祁山顏 朱峰 王繼春 田成麗 王東元 歐玉蘋 劉曉梅 李莉 姜兆遠(yuǎn)

摘要 枯草芽胞桿菌GB519是一株具有廣譜抑菌活性的生防菌株。本研究利用綠色熒光蛋白標(biāo)記的菌株GB519-GFP處理水稻種子、根和葉片，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察和抗生素平板回收檢測的方法，探究其在水稻根莖葉中的定殖動態(tài)。結(jié)果顯示：經(jīng)GB519-GFP發(fā)酵液處理水稻種子、根和葉片后，菌株均可內(nèi)生定殖于植株的表皮、皮層和維管束中，表明其可在水稻植株內(nèi)遷移和定殖。GB519-GFP在處理部位的定殖量通常呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢，非處理部位3～5 d后即可檢測到標(biāo)記菌株。浸種處理，3 d后在幼芽中可檢測到標(biāo)記菌株;20 d后在根中的菌量最多，達(dá)5.7×105 cfu/g。灌根處理，1 d后根中菌量為5.4×105 cfu/g;20 d后根、莖和葉中菌量均達(dá)到最大值;處理80 d后，根中定殖數(shù)量仍達(dá)1.9×105 cfu/g。葉面噴施處理，1 d后葉片菌量為4.2×105 cfu/g;20 d后葉片菌量達(dá)4.4×105 cfu/g。不同處理方法在各部位的定殖量幾乎均在處理20 d后達(dá)到峰值。采用葉面噴施GB519對稻瘟病穗頸瘟的田間防效達(dá)73.9%，表明葉面噴施GB519能夠起到防控稻瘟病的作用。本研究為使用枯草芽胞桿菌GB519防控水稻稻瘟病提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 枯草芽胞桿菌GB519;?GFP;?定殖動態(tài);?稻瘟病;?防效

中圖分類號： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021719

Abstract Bacillus subtilis GB519 displays antimicrobial activity in a broad spectrum. In this study， the GFP-labeled strain， GB519-GFP was used to explore its colonization dynamics in rice plants via both the laser confocal microscope observation and antibiotic plate recovery. The strain GB519-GFP could colonize the epidermis， cortex and vascular bundle after seed-soaking， root-irrigating or foliar-spray with the fermentation broth. These results indicated that it could migrate and colonize in rice plants. In general， the colonization quantity of GB519-GFP first decreased and then increased in the treated part， and it could be detected in the untreated part after 3-5 days. The GFP-labeled strain was detected in the bud three days after seed-soaking and the maximum amount of colonization reached 5.7×105 cfu/g in the root after 20 d. The amount of colonization in the root was 5.4×105 cfu/g one day after root-irrigating. The amount reached the maximum value in the root， stem and leaf after 20 d， and remained at 1.9×105 cfu/g in the root after 80 d. The colonization was 4.2×105 cfu/g in the leaves one day after foliar-spray， and reached 4.4×105 cfu/g after 20 d. The amounts of colonization in different tissues reached the peak 20 d after treated. The control efficacy of GB519 against rice blast was 73.9% in the field by foliar-spray. It indicated that foliar spraying with GB519 could play a role in preventing rice blast. This study provides a guidance for the control of rice blast by B.subtilis GB519.

Key words Bacillus subtilis GB519;?GFP;?colonization dynamics;?rice blast;?control efficacy

隨著人們生活品質(zhì)的提高，對糧食質(zhì)量愈發(fā)關(guān)注，綠色有機(jī)食品成為大眾的廣泛需求，而環(huán)保、低毒的生物防治方法成為生產(chǎn)綠色有機(jī)食品的重要措施［1］?？莶菅堪麠U菌Bacillus subtilis是研究與應(yīng)用較為廣泛的生防菌之一，能促進(jìn)植物生長和防治植物病害，提高養(yǎng)分利用率和改變植物激素水平，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和觸發(fā)誘導(dǎo)抗性等［2］。同時，枯草芽胞桿菌具有持久高效的活性，能夠形成抗逆性強(qiáng)的芽胞，有利于制劑的研發(fā)和保存，是生防菌劑開發(fā)利用的重要組成部分［3］。

生防菌能否定殖決定了其生防效果，研究生防菌的定殖模式不僅可以揭示它的微生態(tài)特征，也有助于評估其適應(yīng)性和活性的穩(wěn)定性［4］。生防菌防效的優(yōu)劣與其能否定殖及定殖能力強(qiáng)弱呈正相關(guān)［5-6］。因此，科學(xué)地施用生防菌，對提高其在植物中的定殖能力和防效具有重要意義［7］。利用抗生素標(biāo)記菌株是探究生防菌定殖的最早方法，但該標(biāo)記法不能區(qū)分出抗性相同的其他微生物［8］。綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的菌株因其易于檢測、靈敏度高、穩(wěn)定性好且可以精準(zhǔn)定位，相關(guān)的研究越來越多［9］。Liu等［10］研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌定殖位點(diǎn)較集中，主要聚集在水稻表皮、外皮層和維管束中。沙月霞等［11］將貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis E69菌懸液噴施于水稻，發(fā)現(xiàn)其能夠從表皮進(jìn)入水稻， 向薄壁組織和中央維管束擴(kuò)展。

東北大米晶瑩剔透、入口潤甜，深受國人喜愛，但北方水稻稻瘟病防控中化學(xué)藥劑仍然占主導(dǎo)地位，低毒綠色防控替代品一直在探索中。水稻稻瘟病菌通常以菌絲體或分生孢子在感病稻草上越冬，次年在溫濕度適宜時產(chǎn)生分生孢子，分生孢子借風(fēng)傳播侵染植株葉片和穗頸部位，發(fā)生稻瘟病造成危害。GB519菌株是從吉林省稻區(qū)分離獲得的一株枯草芽胞桿菌，經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)對稻瘟病等多種植物病原菌表現(xiàn)出抑菌效果［12-13］。為了為實(shí)踐應(yīng)用提供有效的使用方式，本研究檢測了綠色熒光蛋白標(biāo)記的菌株GB519-GFP在不同處理水稻植株中的定殖動態(tài)，明確其定殖能力;并結(jié)合稻瘟病菌侵染時期和方式，采用葉面噴施GB519開展防控水稻稻瘟病試驗(yàn)。本研究可為闡釋枯草芽胞桿菌 GB519 在水稻植株中的定殖規(guī)律和指導(dǎo)防控提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis GB519和GB519-GFP由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害綜合防控團(tuán)隊(duì)篩選、鑒定、構(gòu)建并保存。供試水稻品種為‘吉粳88，種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，補(bǔ)水至1 000 mL，調(diào)pH 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基在LB基礎(chǔ)上添加20.0 g瓊脂粉。

對照藥劑：75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（WG），由拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司生產(chǎn)。

1.2?菌株GB519/GB519-GFP發(fā)酵液制備

超低溫保存的GB519和GB519-GFP菌株經(jīng)平板活化后，挑取單菌落于50 mL的LB培養(yǎng)液中，37℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，再按5%接種量接種到LB培養(yǎng)液中（150 mL/500 mL三角瓶），30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后備用。

1.3?激光共聚焦顯微觀察與菌株GB519-GFP的菌落數(shù)量測定

將水稻目標(biāo)組織制成臨時切片，用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）在波長488 nm處觀察菌株GB519-GFP在水稻組織中的定殖位點(diǎn)和擴(kuò)展遷移方向。

菌株GB519-GFP的菌落數(shù)量測定參考Sorokan等［14］的方法。樣品先在75%乙醇中浸泡3 min，再用蒸餾水沖洗3～5次，分別稱取1 g根、莖、葉片組織，用預(yù)冷研缽研磨成勻漿，并加入100 mL無菌水，稀釋10倍后，分別吸取100 μL稀釋液均勻涂布于LB平板（含5 μg/mL氯霉素），無菌水作為對照，48 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。在激光共聚焦顯微鏡下觀察菌落是否出現(xiàn)綠色熒光，出現(xiàn)綠色熒光的為GB519-GFP菌株。

1.4?菌株GB519-GFP處理在水稻根、莖、葉部的定殖動態(tài)

1.4.1?GB519-GFP浸種處理

根據(jù)Wang等［4］的方法，水稻種子經(jīng)表面消毒后置于濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，30℃催芽40 h至露白。將露白的種子置于新培養(yǎng)的GB519-GFP發(fā)酵液（1×108 cfu/mL）中浸泡24 h后播種于直徑10 cm的營養(yǎng)缽（自然黑土占67%，草炭基質(zhì)占33%）中，每缽播種50粒種子。以培養(yǎng)液浸泡的種子為對照。置于溫室中培養(yǎng)。分別于浸種處理后第1、3、5、7、14、20、30、40、60天和第80天，從每缽中隨機(jī)取5株植株，共25株作為1個重復(fù)，3次重復(fù)。采用非丟棄取樣法，將25株植株的根、莖、葉片組織分別混合后，進(jìn)行激光共聚焦顯微觀察和統(tǒng)計(jì)菌株GB519-GFP的菌落數(shù)量，處理方法同1.3。

1.4.2?GB519-GFP灌根處理

參照楊珍福等［15］的方法。水稻種子經(jīng)表面消毒后播種于直徑10 cm的營養(yǎng)缽（自然黑土占67%，草炭基質(zhì)占33%）中，每缽播種50粒種子。播種14 d后，用GB519-GFP發(fā)酵液（1×108 cfu/mL）灌根處理（5 mL發(fā)酵液/株），以培養(yǎng)液灌根作為對照。分別在處理后第1、3、5、7、14、20、30、40、60天和第80天，采用非丟棄取樣法，將25株植株的根、莖、葉片組織分別混合后，進(jìn)行熒光檢測和涂板檢測菌落數(shù)量，處理方法同1.3。

1.4.3?GB519-GFP噴施葉面處理

參照Sha等［16］的方法，水稻種子經(jīng)表面消毒后，播種于直徑10 cm的營養(yǎng)缽（自然黑土占67%，草炭基質(zhì)占33%）中，每缽播種50粒種子。在播種后45 d，將葉片以下組織及營養(yǎng)缽用保鮮膜包裹，使植株呈倒立狀，再將GB519-GFP發(fā)酵液（1×108 cfu/mL）均勻噴施葉片（20 mL發(fā)酵液/缽），以噴施培養(yǎng)液作為對照。分別在處理后第1、3、5、7、14、20、30、40、60天和第80天，采用非丟棄取樣法，將25株植株的根、莖、葉片組織分別混合后，進(jìn)行熒光檢測和涂板檢測菌落數(shù)量，處理方法同1.3。

1.5?菌株GB519葉面噴施防控稻瘟病

在吉林省梨樹縣試驗(yàn)地連續(xù)2年（2020年和2021年）進(jìn)行田間試驗(yàn)，該地為水稻病害常發(fā)區(qū)。水稻品種為‘吉粳88。設(shè)菌株GB519（1×108 cfu/mL）、75%肟菌·戊唑醇WG （15 g/667 m2）和清水對照3個處理，每667 m2按50 L水量均勻噴霧。小區(qū)處理面積100 m2，每處理5次重復(fù)，小區(qū)隨機(jī)排列。在水稻抽穗前7月25日和齊穗期8月10日各施藥1次。9月中旬調(diào)查穗莖瘟，每小區(qū)5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)20穴，共100穴。穗莖瘟級別參照Meng等［17］的方法，病情指數(shù)和防治效果按下列公式計(jì)算。

病情指數(shù)=∑（各級發(fā)病數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總穗數(shù)×最高級代表值）×100;

防治效果=［（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)）］×100%。

1.6?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用軟件SPSS 26中單因素方差分析檢驗(yàn)處理間是否存在顯著性差異，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。顯著水平設(shè)為α=0.05。

2?結(jié)果與分析

2.1?浸種處理后GB519-GFP在水稻植株中的定殖

GB519-GFP發(fā)酵液浸種處理后1 d，從水稻種子未分化的嫩芽中就可以檢測到明顯的綠色熒光，均勻地分布于表皮和海綿薄壁組織的細(xì)胞間隙中（圖1a）。處理后5、14 d和40 d，從根的表皮、皮層和維管束中可分別檢測到明顯的綠色熒光（圖1b， c， d）。處理后7 d和40 d，從莖和葉中均能檢測到綠色熒光（圖1e， f， g， h），說明浸種處理的標(biāo)記菌株已經(jīng)在不同部位定殖。

菌株GB519-GFP浸種處理后，其在水稻植株中定殖數(shù)量的變化情況如圖2所示。處理后20 d，根中定殖的菌株GB519-GFP的數(shù)量極顯著高于莖和葉中的數(shù)量。處理后3 d，幼芽中檢測到菌落數(shù)量為12.0×105 cfu/g，說明通過浸種處理有大量標(biāo)記菌株進(jìn)入水稻種子中。隨著植株生長發(fā)育，菌株通過遷移擴(kuò)展定殖于新生組織中，7～20 d各部位菌落數(shù)量的變化均趨于平緩。20 d時各部位菌落數(shù)量達(dá)到最高峰，其中根中的含菌量最多，為5.7×105 cfu/g。20～80 d各部位定殖量呈現(xiàn)遞減趨勢，處理后60 d，根中的定殖數(shù)量為0.2×105 cfu/g，莖和葉中未檢測到菌株;80 d在各個部位都沒有檢測到菌株存在。

2.2?灌根處理后GB519-GFP在水稻植株中的定殖

用GB519-GFP發(fā)酵液灌根處理后1 d，僅從根的外表皮細(xì)胞間隙中檢測到綠色熒光（圖3a）;處理后3 d和14 d，從維管束、中柱鞘及內(nèi)皮層中檢測到綠色熒光（圖3b， c）;處理后80 d，從根部仍能檢測到明顯的綠色熒光（圖3d）。處理后7 d和40 d，從莖部檢測到綠色熒光（圖3e， f）。處理后1 d和60 d，葉部的泡狀細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中分別檢測到了綠色熒光（圖3g， h）。說明灌根處理標(biāo)記菌株可定殖于植株各部位。

灌根處理后，GB519-GFP在水稻植株中定殖數(shù)量的變化情況如圖4所示。根中定殖的菌株GB519-GFP的數(shù)量普遍高于莖和葉中的數(shù)量。灌根處理后1 d，從水稻根部可檢測到大量GB519-GFP，菌量達(dá)到5.4×105 cfu/g。處理后5～14 d，在水稻幼苗的根部、莖部和葉部都檢測到GB519-GFP，且菌量接近。處理后20 d，根、莖、葉中定殖的菌落數(shù)量達(dá)到最高峰，分別為8.0×105、3.8×105 cfu/g和4.4×105 cfu/g。20 d后各部位菌株定殖量都逐步下降，到處理后80 d，根中菌落數(shù)量仍可達(dá)1.9×105 cfu/g，而莖葉中含量接近于0。

2.3?葉面噴施處理后GB519-GFP在水稻植株中的定殖

用GB519-GFP發(fā)酵液葉面噴施處理后1 d，在葉表面和表皮中都檢測到較強(qiáng)的綠色熒光，表明菌株通過氣孔和細(xì)微傷口進(jìn)入水稻葉表皮之中，分布于上下表皮細(xì)胞間隙（圖5a）。處理后40 d和60 d葉表皮中檢測到綠色熒光度較強(qiáng)，表明菌株定殖量較大（圖5b， c）。葉面噴施后20 d，從莖部維管束（圖5d），根部表皮、皮層、維管束中都檢測到較強(qiáng)的綠色熒光（圖5e），表明標(biāo)記菌株通過維管束在水稻植株內(nèi)部遷移和擴(kuò)展。而且葉面噴施后80 d，根部仍能檢測到明顯的綠色熒光（圖5f），表明菌株定殖效果較顯著。

葉面噴施處理后，GB519-GFP在水稻植株中定殖數(shù)量的變化如圖6所示。處理后前5 d，葉片中定殖菌量呈現(xiàn)遞減趨勢，而根莖中菌量呈現(xiàn)遞增趨勢：處理后3 d莖中檢測到菌落數(shù)量為0.2×105 cfu/g，處理后5 d根中檢測到菌落數(shù)量為0.7×105 cfu/g。處理后20 d葉中檢測到的菌落數(shù)量達(dá)到最高峰，為4.4×105 cfu/g。葉面噴施處理后，根中出現(xiàn)兩個定殖高峰，分別為處理后14 d和60 d，定殖量分別為6.1×105 cfu/g 和5.2×105 cfu/g。特別是處理后80 d，根中菌量仍達(dá)3.1×105 cfu/g，但莖和葉中均未檢測到標(biāo)記菌株。這一結(jié)果與熒光檢測結(jié)果相同。

2.4?枯草芽胞桿菌GB519對稻瘟病的防治效果

經(jīng)過兩年田間防治稻瘟病處理，枯草芽胞桿菌GB519葉面噴霧處理的病情指數(shù)分別為1.44（2020年）和1.60（2021年），防治效果分別達(dá)到73.9%（2020年）和74.5%（2021年）。同化學(xué)農(nóng)藥75%肟菌·戊唑醇WG防效76.6%（2020年）和75.6%（2021年）相比，防治效果沒有顯著差異（表1）。

3?結(jié)論與討論

為保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高稻米品質(zhì)，減少化學(xué)農(nóng)藥使用與降低殘留，保障農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，越來越多的生防制劑產(chǎn)品應(yīng)用于病害防控。由于枯草芽胞桿菌具有拮抗多種植物病原菌以及促進(jìn)植物生長和提高作物產(chǎn)量的功能，是應(yīng)用最多的菌種，成為生物防治的研究熱點(diǎn)［18］。在研發(fā)新生物農(nóng)藥時，生防菌在作物中的內(nèi)生定殖能力是影響其發(fā)揮作用的主要因子之一，定殖能力的強(qiáng)弱是評價其能否成為生物農(nóng)藥的重要指標(biāo)［19］。本研究結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察和抗生素平板回收檢測的方法，系統(tǒng)研究了GB519-GFP發(fā)酵液處理的水稻種子、根和葉片后，GB519在植株體內(nèi)的定殖動態(tài)，結(jié)果表明菌株可定殖于植株的表皮、皮層、維管束中，揭示其可通過維管束在水稻植株內(nèi)遷移和定殖。

枯草芽胞桿菌不僅可以在植物表面形成一層致密的生物膜，還可以進(jìn)入植物內(nèi)部定殖，起到阻止病原菌侵染、占據(jù)病原菌定殖的空間位點(diǎn)的作用［20-21］。稻瘟病菌主要侵染水稻的葉片、莖、節(jié)和花序等部位，可以通過自然孔口或直接降解角質(zhì)層傷口穿透表皮的方式侵入，占據(jù)皮層細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙［22-23］。菌株GB519-GFP通過植物維管束進(jìn)行擴(kuò)展遷移運(yùn)動。Hao等［24］研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌B96-II發(fā)酵液灌根處理蘆筍Asparagus officinalis時，菌株可以從根部侵入蘆筍體內(nèi)，經(jīng)由維管束由根部向莖部遷移。在本研究中，使用枯草芽胞桿菌GB519-GFP發(fā)酵液灌根和葉面噴施兩種常用手段處理水稻，處理后1 d就可發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株自根表或葉表侵入水稻體內(nèi)，3～5 d后在非處理組織中發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株，分布于各器官表皮、外皮層、維管束等主要定殖位點(diǎn)。本研究證實(shí)了枯草芽胞桿菌GB519能夠定殖于水稻植株根莖葉等部位，推測菌株GB519可能起到阻止病原菌侵入的作用。

Walker等［25］等研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌L-forms作為植物的共生菌在白菜種子萌發(fā)過程中，抑制了隨后接種的灰霉病菌孢子的萌發(fā)，對種子起到了保護(hù)作用。而使用枯草芽胞桿菌GB519發(fā)酵液浸種處理水稻種子后，發(fā)芽后標(biāo)記菌株能定殖于水稻幼苗的各個組織部位，并伴隨幼苗生長分布于所有新生組織中，為水稻種子發(fā)芽后防止病菌侵染提供保護(hù)作用。

生防芽胞桿菌能在多種植物上定殖，定殖量直接影響到防治效果，定殖的時長決定了防治效果的持續(xù)性［26-27］。穆常青等［28］用枯草芽胞桿菌B-332在葉面噴施處理水稻，21 d后葉片表面仍能檢測到1.25×104 cfu/mm2的活菌，對稻瘟病防效為45.23%。Wang等［4］發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌TUBP1在棉花中定殖時長超過45 d，對棉花黃萎病防效為55.21%。何朋杰等［29］在大白菜葉面噴施XF-1-gfp，處理后1 d樣品檢測到了標(biāo)記菌（104 cfu/g），45 d后保持103 cfu/g的菌量。本試驗(yàn)用枯草芽胞桿菌GB519發(fā)酵液進(jìn)行浸種、灌根和葉面處理，通過抗性平板檢測，展示了不同處理根、莖、葉中菌株GB519-GFP的定殖量隨時間的動態(tài)變化情況，結(jié)果顯示不同處理方法GB519-GFP在各部位的定殖量幾乎均在處理后20 d達(dá)到峰值，可為病害防控時間節(jié)點(diǎn)提供參考。在處理后較短時間內(nèi)定殖量達(dá)到峰值，并且在處理后各組織中能持續(xù)檢測到一定數(shù)量的標(biāo)記菌株，表明菌株GB519具有較強(qiáng)定殖能力且防治作用可以維持較長時間。田間防控稻瘟病試驗(yàn)達(dá)到74%以上的防效也證明了枯草芽胞桿菌GB519具有顯著預(yù)防和治療稻瘟病的作用。而且，與之前報道的文獻(xiàn)相比，菌株GB519具有更長的內(nèi)定殖時長和內(nèi)定殖能力。

由不同方式處理后7 d菌株GB519-GFP的定殖量可知，與灌根和浸種處理相比，葉面噴施在水稻葉片中定殖的菌量更多。葉面噴施處理后，根中菌落數(shù)量出現(xiàn)兩個高峰，分別為處理后14 d和60 d，菌落數(shù)量分別為6.1×105 cfu/g和5.2×105 cfu/g。出現(xiàn)兩次菌量高峰可能與環(huán)境的變化有關(guān)，具體的原因需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。第一次高峰可能是由于菌株GB519-GFP對根環(huán)境更適應(yīng)，因而不斷地增殖擴(kuò)大菌體數(shù)量;第二次高峰可能是由于水稻植株已經(jīng)處于生長后期，葉片和莖中的營養(yǎng)逐漸減少不適宜菌株的生長增殖，菌株逐漸由葉和莖中轉(zhuǎn)移到根中生長增殖。植物病害生物防治的成功與否與引入生防菌株的定殖能力強(qiáng)弱有關(guān)，因此葉面噴施的處理方式對水稻稻瘟病的防治效果最佳。本研究為揭示枯草芽胞桿菌GB519的內(nèi)生定殖能力和選擇有效使用方法防控稻瘟病提供了科學(xué)參考。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）