UPLC-MS/MS法測定土壤中氯霉素類抗生素及其代謝物

米旭蕾 王可 李志偉

摘 要：針對土壤中抗生素污染日益嚴重的問題，為了促進土壤中抗生素監(jiān)測技術(shù)體系及相關(guān)標準的完善，建立了一種QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的分析方法。土壤樣品用10 mL 3%（體積分數(shù)，下同）氨化乙腈提取，0.2 g PSA和0.2 g無水MgSO4凈化，流動相為甲醇-水（1∶1，體積比，下同），ZORBAX SB-Aq（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色譜柱，質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI）、正/負離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。結(jié)果表明，4種分析物在0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.999，檢出限（LOD）為0.01～0.06 μg/kg，定量限（LOQ）為0.05～0.19 μg/kg，在3個加標水平（0.4，8.0，40.0 μg/kg）下，平均回收率為87.23%～108.57%，相對標準偏差（RSD，n=5）為0.36%～6.55%。該方法準確、簡便、高效、靈敏，適用于土壤中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的同步檢測，可為相關(guān)部門制定相關(guān)行業(yè)標準、規(guī)范提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：化學(xué)分析；QuEChERS；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；土壤；氯霉素類抗生素及其代謝物

Determination of chloramphenicol antibiotics and their metabolite in soil by UPLC-MS/MS

MI Xulei¹， WANG Ke²， LI Zhiwei¹

（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China; 2.Shijiazhuang Technology Innovation Center for Chemical Poison Detection and Risk Early Warning， Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention， Shijiazhuang， Hebei 050011， China）

Abstract：Aiming at the problem that antibiotic pollution in soil is becoming more and more serions， in order to

promote the improvement of antibiotic monitoring technical system and related standards， a method of QuEChERS combined with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. The soil samples were extracted with 10 mL 3% ammoniated acetonitrile （V/V）， purified with 0.2 g PSA and 0.2 g anhydrous MgSO4， the mobile phase was methanol-water （1∶1， V/V）， the UPLC column used in the experiment was ZORBAX SB-Aq （2.1 mm×150 mm，3.5 μm）， the ion source was electrospray ion source（ESI） with positive/negative ion scanning， and the detection method was multiple reaction monitoring（MRM）.The results indicates that the linear relationships of the four analytes are good in the range of 0.1～200 ng/mL， with a correlation coefficients（r） higher than 0.999， the limits of detection （LOD） and the limits of quantitation（LOQ） are 0.01～0.06 μg/kg and 0.05～0.19 μg/kg， respectively; the average recoveries are 87.23%～108.57% at three spiked levels（0.4， 8.0，40.0 μg/kg）， the relative standard deviations （RSDs， n=5） are 0.36%～6.55%.The method is accurate， simple， efficient and sensitive， which is suitable for the simultaneous determination of chloramphenicol， sulfoxamycin， flufenicol and its metabolite florfenicol amine in soil， and provides data basis for setting relevant standards and regulations.

Keywords：chemical analysis; QuEChERS; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; soil; chloramphenicol antibiotics and their metabolite

氯霉素類抗生素又稱酰胺醇類抗生素，因具有廉價、高效、廣譜等特點，在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛使用^［1］，主要包括氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟苯尼考（FF）^［2］。CAP殘留會抑制人體骨髓的造血功能，引起顆粒性白細胞缺乏癥等疾病^［3］。TAP和FF是CAP的新型同類藥物，具有良好的抗菌效果和安全性能。但人類若長期攝入TAP，會對人體的造血功能產(chǎn)生不可逆的抑制作用。TAP結(jié)構(gòu)中的羥基被氟原子取代得到FF，其具有良好的抗菌譜和活性^［4］。FF代謝產(chǎn)物復(fù)雜，其中，氟苯尼考胺（FFA）是FF的主要代謝物，也是FF在動物體內(nèi)的殘留標志物^［5］。土壤環(huán)境是人類賴以生存的環(huán)境之一，人類常常通過施用含有抗生素的糞便和廢水導(dǎo)致大量抗生素進入土壤，造成土壤污染，對微生物、動植物及人類健康產(chǎn)生不同程度的毒性作用。氯霉素類抗生素的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在自然界中可長期存在^［6］，而中國尚未規(guī)定氯霉素類抗生素及其代謝物在環(huán)境中的最大殘留限量。因此，建立一種檢測土壤中氯霉素類抗生素及其代謝物的分析方法十分必要。

近年來，針對氯霉素類抗生素及其代謝物的檢測方法主要包括氣相色譜法（GC）^［7］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）^［8］、免疫層析法（ICA）^［9］、液相色譜法（LC）^［10］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）^［11-12］等。其中，GC法和GC-MS法適用于分析易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的小分子有機化合物，應(yīng)用范圍較窄^［13］；ICA法準確度較差，有時會出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果^［14］；LC法靈敏度較低，無法滿足痕量測定的要求^［13］；而LC-MS/MS法具有分離能力強、靈敏度高、定性定量準確等優(yōu)點，適用于復(fù)雜基質(zhì)中多種抗生素的痕量分析^［15］。國內(nèi)外關(guān)于該類藥物的檢測主要集中在牛奶^［16］、蜂蜜^［17］、魚肉^［18］、畜禽產(chǎn)品^［19］等動物源性食品，而土壤基質(zhì)更為復(fù)雜，關(guān)于氯霉素類抗生素及其代謝物在土壤基質(zhì)中殘留檢測的報道相對較少。胡鈺等^［20］采用固相萃取前處理技術(shù)檢測農(nóng)田土壤中氯霉素和氟苯尼考，回收率僅為46.9%～146.0%。曾芳等^［6］利用LC測定土壤中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，首先，用乙酸乙酯提取目標物；然后，用正己烷進行脫脂；最后，用固相萃取柱進行富集、凈化，該檢測方法操作步驟繁瑣，分析時間長。劉虹等^［21］采用固相萃取技術(shù)檢測土壤中氯霉素，該方法的檢出限較高，為23 μg/kg。目前，關(guān)于同時檢測土壤基質(zhì)中3種氯霉素類抗生素及其代謝物的方法未見報道。因此，建立操作簡便、靈敏、準確、可靠的氯霉素類抗生素及其代謝物的分析新方法，具有十分重要的意義。

QuEChERS技術(shù)在2003年由德國斯圖加特CVUA實驗室的ANASTASSIADES等首次提出，隨后由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究院化學(xué)家PERESTRELO等確證^［22］。該技術(shù)具有高通量、操作簡便、成本低廉、溶劑消耗少等優(yōu)點^［23］，在檢測水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留方面應(yīng)用較為廣泛，但在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用相對較少。李常雄等^［24］建立了QuEChERS技術(shù)方法，同時測定水果和蔬菜中4種雙酰肼類農(nóng)藥殘留；韓梅等^［25］建立了一種基于QuEChERS前處理技術(shù)快速檢測蔬菜中48種農(nóng)藥殘留的分析方法；DINH等^［26］開發(fā)了QuEChERS法測定魚和蝦中27種獸藥殘留的檢測新方法。用QuEChERS技術(shù)開展土壤中獸藥的監(jiān)測需要對提取劑、凈化劑種類和凈化劑用量等進行優(yōu)化，以得到更好的提取和凈化效果。本研究通過對質(zhì)譜參數(shù)、色譜條件、提取劑種類、凈化方式等進行優(yōu)化，以改進的QuEChERS作為前處理技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），建立同時測定土壤中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的新方法，以期為開展土壤樣品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留監(jiān)測及風(fēng)險評價提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIE XExion-TRIPLE QUAD 5500型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國 AB SCIEX公司提供；VXMNAL型渦旋振蕩器，美國 OHAUS 公司提供；CR21N型高速冷凍離心機，日本日立公司提供；AE240型電子天平，瑞士 Mettler Toledo 公司提供；EVAP-12型氮吹儀，美國 Organomation 公司提供。

CAP，純度為98.5%，Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司提供；TAP，F(xiàn)F，純度為99.9%，Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司提供；FFA，純度為99.2%，上海安譜實驗科技股份有限公司提供；甲酸，乙酸銨（色譜純），美國 Dikma 公司提供；乙腈（色譜純），德國 Merck 公司提供；甲醇，色譜純，美國 Fisher 公司提供；N-丙基乙二胺（PSA），美國 Dikma 公司提供；C18，40～50 μm，美國 Welch 公司提供；無水MgSO4，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司提供；Milli-Q超純水機，美國 Millipore 公司提供。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取一定量的分析物標準品，用甲醇溶解定容至10 mL，配制成1 mg/mL的各標準儲備液，于－20 ℃冰箱中儲存。分別準確移取100 μL各標準儲備液，用甲醇稀釋至1 mL，配制成100 μg/mL的各標準中間液。分別準確移取100 μL各標準中間液，用甲醇稀釋至10 mL，配制成1 μg/mL的混合標準溶液。采用土壤空白基質(zhì)液逐級稀釋混合標準溶液，配制成0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 ng/mL，體積均為500 μL的系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品采集與前處理

1.3.1 土壤樣品采集

土壤樣品按照《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（HJ/T 166—2004）的要求進行采集、運輸和保存。采集0～20 cm的表層土壤，除去碎石、雜草和植物根莖等雜物，裝于封口袋中。在運輸過程中密封、避光。將樣品運送到實驗室后，自然風(fēng)干，粉碎，過0.425 mm（40目）篩，裝于封口袋中，于4 ℃避光保存。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5.0 g（±0.01 g）土壤樣品于50 mL離心管中，加10 mL 3%氨化乙腈，渦旋混勻20 s、振蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min。準確移取7 mL上清液，置于含有0.2 g無水MgSO4和0.2 g PSA的15 mL離心管中，渦旋20 s，以10 000 r/min離心5 min。準確移取5 mL上清液，在40 ℃下氮吹干，用1 mL甲醇-水（1∶1）復(fù)溶，過0.20 μm濾膜，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

Aligent ZORBAX SB-Aq（2.1 mm × 150 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-水（50∶50）；進樣量：3 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描模式：正/負離子掃描模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：40 psi（1 psi相當于6 894.757 Pa，下同）；霧化氣壓力：50 psi；輔助氣壓力：50 psi。4種分析物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

分別配制50 ng/mL的4種分析物標準溶液，采用針泵進樣。由于CAP，TAP和FF含有電負性較高的鹵原子和羥基，因此，在負離子模式下具有更高的靈敏度；而FFA含有氨基，因此，在正離子模式下具有更高的靈敏度^［27］，所以實驗在正/負離子模式下進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。首先，在一級質(zhì)譜（Q1 MS）掃描模式下，獲得每種分析物的母離子；然后，在二級質(zhì)譜（Product ion，MS2）掃描模式下，獲得其碎片離子；最后，將母離子和碎片離子組成檢測離子對，在MRM模式下分別對碰撞能（CE）和去簇電壓（DP）進行優(yōu)化，使各碎片離子獲得最佳響應(yīng)。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇

有研究表明，C18柱適用于氯霉素類抗生素殘留的分析^［28］。因此，實驗比較了Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 50 mm，1.8 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）、Agilent ZORBAX SB-Aq（2.1 mm × 150 mm，3.5 μm）3種色譜柱對4種目標物的分離效果。結(jié)果顯示，與另外2個色譜柱相比，在ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱上，4種分析物響應(yīng)偏低（見圖1）；在ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱上，氟苯尼考胺出現(xiàn)分裂峰（見圖2）；在ZORBAX SB-Aq色譜柱上，4種分析物具有較好的響應(yīng)和峰形。因此，選擇ZORBAX SB-Aq色譜柱進行分析。

2.2.2 流動相優(yōu)化

流動相對目標物的響應(yīng)、峰形和保留時間存在一定影響。首先，比較了當以純水為水相，甲醇、乙腈為有機相時對4種目標物分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當有機相為乙腈時，F(xiàn)FA峰形較寬，且FF和CAP未能分開；當有機相為甲醇時，4種目標物具有較好的峰形、響應(yīng)值和分離度，故選擇甲醇作為有機相。以甲醇為有機相，比較了以純水、0.1%甲酸水溶液、含2 mmol/L乙酸銨的水溶液為水相時對色譜效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水中加入甲酸或乙酸銨后，4種目標物的響應(yīng)值均降低，故選擇純水作為水相。實驗進一步對甲醇和水的體積比進行優(yōu)化，比較了當甲醇和水的體積比分別為40∶60，50∶50和60∶40時對4種目標物分離效果的影響。發(fā)現(xiàn)當體積比為40∶60時，分析時間較長；當體積比為60∶40時，TAP和FF未分開；當體積比為50∶50時，4種目標物的峰形和分離度均較好。綜上，實驗最終采用體積比為50∶50的甲醇和水等度洗脫。在最佳色譜柱、甲醇水體積比1∶1流動相條件下，得到如圖3所示的4種分析物的混合標準溶液色譜圖。

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取劑的優(yōu)化

根據(jù)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，實驗考察了以乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取劑時，對4種分析物回收率的影響，結(jié)果如圖4所示。乙酸乙酯對土壤中TAP和FFA的提取效果較差，回收率僅為14.66%和1.11%，其余2種分析物的回收率均達到60%以上；當用二氯甲烷提取時，僅FF的回收率在60%以上；當用乙腈提取時，F(xiàn)FA的回收率偏低，僅為2.57%，其余3種分析物的回收率較高，在60.62%～91.30%之間，所以選擇乙腈作為提取當劑。由于FFA是弱堿性化合物，在較高的pH值下具有更好的溶解性^［29］，因此，實驗分別考察了1%，2%，3%，4% 4種不同體積比的氨化乙腈對4種分析物回收率的影響。結(jié)果顯示，隨著氨水濃度的增加，F(xiàn)FA的回收率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當使用3%氨化乙腈時，CAP，TAP，F(xiàn)F和FFA的回收率最好，分別為104.88%，92.69%，101.94%和103.60%，最終選擇3%氨化乙腈作為提取劑。

2.3.2 凈化方式的優(yōu)化

PSA，C18等是QuEChERS前處理中常用的吸附劑。由于土壤中主要含有色素、脂肪等雜質(zhì)，PSA可通過陰離子交換的方式，對土壤中多種極性有機酸、脂肪酸、糖類物質(zhì)、親脂性色素等雜質(zhì)有較好的吸附能力^［30-31］。分別比較PSA，C18，PSA加入無水MgSO4凈化劑對4種分析物回收率的影響，結(jié)果如圖5所示。當以C18作為凈化劑時，F(xiàn)F的回收率僅為45.33%，可能由于C18對FF有吸附作用；當使用PSA凈化時，4種分析物的回收率均在70%以上；PSA加入無水MgSO4后4種分析物的回收率為99.71%～106.90%，回收率較好，這是由于無水MgSO4可去除有機溶劑中殘留的水分，而且在吸水放熱的過程中促進了目標物的溶出^［32］。而且使用PSA加入無水MgSO4凈化后，回收率優(yōu)于PSA凈化時的回收率（81.50%～92.34%），故最終選擇將PSA加入無水MgSO4作為凈化劑。

實驗進一步對無水MgSO4和PSA的用量進行考察。首先，固定無水MgSO4的用量為0.20 g，考察PSA用量（0.05，0.10，0.20，0.30 g）對4種分析物回收率的影響。結(jié)果如圖6所示。首先，在不同PSA用量下，4種分析物的回收率隨著PSA用量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當PSA用量達到0.20 g時，4種分析物的回收率較好，在93.20%～102.37%之間，所以選擇0.20 g PSA凈化；然后，當PSA用量為0.20 g時，考察無水MgSO4的用量（0.10，0.20，0.30 g）對4種分析物回收率的影響，結(jié)果如圖7所示。隨著無水MgSO4用量的增加，TAP和FFA的回收率先升高后降低，CAP的回收率逐漸降低，當無水MgSO4用量為0.20 g時，4種分析物均有較好的回收率。綜上所述，選用0.20 g PSA加入0.20 g無水MgSO4進行凈化，4種分析物的回收率總體最好，為86.68%～101.03%。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

使用電噴霧離子源的主要限制因素是基質(zhì)中共提取物質(zhì)對分析物的信號抑制或增強^［33］?；|(zhì)效應(yīng)（ME，matrix effect）是指分析物的離子化受共提取物的影響，從而導(dǎo)致分析物的響應(yīng)值出現(xiàn)增強或減弱的現(xiàn)象^［34］。實驗分別用土壤空白基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┲苽錁藴是€，按照式（1）計算ME值。當ME值在80%～120%之間時，認為基質(zhì)效應(yīng)較小，可忽略；ME值小于80%，認為有較強的基質(zhì)抑制作用^［35］。計算得到4種分析物的基質(zhì)效應(yīng)分別為42.63%，49.91%，50.37%和53.56%，說明具有較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配標準曲線，以精準定量，減小誤差。

ME=（基質(zhì)匹配標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率）×100%。（1）

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限

對“1.2”部分配制的不同濃度的混合標準工作溶液進行檢測，以各分析物質(zhì)量濃度（X，ng/mL）和峰面積（Y）為線性方程的橫坐標和縱坐標，得到相應(yīng)的線性方程和相關(guān)系數(shù)（r）。用3倍信噪比和10倍信噪比計算各分析物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。如表2所示，4種分析物的相關(guān)系數(shù)（r）均在0.999以上，表明方法線性關(guān)系良好。LOD為0.01～0.06 μg/kg，LOQ為0.05～0.19 μg/kg，方法靈敏度較高。

2.5.2 加標回收率與精密度

取空白土壤樣品，加標回收試驗分別在0.4，8.0，40.0 μg/kg下進行，每個量平行測定5次。如表3所示，4種分析物的平均加標回收率在87.23%～108.57%之間，RSD值在0.36%～6.55%之間，表明建立的方法準確度和精密度良好，能夠滿足對土壤中4種分析物進行定量分析的要求。

2.6 實際樣品測定

采集12份養(yǎng)殖場土壤、11份菜地土壤共23份樣品，在最佳優(yōu)化條件下對上述樣品進行檢測。其中，在1份養(yǎng)殖場和2份菜地的土壤中均檢測到FFA，質(zhì)量濃度分別為6.34，4.12和14.92 μg/kg，另外，20份樣品中4種分析物均低于各自的檢出限。

3 結(jié) 語

本研究建立了一種QuEChES結(jié)合UPLC-MS/MS同步測定土壤中CAP，TAP，F(xiàn)F及其代謝物FFA的新方法。通過對質(zhì)譜參數(shù)、色譜條件和前處理條件的優(yōu)化，確立了最佳檢測條件：樣品經(jīng)3%氨化乙腈提取，0.2 g PSA加入0.2 g無水MgSO4凈化，以甲醇-水（1∶1）為流動相，經(jīng)ZORBAX SB-Aq色譜柱分離，采用電噴霧離子源正/負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測。方法學(xué)驗證表明，本方法具有準確、簡便、高效、靈敏等優(yōu)點，適用于大批量土壤樣品中3種氯霉素類抗生素及其代謝物的定性定量分析。所建立的方法對開展土壤中氯霉素類抗生素及其代謝物的監(jiān)測、評價提供了技術(shù)支持，同時為相關(guān)部門制定相關(guān)行業(yè)標準、規(guī)范提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。本研究僅建立了土壤中氯霉素類抗生素及其代謝物的檢測方法，今后需完善該方法在水等其他基質(zhì)中的應(yīng)用效果。

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