佘小漫 李萍 藍(lán)國兵 于琳 李正剛 湯亞飛 何自福

摘要 茄科雷爾氏菌復(fù)合種侵染引起的青枯病是眾多作物上的毀滅性病害。2020年筆者首次在廣東省東莞市發(fā)現(xiàn)向日葵青枯病，并對其病原菌進(jìn)行了鑒定。室內(nèi)人工接種試驗(yàn)、16S rDNA序列比對和演化型鑒定結(jié)果表明，引起向日葵青枯病的病原菌為假茄科雷爾氏菌Ralstonia pseudosolanacearum。生理生化特性和致病性鑒定結(jié)果表明，分離自向日葵的15株假茄科雷爾氏菌為1號生理小種和生化變種3。egl基因部分序列系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，15株假茄科雷爾氏菌分屬4個序列變種，其中8株菌株為序列變種17，5株菌株為序列變種13，其余2株菌株分別為序列變種14和序列變種54。本文是我國首次報道假茄科雷爾氏菌侵染引起向日葵青枯病。

關(guān)鍵詞 向日葵;?假茄科雷爾氏菌;?致病性;?分子鑒定;?序列變種

中圖分類號： S436.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022031

Abstract Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum species complex （RSSC） is one of the devastating diseases in crop production， seriously reducing the yield of crop. In 2020， sunflower （Helianthus annuus） bacterial wilt was firstly observed in Dongguan city， Guangdong province， and the pathogen of sunflower bacterial wilt was identified. Kochs postulation test， 16S rDNA gene and phylotypes analysis indicated that the pathogen of sunflower bacterial wilt was Ralstonia pseudosolanacearum. Physiological and biochemical characteristics and pathogenicity analysis demonstrated that 15 isolates belong to race 1， biovar 3. Based on results of partial egl gene sequence analysis， 15 isolates were clustered into four egl-sequence type groups， eight of 15 isolates were sequevar 17， five of 15 isolates were sequevar 13， and the other two isolates were sequevar 14 and sequevar 54. This is the first record of sunflower bacterial wilt caused by R.pseudosolanacearum in China.

Key words sunflower;?Ralstonia pseudosolanacearum;?pathogenicity;?molecular identification;?sequevar

由茄科雷爾氏菌復(fù)合種Ralstonia solanacearum species complex（RSSC）侵染引起的作物青枯病是熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)最重要、最具毀滅性的細(xì)菌性病害之一。茄科雷爾氏菌復(fù)合種的寄主范圍廣泛，可侵染54科的200多種植物［1］。對于該復(fù)合種，截至目前有多個種下分類方案，包括基于寄主范圍的5個生理小種（race）［2-4］，基于對3種雙糖和3種己醇的氧化利用情況的6個生化變種（biovar）［4-7］，根據(jù)分子系統(tǒng)進(jìn)化分析的4個地理分支［8-14］，利用演化型特異性復(fù)合PCR分析的4個演化型以及根據(jù)菌株egl基因序列同源性分析的序列變種［15］。在上述分類方案中，演化型與地理分支兩種分類結(jié)果基本一致，演化型Ⅰ和Ⅱ菌株分別對應(yīng)亞洲來源菌株和美洲來源菌株，演化型Ⅲ包含來自非洲的菌株，演化型Ⅳ包含來自印度尼西亞的菌株以及茄科雷爾氏菌的近緣種蒲桃雷爾氏菌Ralstonia syzygii和引起香蕉血液病的BDB菌。2011年，Safni等［16］根據(jù)基因組分析結(jié)果建議將茄科雷爾氏菌復(fù)合種劃分為3個種。此后，Prior等2016年結(jié)合茄科雷爾氏菌復(fù)合種菌株的表型、基因組比對和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，進(jìn)一步將茄科雷爾氏菌復(fù)合種劃分為3個種，即假茄科雷爾氏菌R.pseudosolanacearum （含演化型Ⅰ和演化型Ⅲ茄科雷爾氏菌）、茄科雷爾氏菌R.solanacearum（演化型Ⅱ茄科雷爾氏菌）和蒲桃雷爾氏菌R.syzygii（演化型Ⅳ茄科雷爾氏菌、R.syzygii和BDB菌一起構(gòu)成）［17］。2020年，Etminani等利用茄科雷爾氏菌復(fù)合種57個看家基因系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步支持該分類方法［18］。

在我國，自20世紀(jì)30年代記錄花生青枯病發(fā)生以來，除西藏外，其他30個?。ㄊ?、自治區(qū)）均報道有作物青枯病，其中廣東、廣西、海南等南方省份是作物青枯病的高發(fā)區(qū);在我國，茄科雷爾氏菌復(fù)合種寄主已達(dá)39科90余種植物，其中有20多種寄主植物在國外未見報道［19］。我國已報道的茄科雷爾氏菌復(fù)合種菌株分屬演化型Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ［20-21］，即假茄科雷爾氏菌、茄科雷爾氏菌和蒲桃雷爾氏菌;存在1號、3號、4號和5號生理小種，5個生化變種，以及1、4、7、12、13、14、15、16、17、18、30、34、44、45、48、54、55、56、57、70和71等21個序列變種［21-26］。

廣東地處熱帶、亞熱帶，常年高溫、多雨，十分有利于作物青枯病的發(fā)生與流行，每年該病都會造成較大的損失。2020年5月，本研究團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行作物青枯病發(fā)生情況調(diào)查與監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)東莞市一觀賞向日葵種植區(qū)部分向日葵植株發(fā)生了青枯病，其田間癥狀表現(xiàn)為整株萎蔫，初期病株頂部葉片萎蔫，隨后下部葉片萎蔫，但葉片仍為綠色，莖基部皮層部分發(fā)黑;后期植株葉片干枯，剝開維管束呈褐色至黑色（圖1）。截至目前，尚未見國內(nèi)有向日葵青枯病發(fā)生的報道。為此，本研究對引起廣東省東莞市向日葵青枯病的病原菌進(jìn)行鑒定，為防控向日葵青枯病提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

2020年5月，在廣東省東莞市寮步鎮(zhèn)公園發(fā)現(xiàn)部分觀賞向日葵植株表現(xiàn)為典型的青枯病癥狀，隨機(jī)采集15株向日葵青枯病植株，帶回實(shí)驗(yàn)室檢測與鑒定。

試驗(yàn)寄主植物包括向日葵、番茄（‘東茄）、茄子（‘白龍）、辣椒（‘粵紅3號）、煙草（‘普通煙）、香蕉（‘大豐1號）和沙姜。

假茄科雷爾氏菌辣椒菌株GY-2（演化型Ⅰ、1號生理小種、生化變種3）和演化型Ⅱ菌株HZ-1為本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定與保存。

1.2?培養(yǎng)基

TZC培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酪朊水解物1 g，葡萄糖5 g，瓊脂17 g，用ddH2O定容至1 000 mL，pH 7.2，121℃滅菌 20 min。滅菌后冷卻至60℃左右加入已過濾滅菌的1% TZC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）水溶液，使其終濃度為0.005%。

碳水化合物利用基本培養(yǎng)基：磷酸二氫銨 1.0 g、氯化鉀 0.2 g、七水硫酸鎂 0.2 g、酵母提取物0.2 g、溴百里酚藍(lán)指示劑2 mL（1.6 %乙醇溶液），用ddH2O定容至1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

1.3?病原菌的分離、純化與保存

切取向日葵病株的莖基部或根莖部的變色維管束組織，在顯微鏡下檢查。按佘小漫等［27］的方法從病組織中分離病原細(xì)菌，在TZC瓊脂平板上分離與培養(yǎng)獲得單菌落，獲得15株純化菌株（RS638～RS652），20℃恒溫保存。

1.4?病原菌致病性測定

純化菌株在TZC培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h，選取中間粉紅色，周圍乳白色的單菌落用于試驗(yàn)。采用菌液傷根接種法接種3～5葉期的健康向日葵、番茄、茄子、辣椒、煙草植株，每株菌株分別接種15株植物，接種菌液濃度為1×108 ?cfu/mL，浸根20 min，測定其致病性。采用注射法接種沙姜和香蕉莖基部，每株菌株分別接種15株植物，接種菌液濃度為3×108 ?cfu/mL，接種量500 μL。每種作物每處理設(shè)3次重復(fù)。接種試驗(yàn)期間網(wǎng)室內(nèi)氣溫為28～36℃。以分離自辣椒的假茄科雷爾氏菌菌株GY-2為對照菌株。

采用Excel 2010和DPS 19.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析;采用單因素方差分析和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn) （P＜0.05）;表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.5?病原菌的鑒定

1.5.1?DNA 提取

菌株在TZC培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)48 h后，挑取菌落接種到TZC液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過夜，取1.5 mL菌液12 000 g離心1 min，用EasyPure Genomic DNA Kit（全式金公司）細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增模板。

1.5.2?16S rDNA序列分析

以通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1541r（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）［28］進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。PCR擴(kuò)增采用50 μL 反應(yīng)體系， 其中Premix ExTaq-25 μL，模板50 ng，引物27f和1541r各6 pmol。反應(yīng)程序?yàn)?6℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 3 min，35 個循環(huán);72℃ 延伸10 min。將測序所得到的核苷酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST序列比對分析。

1.5.3?演化型鑒定

參照Fegan等［15］的方法測定上述15株菌株的演化型，分別以Nmult：21：1F（5′-CGTTGATGAGGCGCGCAATTT-3′，演化型Ⅰ）、Nmult：21：2F（5′-AAGTTATGGACGGTGGAAGTC-3′，演化型Ⅱ）、Nmult：22：InF（5′-ATTGCCAAGACGAGAGAA-GTA-3′，演化型Ⅲ）、Nmult：23：AF（5′-ATTACSAGAGCAATCGAAAGATT-3′，演化型Ⅳ）、Nmult：22：RR（5′-TCGCTTGACCCTATAACGAGTA-3′），以及茄科雷爾氏菌復(fù)合種特異性引物759f（5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′）和760r（5′-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3′）進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增。25 μL PCR擴(kuò)增體系，其中Premix ExTaq 12.5 μL，模板30 ng，引物Nmult：21：1F、Nmult：21：2F和Nmult：22：InF 各3 pmol，Nmult： 23： AF和Nmult： 22： RR各9 pmol，759f/760r 各2 pmol。反應(yīng)程序?yàn)?6℃預(yù)變性5 min；94℃ 15 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán);72℃ 延伸10 min。2.5% 瓊脂糖凝膠中電泳檢測PCR 產(chǎn)物，根據(jù)帶型確定供試菌株的分類地位。

1.5.4?序列變種鑒定

以eglF（5′-TCTCCATTTTTCCATTTCGTCATG-3′）和eglR（5′-ATGCCATCCGCCACGGACCCGGC-3′）為引物，PCR擴(kuò)增茄科雷爾氏菌內(nèi)葡聚糖（egl）基因序列。PCR擴(kuò)增采用50 μL 反應(yīng)體系， 其中Premix ExTaq 25 μL，模板50 ng，引物eglF和eglR各8 pmol，二甲亞砜2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?6℃預(yù)變性9 min；94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 2.5 min，35 個循環(huán);72℃ 延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定。應(yīng)用MEGA-X 軟件對egl基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定菌株的序列變種。

1.5.5?生化變種測定

按方中達(dá)［29］的方法進(jìn)行。將乳糖、麥芽糖、D （+）-纖維二糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、衛(wèi)茅醇分別配制成10%溶液，過濾滅菌后加入基本培養(yǎng)基至終濃度1.0%，3次重復(fù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?病原菌分離及培養(yǎng)性狀

顯微鏡下可見向日葵病組織維管束的切口處有大量細(xì)菌噴出。在TZC培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)48 h后，分離自向日葵病株的菌株在TZC培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生了茄科雷爾氏菌的典型菌落形態(tài)，近圓形或梭形，隆起，中間粉紅色，周圍乳白色。

2.2?病原菌致病性測定

將純化的5株代表菌株分別回接3～5葉期健康的向日葵植株。接種后3 d，植株即陸續(xù)開始表現(xiàn)萎蔫癥狀。隨著時間的推移，病株癥狀逐漸加重，7 d 后完全萎蔫枯死，與田間向日葵青枯病株的癥狀表現(xiàn)一致（圖1）。從接種的病株中均可分離到與接種用病原菌相同的菌株。這些結(jié)果表明，分離獲得的細(xì)菌即是引起向日葵青枯病的病原菌。對照菌株GY-2對向日葵的致病力較低（表1）。

室內(nèi)傷根或注射接種6種寄主植物結(jié)果顯示（表1），15株菌株均可侵染番茄、茄子、辣椒，部分菌株可侵染沙姜和煙草，病株率分別為93.33%～100%、13.33%～60.00%、46.67%～100%、0～33.33%和0～86.67%，15株菌株均不能侵染香蕉;對照菌株GY-2侵染番茄、茄子、辣椒、煙草，不侵染沙姜和香蕉（表1）。根據(jù)茄科雷爾氏菌復(fù)合種生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)［2-4］，向日葵青枯病病原菌應(yīng)屬1號生理小種。

2.3?病原菌的鑒定

2.3.1?16S rDNA序列分析

PCR擴(kuò)增獲得15株病原菌的 16S rDNA的近全長序列，均為1 432 bp（GenBank登錄號：MZ676084～MZ676098），序列間一致性為100%。BLAST比對結(jié)果表明，15個序列與Ralstonia solanacearum FJAT1303.F1 16S rDNA（GenBank登錄號：CP052128）的一致性為100%。

2.3.2?演化型鑒定

采用復(fù)合PCR 檢測體系對15株病原菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：15株菌株均可同時擴(kuò)增得到144 bp的茄科雷爾氏菌復(fù)合種演化型Ⅰ特異性條帶和280 bp的特異性條帶（圖2）。因此，引起向日葵青枯病的15株菌株均屬茄科雷爾氏菌復(fù)合種演化型 I菌株，即假茄科雷爾氏菌。

2.3.3?序列變種鑒定

序列測定結(jié)果表明，15株菌株的egl基因部分序列長為698～699 bp，egl基因序列間一致性為99%～100%。利用MEGA X軟件，將15株菌株與GenBank中48株茄科雷爾氏菌復(fù)合種菌株的egl基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果（圖3）顯示，分離自向日葵的15株菌株均為茄科雷爾氏菌復(fù)合種演化型Ⅰ，與演化型鑒定結(jié)果一致，即假茄科雷爾氏菌。15株假茄科雷爾氏菌菌株分屬4個序列變種，其中RS641、RS642、RS644、RS645、RS646、RS648、RS649和RS652等8株菌株為序列變種17，RS638、RS640、RS643、RS650和RS651等5株菌株為序列變種13，RS647和RS639分別為序列變種14和序列變種54（圖3）。

2.3.4?生化變種測定結(jié)果

碳水化合物利用試驗(yàn)結(jié)果表明，分離自向日葵的15株假茄科雷爾氏菌菌株與對照菌株GY-2一致，都可以利用麥芽糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、甘露醇和衛(wèi)矛醇等6種碳水化合物。根據(jù)茄科雷爾氏菌復(fù)合種生化變種劃分標(biāo)準(zhǔn)［4-7］，引起向日葵青枯病的假茄科雷爾氏菌屬于生化變種3。

3?結(jié)論與討論

本文對發(fā)生在廣東省東莞市的向日葵青枯病病原菌進(jìn)行了鑒定。通過對病原菌菌落形態(tài)特征、人工接種試驗(yàn)，以及16S rRNA基因序列、生理生化特性和egl基因序列比較分析，明確了引起廣東省東莞市向日葵青枯病的病原菌為雷爾氏菌屬假茄科雷爾氏菌，1號生理小種、生化變種3，并且存在序列變種13、14、17和54。

廣東省是我國最早記錄作物青枯病發(fā)生的省份，也是我國作物青枯病發(fā)生最為嚴(yán)重的省份之一。本研究團(tuán)隊(duì)自1999年以來持續(xù)對廣東省作物青枯病發(fā)生情況進(jìn)行監(jiān)測，不斷發(fā)現(xiàn)作物青枯病的新寄主，如空心菜［30］、沙姜［31］、勝紅薊［27］、南瓜等［26］，2020年又發(fā)現(xiàn)向日葵青枯病。Ramesh等曾報道印度發(fā)生向日葵青枯病，分離自向日葵的菌株RS-09-190為茄科雷爾氏菌復(fù)合種演化型Ⅰ菌株，即假茄科雷爾氏菌，生化變種3，其生理小種和序列變種分類情況并未明確［32］。本研究對發(fā)生在我國的向日葵青枯病病原菌進(jìn)行了鑒定，為向日葵青枯病的防控提供科學(xué)依據(jù)，也為分析我國假茄科雷爾氏菌分布及種群進(jìn)化等研究提供了菌株材料。

假茄科雷爾氏菌進(jìn)化變異較快，菌系分化明顯，明確其種內(nèi)遺傳多樣性對探索作物青枯病防控策略具有指導(dǎo)意義。生理生化測定結(jié)果表明，本研究從向日葵上分離到的假茄科雷爾氏菌均為生化變種3，未發(fā)現(xiàn)生化變種1、2、4和5的菌株，研究結(jié)果與曾憲銘等［33］和She等［22］的結(jié)果一致。演化型鑒定結(jié)果表明，15株菌株均為假茄科雷爾氏菌，即茄科雷爾氏菌復(fù)合種演化型I，該結(jié)果與Fegan等認(rèn)為的亞洲起源的菌株屬于茄科雷爾氏菌復(fù)合種演化型I（生化變種3、4和5）分類框架一致［15］。

目前，國際上報道的假茄科雷爾氏菌有36個序列變種［34-35］，我國存在12、13、14、15、16、17、18、30、34、44、45、48、54、55、56、57、70和71等18個序列變種 ［21-26］，而廣東省已報道有序列變種13、14、15、17、18、34、44、45、48、56和57［22，26］。本研究egl基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，15株假茄科雷爾氏菌菌株存在4個序列變種，分別為13、14、17和54。序列變種54是首次在廣東發(fā)現(xiàn)，此前序列變種54的菌株分布在廣西、貴州、安徽、湖北和重慶等地［23-24］。分離自相同寄主而序列變種不同的菌株的致病力有差異［22，24］，本研究的15株假茄科雷爾氏菌菌株分屬4個序列變種，只有序列變種54的菌株RS639對普通煙草有較強(qiáng)的致病力，序列變種13的菌株RS638和RS650、序列變種54菌株RS639以及序列變種17的菌株RS642可侵染沙姜，但致病力較弱。不同序列變種菌株間致病力差異的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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