孫夫德 任美娜 趙麗娜 馬子祎 鮑宇

摘要 磷酸化修飾是膜蛋白翻譯后修飾的重要類型之一，由蛋白激酶和磷酸酶共同調(diào)節(jié)而保持一種動態(tài)平衡，在正常生命活動乃至腫瘤發(fā)生中發(fā)揮調(diào)控作用。磷酸化修飾誘導(dǎo)膜蛋白結(jié)構(gòu)變化可調(diào)節(jié)蛋白之間結(jié)合活力，而關(guān)鍵磷酸化位點突變可破壞蛋白結(jié)合并解除相關(guān)信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。與其他蛋白不同，膜蛋白需要以質(zhì)膜為介質(zhì)發(fā)揮功能作用，由于膜組成復(fù)雜性和不對稱性，磷酸化修飾對膜蛋白的質(zhì)膜定位以及表面貼附至關(guān)重要。膜蛋白磷酸化還調(diào)節(jié)周圍磷脂分子的熱力學(xué)性質(zhì)和動力學(xué)特性，從而加劇對磷脂雙分子層有序度的影響。本文重點闡述了膜蛋白磷酸化的分子特征及調(diào)控機制，包括磷酸化位點分布，磷酸化修飾對膜蛋白結(jié)構(gòu)調(diào)控以及特異膜環(huán)境依賴性；系統(tǒng)總結(jié)了膜蛋白磷酸化引發(fā)的結(jié)構(gòu)變化在各種生物過程中的功能作用，旨在為膜蛋白磷酸化及相關(guān)靶向干預(yù)研究提供參考。

關(guān) 鍵 詞 磷酸化修飾；膜蛋白；質(zhì)膜；結(jié)構(gòu)變化；生物功能

中圖分類號 Q6? ? ?文獻標志碼 A

Structure and function of membrane proteins modulated by phosphorylation

SUN Fude， REN Meina， ZHAO Lina， MA Ziyi， BAO Yu

（Key Laboratory of Molecular Biophysics， Hebei Province， Institute of Biophysics， School of Sciences， Hebei University of Technology， Tianjin 300401， China ）

Abstract Phosphorylation modification is one of the main type of post-translational modification of membrane proteins. It is regulated by protein kinases and phosphatases to maintain a dynamic balance and play a role in normal life activities and even tumorigenesis. Phosphorylation induces structural changes in membrane proteins that regulate binding activity between proteins. Due to disease mutations， loss of phosphorylation sites may disrupt protein binding and deregulate signal transduction. Different from other proteins， membrane proteins require the plasma membrane as a medium to function. Because membrane composition is complex and asymmetrical， phosphorylation is crucial for the correct localization of membrane proteins. Phosphorylation of membrane proteins also greatly affects the thermodynamic and dynamics properties of the surrounding phospholipid molecules， which intensifies the influence on the order degree of the phospholipid bilayer. This paper focuses on the molecular characteristics and regulation mechanism of membrane protein phosphorylation， including the distribution of phosphorylation sites， the regulation of membrane protein structure and the dependence of phosphorylation on specific membrane environment. The functional roles of membrane protein phosphorylation induced structural changes in various biological processes were systematically summarized in order to provide theoretical references for a further study of membrane protein phosphorylation and relevant targeted intervention.

Key words phosphorylation modification; membrane protein; plasmolemma; structural change; biological function

0 引言

膜蛋白是一類能夠結(jié)合或整合到細胞膜或細胞器膜上蛋白質(zhì)的總稱。在圍繞細胞和較小細胞區(qū)室的脂質(zhì)膜層中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百萬種膜蛋白，占所有編碼蛋白質(zhì)的25%～30%。根據(jù)與膜結(jié)合強度以及位置的不同膜蛋白被歸為3類：外周膜蛋白、整合膜蛋白和脂錨定蛋白[1-2]。膜蛋白可以通過細胞外和細胞內(nèi)的相互作用介導(dǎo)細胞與環(huán)境間物質(zhì)及信號交換過程，如細胞信號傳導(dǎo)、膜不透性分子轉(zhuǎn)運和細胞間通訊等[3]。近年來，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展促使更多哺乳動物細胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)信息和生物關(guān)聯(lián)性得以良好表征，且有廣泛研究顯示，膜蛋白在癌細胞發(fā)生發(fā)展中扮演重要調(diào)節(jié)作用[4]。同時，膜蛋白還是十分重要的藥物靶標，目前所有可用藥物中有70%以上是通過膜蛋白起作用的，其中包括治療癌癥、心臟病和疼痛的藥物[5-6]。膜蛋白生物功能的充分發(fā)揮，大多需要由蛋白激酶和磷酸酶催化的可逆磷酸化修飾介導(dǎo)下的動態(tài)構(gòu)象變化、配體結(jié)合以及亞細胞定位過程[7]。

磷酸化是一種生物體內(nèi)重要的可逆性翻譯后修飾。人類基因組編碼的21 000種蛋白質(zhì)中，超過三分之二被磷酸化，超過90%的蛋白會受到這種翻譯后修飾的影響[8]。這種可逆機制分別通過蛋白激酶（protein kinase）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase）催化發(fā)生。在蛋白激酶催化下，三磷酸腺苷（ATP）的磷酸基被轉(zhuǎn)移至膜蛋白的氨基酸側(cè)鏈而發(fā)生磷酸化修飾，隨后磷酸化膜蛋白與下游磷酸化結(jié)合蛋白（phospho-binding proteins）相互作用。同時，磷酸化膜蛋白也可以在磷酸酶作用下發(fā)生去磷酸化（圖1）。目前已知可發(fā)生磷酸化修飾的天然氨基酸有9種（絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr、酪氨酸Tyr、賴氨酸Lys、精氨酸Arg、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、半胱氨酸Cys和組氨酸His），而其中絲氨酸磷酸化、蘇氨酸磷酸化以及酪氨酸磷酸化尤為常見[9]。在各種氨基酸的極性基團側(cè)鏈上添加或移除磷酸基團通常都會造成蛋白局域電荷變化，這是磷酸化影響蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)、穩(wěn)定性和動力學(xué)的重要原因[10]。磷酸化修飾對蛋白的調(diào)節(jié)機制是多樣的，磷酸化會使蛋白復(fù)合物不穩(wěn)定，并可導(dǎo)致蛋白激活或失活。在其他誘導(dǎo)因素存在條件下，可介導(dǎo)異源蛋白復(fù)合物的形成，并通過蛋白類似物競爭性結(jié)合提供一種負調(diào)控機制。磷酸化還可通過誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象變化或蛋白之間結(jié)合的變構(gòu)效應(yīng)，調(diào)節(jié)蛋白間相互作用的性質(zhì)和強度，從而協(xié)調(diào)不同的細胞反應(yīng)途徑[11]。

除了直接影響蛋白質(zhì)本身的動力學(xué)特性外，膜蛋白的不同磷酸化模式似乎具有不同的“磷酸化條形碼”，可以誘導(dǎo)配體呈現(xiàn)獨特的構(gòu)象及活性，從而控制不同的細胞反應(yīng)。典型的膜蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor，GPCR），它可在C端和胞內(nèi)環(huán)的多個殘基位點發(fā)生磷酸化，不同位點磷酸化可特異性地調(diào)控其配體β-抑制素的活性狀態(tài)，使下游信號蛋白的募集受到影響[12]。與水溶蛋白不同，膜蛋白磷酸化還會使其周圍磷脂分子的熱力學(xué)性質(zhì)和動力學(xué)結(jié)構(gòu)受到較大干擾，從而加劇對磷脂雙分子層有序度的影響。磷酸化后的負電荷排斥某些負電性磷脂分子，使膜表面磷脂分子的分布發(fā)生改變。值得注意的是，磷脂分子的分布狀態(tài)對生物膜的自組織結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)-磷脂膜的相互作用、生物膜的融合分裂以及脂筏（lipid raft）的形成等具有重要的意義[13-14]。同時，磷酸化影響膜蛋白在細胞上形成團簇的形式以及在細胞膜上的結(jié)合取向，這種影響還與細胞膜本身的流動性有關(guān)[15]。大量報道顯示膜蛋白的磷酸化修飾參與了細胞癌化過程，且其修飾位點變化通常與癌癥患者的愈后相關(guān)[16]。因此，膜蛋白的磷酸化修飾可作為重要的愈后標志物，在腫瘤的治療及愈后評估具有重要價值。本文將重點闡述膜蛋白磷酸化的分子特征及調(diào)控，系統(tǒng)總結(jié)膜蛋白磷酸化的結(jié)構(gòu)變化在各種生理病理過程中的功能作用，旨為膜蛋白磷酸化深入研究提供理論參考。

1 膜蛋白磷酸化修飾的特征及調(diào)控機制

膜蛋白的多種氨基酸都可以被磷酸化，但絲氨酸（86.4%）、蘇氨酸（11.86%）和酪氨酸（1.8%）殘基是最常見的磷酸化位點[9]。膜蛋白磷酸化發(fā)揮特定功能調(diào)控具有位點依賴性，這意味著磷酸化發(fā)生不是隨機的[17]。此外，不同位點的磷酸化修飾會調(diào)控膜蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而磷酸化修飾引發(fā)的結(jié)構(gòu)變化在翻譯后修飾中占比最高。對不同磷酸化修飾位點分析，揭示了其對膜蛋白結(jié)構(gòu)影響的多樣性和異質(zhì)性，磷酸化可以在局部和全局水平上影響膜蛋白結(jié)構(gòu)[18]。

1.1 磷酸化區(qū)域界面及結(jié)構(gòu)特性

許多細胞功能調(diào)控機制在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用水平上運作，相關(guān)信號通路涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合活性和磷酸化修飾下的作用網(wǎng)絡(luò)[19]。磷酸化修飾在某些情況下會調(diào)節(jié)膜蛋白同源寡聚和異源寡聚復(fù)合物中構(gòu)象間或寡聚狀態(tài)間的轉(zhuǎn)變[20]。Nishi等[21]通過實驗將磷酸化位點映射到人類同源或異源蛋白寡聚體的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，與非結(jié)合界面的蛋白表面位點相比，磷酸化位點傾向于分布在瞬時同源低聚物和異源低聚物的結(jié)合界面上。有研究指出，異源寡聚體結(jié)合界面上的磷酸化位點取代所產(chǎn)生的結(jié)合親和力變化更大，磷酸化可能直接調(diào)節(jié)結(jié)合界面上相互作用的強度。在界面上，磷酸化位點通過比非磷酸化位點形成更多的氫鍵和殘基接觸來促進復(fù)合物的穩(wěn)定性。保持蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)完整性所必須的殘基被稱為結(jié)合熱點，基于磷酸化位點經(jīng)常靶向結(jié)合熱點的觀察結(jié)果，可知磷酸化位點和結(jié)合熱點之間存在顯著關(guān)聯(lián)[22]。磷酸化可以提供膜蛋白間識別模式的多樣性，從而增加膜蛋白結(jié)合的選擇性[23]。界面上的磷酸化可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，這一調(diào)控功能與磷酸化位點傾向于位于蛋白寡聚體結(jié)合界面密切相關(guān)。

膜蛋白的N端和C端結(jié)構(gòu)域在自然條件下多數(shù)是無序的，即它們不包含或很少包含明確定義的結(jié)構(gòu)[24]。第一個系統(tǒng)性研究是對大量無序區(qū)域與實驗已知磷酸化蛋白質(zhì)進行的親和力表征。該研究發(fā)現(xiàn)，本質(zhì)上無序的區(qū)域更富集磷酸化位點[25]。磷酸化位點和無序膜蛋白質(zhì)區(qū)域之間在序列復(fù)雜性、氨基酸組成、靈活性參數(shù)和其他特性具有一定的相似性。與有序界面殘基（8%）或無序非界面殘基（18%）相比，無序界面殘基的磷酸化位點（25%）比例更高，這表明磷酸化與無序界面殘基之間存在很強的關(guān)聯(lián)。無序界面中磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸比例分別為59%、26%、15%。磷酸化的酪氨酸更傾向分布在結(jié)構(gòu)區(qū)域，而絲氨酸和蘇氨酸則常出現(xiàn)在無序靈活的區(qū)域[10，26]。一些關(guān)于p53[27]、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）[28]、p27[29]和其它膜蛋白[30]的實驗研究表明，無序區(qū)域通常包含磷酸化位點，同時（去）磷酸化修飾可以與膜蛋白結(jié)構(gòu)無序-有序的轉(zhuǎn)變相耦合。預(yù)測完全無序蛋白質(zhì)中的磷酸化位點比有序蛋白質(zhì)中的磷酸化位點多10倍以上，這有力地支持了蛋白質(zhì)磷酸化與無序結(jié)構(gòu)之間緊密聯(lián)系的觀點。

1.2 磷酸化誘導(dǎo)的膜蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變機制

最近越來越多的證據(jù)表明，細胞表面膜蛋白的結(jié)構(gòu)更具動態(tài)性，并且在不同時間尺度上以平衡的方式在多個構(gòu)象之間相互轉(zhuǎn)換，例如活性和非活性構(gòu)象間的動態(tài)轉(zhuǎn)變[31]。值得注意的是，磷酸化翻譯后修飾能夠多方位多角度地影響調(diào)控膜蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)[32-33]。

1.2.1 磷酸化修飾通過氫鍵和鹽橋調(diào)控膜蛋白結(jié)構(gòu)

磷酸化基團在生理條件下是二價負電性的，可以與相同或不同鏈的相鄰殘基形成氫鍵和鹽橋。磷酸基與其他殘基之間最常見的作用模式是磷酸氧和精氨酸或賴氨酸側(cè)鏈之間形成氫鍵和鹽橋[34]。利用分子動力學(xué)模擬研究的結(jié)果顯示，磷酸化導(dǎo)致眾多膜蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生封閉到開放的轉(zhuǎn)變，關(guān)鍵氫鍵和新形成的鹽橋是這些結(jié)構(gòu)波動的潛在驅(qū)動因素[35-37]。Src蛋白酪氨酸激酶β3的賴氨酸（Lys298）與相鄰αC螺旋的谷氨酸（Glu313）之間鹽橋的形成是從自抑制狀態(tài)到激活狀態(tài)轉(zhuǎn)換的先決條件[38]。磷酸化絲氨酸氫鍵受體比磷酸化天冬氨酸受體形成更穩(wěn)定的相互作用，氫鍵的強度一般取決于磷酸質(zhì)子化狀態(tài)，質(zhì)子化狀態(tài)對磷酸化天冬氨酸的影響比對磷酸化絲氨酸的影響更明顯[39]。磷酸化殘基通常與帶正電荷的側(cè)鏈形成鹽橋，鹽橋的能量依賴于參與的側(cè)鏈間的距離和取向[40]。綜上所述，在膜蛋白中添加或去除二價負電性磷酸基可能會顯著改變其局部的物理化學(xué)性質(zhì)，并影響其穩(wěn)定性和動力學(xué)屬性。

1.2.2 磷酸化修飾在局部和整體水平影響膜蛋白結(jié)構(gòu)

對不同膜蛋白磷酸化分析，揭示了其對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響的多樣性和異質(zhì)性，磷酸化可以在局部和全局水平上影響膜蛋白結(jié)構(gòu)[41-42]。我們通過粗?；肿觿恿W(xué)模擬研究跨膜蛋白CD44（Cluster-of-Differentiation-44）胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域2個保守位點絲氨酸Ser291和Ser325的磷酸化，發(fā)現(xiàn)Ser291的磷酸化使胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域呈折疊構(gòu)象，而Ser325磷酸化時胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域整體表現(xiàn)為更延展的構(gòu)象。2個磷酸化位點對CD44局部延展性調(diào)控的差異，將進一步影響下游細胞骨架結(jié)合蛋白ERM（Ezrin， Radixin and Moesin）與CD44的結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了磷酸化對膜蛋白局部到整體的影響[43]（圖2）。一項研究大規(guī)模比較了磷酸化和非磷酸化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，并表明磷酸化產(chǎn)生了局部和整體的結(jié)構(gòu)變化[44]。然而，只有13%的蛋白質(zhì)在磷酸化和非磷酸化形式之間表現(xiàn)出大于2?的全局變化，磷酸化通過將整體構(gòu)象異質(zhì)性降低25%來穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)。有人認為磷酸化在許多情況下可能會限制膜蛋白單體的構(gòu)象靈活性[45]。

1.2.3 磷酸化修飾誘導(dǎo)膜蛋白失活—活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變

磷酸化可誘導(dǎo)具有不同活性或結(jié)合特異性的蛋白構(gòu)象之間動態(tài)轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的激活或失活[46]。膜蛋白失活—活性結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變對于下游結(jié)合蛋白的細胞應(yīng)答具有重要意義。CFTR是ABC超家族中的一種跨膜陰離子通道，CFTR活性具有PKA依賴性，主要歸因于其胞質(zhì)區(qū)未磷酸化的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（Regulatory domain，RD）對通道門控的抑制影響，RD結(jié)構(gòu)域磷酸化可打開陰離子孔，因此磷酸化會使得這種抑制作用得以緩解[47]。數(shù)據(jù)顯示陽離子鉀通道結(jié)構(gòu)和功能的動態(tài)可逆變化也是主要通過通道復(fù)合物的磷酸化翻譯后修飾而實現(xiàn)的[48]。對于CD44而言，Ser291磷酸化使得CD44的CTD與內(nèi)膜貼附，呈更卷縮的構(gòu)象，此構(gòu)象會掩蓋CTD與ERM的N端活性域FERM（N-terminal subdomain of ezrin-radixin-moesin）的結(jié)合位點，進而通過抑制CD44-FERM復(fù)合物的形成來抑制細胞增殖。S325磷酸化使CTD遠離內(nèi)膜且呈延展構(gòu)象，進而促進CD44與FERM的相互作用（圖2）。整合素特定位點的磷酸化在整合素活性的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用。最近的研究表明，如果整合素α鏈的磷酸化位點不含磷酸鹽，那么β鏈就不能被磷酸化，整合素就不具活性。只有當兩條鏈都被磷酸化時，整合素的細胞質(zhì)部分區(qū)域打開，與高親和力的接頭蛋白結(jié)合，導(dǎo)致絲蛋白被釋放[49]。

1.3 特異膜環(huán)境依賴性

由于細胞膜組分的多樣性以及結(jié)構(gòu)的非對稱性，膜蛋白在行使功能的過程中受細胞膜環(huán)境的密切調(diào)控。細胞膜生物物理特性，如膜厚度、流動性和表面電荷，同樣也潛在地影響著蛋白的翻譯后修飾，如棕櫚?；姿峄吞腔萚13]。磷酸化誘導(dǎo)膜蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)變化受脂質(zhì)環(huán)境的影響，尤其細胞膜內(nèi)小葉富含的負電性磷脂分子是磷酸化修飾引發(fā)蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的重要因素。

目前研究最廣泛的負電磷脂分子是棕櫚油酰磷脂酰絲氨酸（palmitoyloleoyl-phosphatidylserine， POPS）和4，5二磷酸-磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol-4，5-biphosphate， PIP2）。POPS與PIP2雖同為僅存在于細胞膜內(nèi)葉的負電性脂質(zhì)，但PIP2同樣擔任第二信使作用，在蛋白聚集和易位過程中發(fā)揮著更為特殊的功能[50-51]。Ezrin蛋白的Thr567磷酸化已被證明在其構(gòu)象激活中起重要作用，但Ezrin N端與PIP2的相互作用是Thr567磷酸化的必要條件。通過分析Erzin N端與PIP2極性頭部復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Ezrin與PIP2的相互作用誘導(dǎo)了構(gòu)象重排，從而實現(xiàn)Thr567位點的磷酸化[52]。鈣調(diào)蛋白CaM的Thr79位于PIP2結(jié)合位點附近，通過酪蛋白激酶2（CK2）磷酸化的Thr79可以顯著降低PIP2對其結(jié)合位點的親和力，增強PIP2對SK（small conductance Ca2+-activated potassium channels）通道的抑制作用。Thr79磷酸化不會影響蛋白整體的構(gòu)象，但顯著改變了PIP2結(jié)合位點周圍氨基酸殘基之間的動態(tài)相互作用，例如形成新的鹽橋，導(dǎo)致PIP2與其結(jié)合位點之間的相互作用被減弱[53]。

隨著膜結(jié)構(gòu)與功能研究的深入，脂筏的發(fā)現(xiàn)豐富了脂質(zhì)膜對蛋白結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控機制。脂筏是指膜脂雙分子層中富含鞘脂類和膽固醇的微區(qū)，不同脂質(zhì)和蛋白質(zhì)之間親和力差異導(dǎo)致膜域相分離，即形成脂筏（有序相）和非脂筏（無序相）結(jié)構(gòu)域[54]。PIP2由于sn-2脂酰鏈的高不飽和度傾向分布在非脂筏域中，導(dǎo)致蛋白的膜區(qū)分配以及募集差異性[50，55]。脂筏結(jié)構(gòu)域?qū)α姿峄揎椪{(diào)控影響的一個典型案例是低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6），它與磷酸激酶同時定位至脂筏結(jié)構(gòu)域，對于隨后磷酸化修飾的發(fā)生和下游的信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。研究顯示，當模型中脂筏數(shù)量明顯超過通路特異性膜蛋白的數(shù)量時，LRP6磷酸化及下游通路活性顯著降低[56]。磷酸化修飾以特異膜環(huán)境依賴性方式調(diào)控膜蛋白功能的機制，擴大了我們對膜脂分子在膜蛋白磷酸化修飾的建立和維持中所起作用的認識。

2 膜蛋白磷酸化的生物功能及意義

膜蛋白磷酸化是協(xié)調(diào)細胞和機體功能的初始步驟之一，如調(diào)節(jié)代謝、增殖、凋亡、炎癥、亞細胞運輸和其它重要的生理過程[57]。膜蛋白的生物活性與其分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，磷酸化修飾調(diào)控的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變是膜蛋白參與調(diào)節(jié)多種生物過程的重要方式，是介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞內(nèi)功能最常見的作用機制之一[58]。細胞粘附蛋白是最典型的膜蛋白之一，參與細胞增殖和遷移，與癌細胞的惡性增殖侵襲密切相關(guān)。表1列舉了目前研究比較清楚的細胞表面粘附蛋白磷酸化修飾參與調(diào)控的細胞生物功能。目前，有關(guān)膜蛋白磷酸化結(jié)構(gòu)變化介導(dǎo)的生物功能研究主要集中在蛋白相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和質(zhì)膜定位等方面。

2.1 膜蛋白互作的分子開關(guān)

在特定的激酶和磷酸酶作用下，許多膜蛋白通過磷酸化/去磷酸化修飾被激活或失活。磷酸化誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化作為分子開關(guān)，控制不同途徑中的蛋白質(zhì)活性以及與其它蛋白的結(jié)合模式，并調(diào)控細胞粘附、增殖和細胞免疫應(yīng)答等[69-71]。目前，一些新的研究使用生物物理、結(jié)構(gòu)和計算方法解釋了磷酸化修飾在蛋白互作中的調(diào)節(jié)機制，為膜蛋白變構(gòu)機制提供了新見解，并為磷酸化修飾調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供了新機會。

我們利用高通量Martini粗?；肿觿恿W(xué)模擬研究了在多種細胞類型中廣泛表達的Ⅰ型跨膜蛋白CD44，從非活性、低親和狀態(tài)到活性、高親和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變需要胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域特定絲氨酸殘基的磷酸化修飾[72]。Ser291和Ser325磷酸化使CD44胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域形成封閉或開放構(gòu)象，這兩種構(gòu)象的選擇作為一種分子開關(guān)調(diào)控CD44與下游細胞骨架結(jié)合蛋白（α-actin）結(jié)合（圖2）。同樣在細胞極性發(fā)揮關(guān)鍵作用的Ⅰ型跨膜蛋白Crumbs，其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域Thr2118的磷酸化通過防止FERM結(jié)合基序β-折疊構(gòu)象的形成，進而阻止Crumbs胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與FERM的結(jié)合[73]。在蛋白激酶C（PKC）和Rho激酶作用下，細胞骨架結(jié)合蛋白FERM-Moesin胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域C端的Thr558殘基發(fā)生磷酸化（圖2），破壞了N端和C端之間的自抑制結(jié)合，從而使N端能夠與CD44或其他粘附蛋白相互作用，這與細胞-細胞和細胞-細胞基質(zhì)粘附的形成和分解有關(guān)[74]。磷酸化修飾膜蛋白的結(jié)構(gòu)在細胞效應(yīng)過程的響應(yīng)和啟動起著重要作用。磷酸化小分子GTP結(jié)合蛋白Rab（Ras genes from rat brain）與其效應(yīng)器相互作用的影響也已在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的背景下進行了研究。Rab蛋白高度保守的開關(guān)Ⅱ區(qū)域磷酸化誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化對Rab與其調(diào)節(jié)蛋白及效應(yīng)蛋白之間的相互作用具有抑制作用，從而決定相關(guān)生物調(diào)節(jié)途徑[75]。該研究表明，Rab的調(diào)節(jié)功能可能通過動態(tài)的磷酸化實現(xiàn)，而不僅僅是與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。

2.2 調(diào)控細胞信號通路

磷酸化介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴蛋白多種功能構(gòu)象之間的精確轉(zhuǎn)換。膜蛋白的磷酸化修飾調(diào)節(jié)多種細胞信號途徑，精確控制磷酸化誘導(dǎo)的構(gòu)象狀態(tài)對于維持細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[76-77]。

磷酸化修飾對膜蛋白的調(diào)控機制在各種細胞信號通路中發(fā)揮作用，蛋白激酶催化翻譯后磷酸化修飾，同時許多激酶本身受磷酸化調(diào)控，這導(dǎo)致復(fù)雜的信號傳導(dǎo)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[78]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一種已知的參與磷酸化修飾級聯(lián)效應(yīng)激活信號通路的蛋白，MAPK的活性被認為是由活化環(huán)的氨基酸序列TxY中的雙磷酸化位點所調(diào)控，這些位點的雙磷酸化使MAPK的活性增加一千倍以上[79-80]。抑制素β-arrestin與磷酸化GPCR的結(jié)合控制著細胞信號傳導(dǎo)的多個環(huán)節(jié)。最近，分子動力學(xué)模擬和氨基酸位點突變研究發(fā)現(xiàn)，不同的GPCR磷酸化位點匹配不同的抑制蛋白結(jié)構(gòu)[81]，不同匹配模式?jīng)Q定具體的信號傳導(dǎo)途徑（圖3）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面的磷酸化修飾是一種廣泛存在的現(xiàn)象，在調(diào)節(jié)多種信號級聯(lián)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。微囊蛋白（caveolin-1）Tyr14的磷酸化參與整合素調(diào)節(jié)的細胞表面穴樣內(nèi)陷（caveolae）以及遷移細胞中粘著斑處的信號傳導(dǎo)[82]。對磷酸化修飾介導(dǎo)的信號通路研究，以及通過分子模擬或者結(jié)構(gòu)生物學(xué)可視化磷酸化膜蛋白特異構(gòu)象調(diào)控信號通路的機制，潛在具有重大臨床治療用途，特別是因為某些信號蛋白磷酸化異常修飾直接影響的癌細胞生存和侵襲。

2.3 介導(dǎo)膜蛋白的質(zhì)膜定位

膜蛋白的質(zhì)膜定位對基本信號傳導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程至關(guān)重要，而它們的異常定位往往導(dǎo)致嚴重的疾病癥狀或發(fā)育缺陷[83-84]。膜蛋白的亞細胞定位是由翻譯后修飾動態(tài)調(diào)節(jié)的，磷酸化修飾通過可逆性和快速動力學(xué)實現(xiàn)對膜蛋白質(zhì)膜定位的動態(tài)調(diào)節(jié)，主要發(fā)生在受體蛋白上具有分揀信號功能的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。膜蛋白磷酸化修飾由于磷酸基負電荷的引入還會影響其周圍磷脂分子的分布狀態(tài)，進而調(diào)控脂質(zhì)雙分子層的流動性。磷脂分子的分布狀態(tài)對于膜蛋白的質(zhì)膜定位，以及與磷脂的相互作用具有重要意義[13，32，85]。下文將引用相關(guān)研究闡述膜蛋白磷酸化對其質(zhì)膜定位的影響及生物功能調(diào)控。

Kristyna通過全原子動力學(xué)模擬對磷酸化和酸性脂質(zhì)如何影響GPCR成員β-腎上腺素（β2AR）的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)進行了研究[81]，結(jié)果顯示，位于胞內(nèi)環(huán)（ICL3）Ser246、Ser261和Ser262殘基的磷酸化，可驅(qū)動ICL3釋放至細胞質(zhì)與抑制素相互作用，但缺乏酸性脂質(zhì)的環(huán)境會逆轉(zhuǎn)磷酸化調(diào)控作用（圖3）。這一研究結(jié)果表明，受體磷酸化和膜環(huán)境協(xié)同調(diào)節(jié)GPCR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在K-Ras4B的C末端高變多堿基區(qū)域發(fā)現(xiàn)了PKC依賴性的Ser181磷酸化。高變區(qū)賴氨酸Lys側(cè)鏈的正電性銨（RNH3+）與Ser181磷酸化后形成的負電性氧之間形成氫鍵，導(dǎo)致C端與質(zhì)膜結(jié)合不穩(wěn)定，增加了質(zhì)膜的解離速率，誘導(dǎo)該蛋白從質(zhì)膜快速易位到內(nèi)膜，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜，使磷酸化的K-Ras與線粒體外膜上的Bcl-xL相互作用，參與細胞死亡調(diào)控[86-87]。磷酸化修飾還會導(dǎo)致K-Ras4B更依賴于膜的流動性環(huán)境，即更無序的脂質(zhì)，以實現(xiàn)有效的膜分配[88]。磷酸化Ser367可能驅(qū)動L-selectin胞質(zhì)尾從質(zhì)膜內(nèi)葉解吸附，以增強ERM的結(jié)合[66]。脂筏膜環(huán)境及脂筏相關(guān)蛋白內(nèi)收蛋白β（β-adducin）在β2整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的中性粒細胞遷移過程中起到重要的作用。通過免疫沉淀、免疫印跡等實驗發(fā)現(xiàn)，β-adducin與脂筏結(jié)構(gòu)的共定位是通過β-adducin分子上的酪氨酸殘基磷酸化調(diào)控的[89]。

2.4 參與腫瘤調(diào)控及靶向干預(yù)

磷酸化修飾對膜蛋白的生物功能影響非常廣泛，不僅調(diào)控膜蛋白自身或配體的結(jié)構(gòu)變化，介導(dǎo)膜蛋白的內(nèi)在活性，還可通過質(zhì)膜定位和復(fù)合物形成影響細胞信號傳導(dǎo)。磷酸化是參與調(diào)節(jié)激酶表達最常見的翻譯后修飾，磷酸化位點突變可導(dǎo)致激酶信號通路的異常激活或失調(diào)，這是多種腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，使用激酶抑制劑對于腫瘤治療具有重要價值[90]。目前，許多激酶抑制劑已成功用于治療乳腺癌、慢性粒細胞白血病、急性粒細胞白血病和非小細胞肺癌[91]。因此，分析蛋白質(zhì)磷酸化和相關(guān)酶活性已成為癌癥治療中的重要內(nèi)容。有研究通過質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）技術(shù)，揭示了表皮生長因子（EGF）聯(lián)合吉非替尼誘導(dǎo)表皮生長因子受體（EGFR）S1166位點磷酸化，能夠明顯抑制肺癌細胞的生長增殖，該研究有效地證明了通過磷酸化位點實現(xiàn)肺癌靶向治療的可能[92]。隨著靶向質(zhì)譜分析技術(shù)的進步，磷酸化蛋白還可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在生物標志物，根據(jù)磷酸化程度描述疾病狀態(tài)[93]。例如，高分子量神經(jīng)絲蛋白磷酸化用于表征克雅氏癥的病理狀態(tài)[94]；酸性富脯蛋白和組胺素可作為自閉癥的標志物[95]。從阿爾茲海默癥患者腦中提取的Tau蛋白發(fā)現(xiàn)其磷酸化程度明顯增加，因此，大多靶向Tau治療阿爾茲海默癥的方法旨在抑制“病理誘導(dǎo)”激酶或靶向病理磷酸化位點[96]?；诹姿峄閷?dǎo)膜蛋白功能表達以及靶向阻斷磷酸化引發(fā)的病理通路研究，具有重要的臨床治療用途。

3 總結(jié)及展望

膜蛋白磷酸化修飾的物理化學(xué)效應(yīng)非常多樣，本文依據(jù)最近的實驗和計算模擬研究回顧了磷酸化修飾膜蛋白的分子基礎(chǔ)和研究現(xiàn)狀，闡述了磷酸化調(diào)控膜蛋白結(jié)構(gòu)的主要機制，包括磷酸化基團參與膜蛋白氫鍵網(wǎng)絡(luò)和鹽橋的形成或破壞，局部和整體水平對膜蛋白結(jié)構(gòu)的調(diào)控，以及磷酸化修飾誘導(dǎo)膜蛋白失活–活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變。研究表明，磷酸化膜蛋白的結(jié)構(gòu)與其生物功能的正常發(fā)揮以及細胞穩(wěn)態(tài)的維持息息相關(guān)。其介導(dǎo)的生物功能主要包括：磷酸化誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化會作為分子開關(guān)，控制不同生物反應(yīng)中的膜蛋白活性，進而影響與其它蛋白的結(jié)合模式；磷酸化修飾誘導(dǎo)構(gòu)象的精確轉(zhuǎn)換直接影響膜蛋白下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的選擇；磷酸化修飾影響膜蛋白在質(zhì)膜上的準確定位，磷酸化和天然酸性脂質(zhì)協(xié)同調(diào)節(jié)膜蛋白的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)等其它生理過程。翻譯后磷酸化修飾是膜蛋白功能調(diào)控的重要方式，其調(diào)控形式極其多樣，與諸多疾病密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明膜蛋白磷酸化修飾位點的異常表達與腫瘤的代謝調(diào)控之間存在密切聯(lián)系[97]，這為腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制研究和靶向治療領(lǐng)域提供了一系列有價值的創(chuàng)新性研究思路。

在過去的十年，越來越多的整合膜蛋白結(jié)構(gòu)已通過X射線、核磁共振及冷凍結(jié)晶等手段進行揭示[98-100]，極大地提升了我們對整合膜受體信號傳遞過程的理解水平。然而，晶體結(jié)構(gòu)代表晶格中靶蛋白的靜態(tài)快照，觀察到的構(gòu)象可能不是脂質(zhì)雙層中的主要狀態(tài)。由于膜蛋白所處位置的特殊性，傳統(tǒng)生物技術(shù)實驗也很難排除周圍脂質(zhì)的干擾，探究磷酸化調(diào)控膜蛋白結(jié)構(gòu)動態(tài)變化還存在一定的挑戰(zhàn)。計算模擬研究在闡明磷酸化修飾的原理和機制方面發(fā)揮核心作用，有助于彌合磷酸化膜蛋白結(jié)構(gòu)與磷酸化修飾膜蛋白功能之間的差距[101-103]。使用計算機策略來研究膜蛋白結(jié)構(gòu)，使我們能夠進一步理解膜蛋白如何執(zhí)行其不同的功能，同時幫助開發(fā)新的預(yù)測工具探測特征的折疊[104]。人們曾多次嘗試預(yù)測由磷酸化或去磷酸化事件引起的結(jié)構(gòu)重排，這種分析可以確定控制磷酸化和非磷酸化狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變的潛在機制[105]。盡管目前已有大量與翻譯后磷酸化修飾相關(guān)的研究，但在大多數(shù)情況下，磷酸化的特定位點在膜蛋白功能中發(fā)揮的具體作用知之甚少。獲得的結(jié)構(gòu)信息有限，部分原因是磷酸化等翻譯后修飾的存在，蛋白特性也可能存在潛在的異質(zhì)性。在不同時空條件下，磷酸化修飾如何誘導(dǎo)其他膜蛋白的構(gòu)象變化，如何影響膜蛋白與配體分子的相互作用，如何選擇性的調(diào)控下游細胞效應(yīng)應(yīng)答等作用機制，對于發(fā)現(xiàn)基于磷酸化修飾的普適性調(diào)控機制具有重要意義。距離完全理解內(nèi)在的分子機制還有很長的路要走，探究各種類型膜蛋白的磷酸化調(diào)控機制將會長期作為翻譯后修飾研究領(lǐng)域的重點。

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