn)生的酶發(fā)揮了極其關(guān)鍵的作用，主要是因?yàn)槲⑸锊粌H可以通過自身的生命活動(dòng)作用于煙葉醇化過程，還可通過其代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應(yīng)，促進(jìn)煙葉中生物大分子的轉(zhuǎn)化，同時(shí)微生物因素對(duì)烤煙醇化周期也有深刻影響。影響烤煙醇化的微生物酶也是一個(gè)復(fù)雜的體系，多酚氧化酶（polyphenol oxidase）、蛋白酶（protease）、淀粉酶（amylase）、蔗糖酶（sucrase）、纖維素酶（cellulase）等均參與其中[6-8]。蛋白質(zhì)含量過高的煙葉在燃燒吸食時(shí)會(huì)有較為強(qiáng)烈的燒焦羽毛臭味，而且煙葉的燃燒性也相應(yīng)變差，故蛋白質(zhì)含量是煙葉品質(zhì)和吸食者健康評(píng)價(jià)的重要影響因素，因而蛋白質(zhì)含量調(diào)控就成了煙葉醇化工藝和技術(shù)的重要組成部分，微生物降解蛋白質(zhì)含量的機(jī)理是將大分子蛋白質(zhì)降解為氨基酸等小分子物質(zhì)，從而降低煙葉蛋白質(zhì)含量，但不同的煙葉品種、存儲(chǔ)條件和工藝類型，調(diào)控醇化煙葉蛋白質(zhì)含量的功能微生物種類也存在差異。

在此背景下，本文結(jié)合廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司卷煙生產(chǎn)過程中醇化周期偏長的實(shí)際現(xiàn)狀，著眼特定卷煙生產(chǎn)原料，開展了醇化煙葉附生益生菌的分離、篩選、鑒定和活性評(píng)估等研究工作，以期為煙葉醇化提供更加具有針對(duì)性的益生菌遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 材料

煙葉樣品于2022年2月取自廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司煙葉倉庫，煙葉品種是K326?？莶菅挎邨U菌標(biāo)準(zhǔn)株（Bacillus subtilis ATCC 6633）由河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院特色生物資源開發(fā)與利用試驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

煙葉水浸提物固體分離培養(yǎng)基：20 g煙葉樣品加入400 mL蒸餾水煮沸提取30 min，冷卻后2層紗布過濾得煙葉沸水浸提液。以分別添加10%、30%和50%的水浸提液代替 LB培養(yǎng)基成分，制備煙葉浸提物培養(yǎng)基（30%煙葉水浸提液固體培養(yǎng)基成分及配制：300 mL煙葉水浸提液，700 mL蒸餾水，牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，瓊脂1.5 g，pH 自然，120 ℃高壓蒸汽滅菌30 min）。

牛奶瓊脂鑒別培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，脫脂奶粉15 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1 000 mL蒸餾水，葡萄糖20 g，醇化煙葉粉碎樣品（37 ℃烘干6 h，過40目篩）10 g。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨7 g，酵母提取物3 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，pH自然。

1.3 醇化煙葉附生細(xì)菌的分離純化

取醇化煙葉粉碎樣品（過40目篩）5 g裝入滅菌三角瓶，加入100 mL無菌水，震蕩5 min，靜置5 min后，分別取50、100、150 ?L不同體積上清液涂布于固體分離培養(yǎng)基，每個(gè)體積涂6個(gè)平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取菌落連續(xù)進(jìn)行3次平板劃線純化，并將純化菌株甘油-20 ℃保存。

1.4 純化菌株產(chǎn)蛋白酶活性初篩

將純化菌株接種于牛奶瓊脂鑒別培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，具有透明圈者定性為具有產(chǎn)蛋白酶活性目標(biāo)菌株。

1.5 純化菌株產(chǎn)蛋白酶活性復(fù)篩

首先將目標(biāo)待測菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)（OD600 控制在 0.8～1.2），以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min搖床連續(xù)培養(yǎng)60 h，期間每隔6 h取樣1次，測定發(fā)酵液蛋白酶活力。設(shè)3次重復(fù)，以不接種作為對(duì)照。蛋白酶活力采用文獻(xiàn)方法進(jìn)行[9-10]。

1.6 菌株的多相分類鑒定

將測定菌株于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，制樣進(jìn)行光鏡和掃描電鏡觀察[11]。生理生化指標(biāo)的測定方法參考文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行。

測定菌株16S rDNA分析操作方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行，采用MEGA7的Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇化煙葉附生細(xì)菌分離結(jié)果

醇化煙葉粉碎樣品稀釋涂布煙葉水浸提物固體分離培養(yǎng)基平板中，28 ℃培養(yǎng)2～3 d后，平板上形成特征典型的菌落（圖1）。挑取菌落進(jìn)行3次劃線純化，共獲得26株細(xì)菌活體純培養(yǎng)物，依次編號(hào)為GXZY1～GXZY26。15 %甘油-20 ℃保種備用。

2.2 產(chǎn)蛋白酶活性菌株初篩

分別將獲得的31株純化菌株點(diǎn)接于牛奶瓊脂鑒別培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。結(jié)果表明，共有3株菌形成了明顯的水解圈，分別是GXZY3、GXZY7和GXZY9（圖2），其中GXZY9的抑菌圈直徑最大，達(dá)到24 mm，初步將其定性為具有生防活性功能菌株。

2.3 產(chǎn)蛋白酶活性菌株發(fā)酵液酶活性

如圖3所示，GXZY3、GXZY7和GXZY9 3株菌經(jīng)過連續(xù)60 h的發(fā)酵，發(fā)酵液中的蛋白酶活性與對(duì)照相比存在顯著變化，總體而言，3株菌均呈現(xiàn)先高后低的變化規(guī)律，酶活性的最大值均出現(xiàn)在發(fā)酵18 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)；3株菌相比較而言，GXZY9菌株發(fā)酵液中酶活性最大，為18.2 U/g，且酶活性下降幅度最小，酶活性維持高位的時(shí)間最長，GXZY3和GXZY7則在發(fā)酵36 h后持續(xù)下降。以上結(jié)果說明3株產(chǎn)蛋白菌株對(duì)蛋白質(zhì)存在不同的調(diào)節(jié)能力，可作為后期煙葉醇化調(diào)控劑開發(fā)功能菌株選擇的依據(jù)。

2.4 產(chǎn)蛋白酶菌株GXZY9的鑒定

選取在發(fā)酵過程中酶活性下降幅度最小的GXZY9進(jìn)行多相分類學(xué)鑒定。結(jié)果顯示，形態(tài)特征：將菌株GXZY9在LB培養(yǎng)基形成的菌落觀察可見，菌落表面粗糙，有皺褶，不透明，微黃，無莢膜，有鞭毛（圖4A）；革蘭氏陽性，芽孢（0.5～0.8）μm×（1～1.4）μm，位于菌體中央或稍偏（圖4B）；大小為（0.5～0.7）μm×（1.5～2.5）μm（圖4C）。

根據(jù)形態(tài)特征推測GXZY9可能為枯草芽孢桿菌，故擬以枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為參比菌株，對(duì)GXZY9菌株進(jìn)行部分生理生化特征測定，測定項(xiàng)目及結(jié)果見表1。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》（第九版）對(duì)枯草芽孢桿菌的描述[16]，GXZY9菌株與標(biāo)準(zhǔn)株基本吻合，為GXZY9菌株的系統(tǒng)歸屬提供了證據(jù)支撐。

對(duì)菌株GXZY9的16S rDNA分子鑒定表明：菌株GXZY9的16S rDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果為1 514 bp，序列提交GenBank獲得登錄號(hào)OL913106。在GenBank比對(duì)獲得同源性較高序列并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果表明，菌株GXZY9與Bacillus subtilis JCL16聚為一支，相似度達(dá)到99%。結(jié)合菌株GXZY9的形態(tài)、生理生化和分子鑒定結(jié)果，將其鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株，暫命名為Bacillus subtilis GXZY9。

3 討論

煙葉醇化過程是一個(gè)復(fù)雜的生化變化過程，尤其是有機(jī)大分子化合物在微生物繁殖和生理代謝過程中發(fā)生的降解和含量上的消長[1，2，5，17]。本研究采用改良的牛肉膏蛋白胨細(xì)菌分離培養(yǎng)基從醇化煙葉中分離得到26株附生細(xì)菌活體純培養(yǎng)物，醇化煙葉上有細(xì)菌的滋生，如果不斷優(yōu)化和改變分離培養(yǎng)基類型，分離到更多種類的附生細(xì)菌是可能的。

本研究以獲取煙葉醇化菌株為主要目的，根據(jù)煙葉醇化過程中微生物種群數(shù)量由高到低的一般規(guī)律，選取了醇化6個(gè)月的倉儲(chǔ)醇化煙葉材料作為分離附生菌的實(shí)驗(yàn)材料，為了增加分離可培養(yǎng)細(xì)菌的檢出概率，采用了煙葉浸提物改良分離培養(yǎng)基，這對(duì)經(jīng)過高溫烘烤的醇化煙葉實(shí)驗(yàn)材料是有益的，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，烤煙附生菌種群的絕多數(shù)量與土壤、水體等環(huán)境的微生物種群多樣性相比相差甚遠(yuǎn)[2，4，5，18]。

本研究篩選出的3株產(chǎn)蛋白酶菌株在煙葉發(fā)酵過程中均表現(xiàn)出一定的蛋白酶活性，說明煙葉發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化相對(duì)活躍，相比較而言GXZY9菌株的蛋白酶活性高位活性持續(xù)時(shí)間最長，后期下降幅度小，說明對(duì)發(fā)酵體系中具有更強(qiáng)的調(diào)控能力，開發(fā)應(yīng)用潛力也最大。

GXZY9菌株經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析的多相分類鑒定，確定為芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY1109—2006微生物菌種安全四級(jí)管理，枯草芽孢桿菌屬于第一級(jí)免做毒理學(xué)試驗(yàn)菌種，可直接投入使用，這有利于GXZY9菌株的快速開發(fā)應(yīng)用[19]。

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（責(zé)編：王 菁）

基金項(xiàng)目 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技計(jì)劃項(xiàng)目（功能微生物提升真龍卷煙原料醇化質(zhì)量技術(shù)研究，GXZYCX2021B002）。

作者簡介 梁偉（1979—），男，河南輝縣人，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，從事煙草原料應(yīng)用研究工作。

收稿日期 2022-04-26