于媛芳,趙啟文,李 振

(臨沂大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,山東 臨沂 276000)

0 引言

痛風(fēng)是一種代謝性疾病,危害嚴(yán)重,近年來患病率呈上升趨勢。其主要病因分為兩類,即尿酸排泄減少及尿酸生成增多所致。而高尿酸又與多種疾病密切相關(guān),治療痛風(fēng)、預(yù)防痛風(fēng)復(fù)發(fā)的重要措施為降低血尿酸水平[1]。尿酸生成過程中的關(guān)鍵是酶黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)[2],其主要存在于哺乳動物的乳汁和肝臟中。人體內(nèi),黃嘌呤氧化酶(XOD)的主要作用是作為催化劑催化次黃嘌呤,通過氧化作用轉(zhuǎn)化為黃嘌呤,最終轉(zhuǎn)化生成尿酸。當(dāng)XOD活性較高時,尿酸在血液中含量增多,高于正常值,臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥,并隨著尿酸鹽的不斷沉積引發(fā)痛風(fēng)。

目前臨床上,別嘌呤醇是主要的XOD抑制劑,但其存在嚴(yán)重的毒副作用,約2%的患者對此藥物過敏,3%～10%的患者在治療過程中會出現(xiàn)不良反應(yīng),這限制了其臨床應(yīng)用[3]。本研究選取12種中藥單體進(jìn)行體外實驗,挑選出在體外具有較強(qiáng)抑制率的中藥單體并進(jìn)行小鼠體內(nèi)實驗,篩選出在體外體內(nèi)均有高抑制率的單體,以期為抗痛風(fēng)藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實驗耗材及儀器

1.1 試藥

KH2PO4、K2HPO4·3H2O、EDTA-2Na、黃嘌呤(Xanthine,XA)、黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)、別嘌醇(Allopμrinol)、木犀草素、紫草素、異綠原酸A、鞣花酸、沒食子酸、木犀草苷、原花青素、秦皮素、槲皮苷、丹酚酸B、金絲桃苷、槲皮素。

1.2 儀器

電子天平(萬分之一)、數(shù)控超聲波清洗器、容量瓶、酶標(biāo)儀、移液槍、96孔板。

2 實驗方法

2.1 溶液配制

緩沖液的配制:精密稱取KH2PO40.478 0 g、K2HPO4·3H2O 3.473 0 g及EDTA-2Na10.00 mg,置于250 mL容量瓶中用蒸餾水定容即得。

黃嘌呤底物的配制:精密稱取1.825 mg黃嘌呤,加入緩沖液,定至25.00 mL,超聲溶解即得。黃嘌呤溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配,以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

XOD溶液的配制:取XOD(規(guī)格9 Μ/mg)精密稱取0.001 9 mg,用150.00 mL緩沖液稀釋,制備5 Μ/mL黃嘌呤氧化酶溶液。

中藥單體溶液的配制:用萬分之一天平精密稱取0.005 0 g各中藥單體,選用合適的溶劑,分別配制100.00、50.00、25.00 μg/mL中藥單體溶液。

2.2 加樣

反應(yīng)體系總體積為200 μL,反應(yīng)時先加緩沖液,加入藥物和XOD,37 ℃孵育10 min,孵育完畢后再加入黃嘌呤,立刻啟動酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測。

2.3 計算公式

3 實驗結(jié)果

3.1 木犀草素對XOD的影響

木犀草素對黃嘌呤氧化酶的抑制作用隨著濃度的增加抑制率逐漸加強(qiáng),當(dāng)濃度為100 μg/mL時,抑制率達(dá)到74.48%,明顯高于別嘌醇40.13%;IC50為59.52 μg/mL,明顯低于別嘌醇108.69 μg/mL。實驗結(jié)果與郝悅等(2019)采用改良的HPLC法測定木犀草素對黃嘌呤氧化酶抑制率結(jié)果一致[3]。木犀草素能夠影響XOD活性中心的形成,進(jìn)而使酶的催化活性降低[5]。

圖1 木犀草素對XOD抑制率的影響Fig.1 Effect of luteolin on the inhibitory rate of XOD

3.2 金絲桃苷對XOD的影響

金絲桃苷的抑制作用較弱且變化趨勢不明顯,最高抑制率為13.79%。與王敏等(2022)報道的金絲桃苷IC50值為(162.059±2.291)μmol/L的結(jié)果差異較大[6]。

圖2 金絲桃苷對XOD抑制率的影響Fig.2 Effect of hyperin on the inhibitory rate of XOD

3.3 沒食子酸對XOD的影響

沒食子酸濃度25～100 μg/mL,最高抑制率可達(dá)21.24%。沒食子酸濃度分別為5、10、15、25、50 μmol/L時,其抑制率為15%～20%,與報道結(jié)果吻合[7]。但隨著沒食子酸濃度的增加,對黃嘌呤氧化酶的抑制作用下降。

圖3 沒食子酸對黃嘌呤氧化酶抑制率的影響Fig.3 Effect of gallic acid on the inhibition rate of Xanthine oxidase

3.4 秦皮素對XOD的影響

秦皮素濃度分別為25、50、100 μg/mL時,最高抑制率為8.81%,隨著濃度的升高,抑制作用減弱。

圖4 秦皮素對XOD抑制率的影響Fig.4 Effect of aesculin on the inhibitory rate of XOD

3.5 異綠原酸A對XOD的影響

異綠原酸A濃度分別為25、50、100 μg/mL時,最高抑制率為13.15%,且濃度越高,抑制作用越低。

3.6 槲皮素對XOD的影響

槲皮素具有較強(qiáng)的抑制作用,隨著藥物濃度的升高,抑制率不斷增強(qiáng),當(dāng)濃度為100 μg/mL時,抑制率為50.45%;IC50為94.34 μg/mL,抑制作用優(yōu)于別嘌醇,與郝悅等(2019)報道結(jié)果基本一致[3]。槲皮素通過氫鍵結(jié)合到XOD活性中心的鉬原子周圍,阻礙了底物黃嘌呤進(jìn)入XOD活性中心,從而抑制了XOD對黃嘌呤的催化活性[8]。

圖5 異綠原酸A對XOD抑制率的影響Fig.5 Effect of isochlorogenic acid A on the inhibitory rate of XOD

圖6 槲皮素對XOD抑制率的影響Fig.6 Effect of quercetin on the inhibitory rate of XOD

3.7 紫草素對XOD的影響

紫草素對黃嘌呤氧化酶的抑制作用很弱,當(dāng)濃度為100 μg/mL時,抑制率為9.23%,遠(yuǎn)低于別嘌醇。

圖7 紫草素對黃嘌呤氧化酶的抑制率Fig.7 Inhibition rate of xanthine oxidase by shikonin

3.8 原花青素對黃嘌呤氧化酶的影響

原花青素對黃嘌呤氧化酶的抑制作用極弱,最高抑制率為4.21%。

圖8 原花青素對XOD抑制率的影響Fig.8 Effect of proanthocyanidin on the inhibition rate of XOD

3.9 槲皮苷對XOD的影響

槲皮苷的抑制作用隨著濃度的升高抑制率不斷增強(qiáng),最高抑制率為32.41%,抑制作用較為明顯,IC50為135.14 μg/mL。槲皮苷類屬于黃酮類物質(zhì),對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用較強(qiáng)[9]。

圖9 槲皮苷對XOD抑制率的影響Fig.9 Effect of proanthocyanidin on the inhibition rate of XOD

3.10 木犀草苷對XOD的影響

木犀草苷的抑制作用隨著濃度的升高抑制率不斷增強(qiáng),當(dāng)濃度為100 μg/mL時,抑制率為32.35%,抑制作用較別嘌醇弱,IC50為156.25 μg/mL。

圖10 木犀草苷對XOD的抑制率的影響Fig.10 Effect of luteolin on the inhibitory rate of XOD

3.11 丹酚酸B對XOD的影響

丹酚酸B對黃嘌呤氧化酶的抑制作用較弱,當(dāng)濃度為100 μg/mL時,抑制率為7.67%,抑制作用遠(yuǎn)低于別嘌醇。

圖11 丹酚酸B對XOD抑制率的影響Fig.11 Effect of salvianolic acid B on the inhibitory rate of XOD

3.12 鞣花酸對XOD的影響

鞣花酸的抑制率隨著濃度的升高抑制率增加,當(dāng)濃度為100.00 μg/mL時,抑制率為35.30%,IC50為125 μg/mL,但作用效果低于別嘌醇。

圖12 鞣花酸對XOD抑制率的影響Fig.12 Effect of ellagic acid on the inhibitory rate of XOD

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明,木犀草素、木犀草苷、槲皮素、槲皮苷、鞣花酸、別嘌醇的濃度為100 μg/mL時,對黃嘌呤氧化酶抑制率分別為74.48%、32.35%、50.45%、32.41%、35.30%、40.13%,IC50分別為59.52、156.25、94.34、135.14、125.00、108.69 μg/mL。木犀草素、槲皮素對XOD抑制作用較強(qiáng),高于別嘌醇,可作為XOD抑制劑進(jìn)一步探討其在體內(nèi)降尿酸、抗痛風(fēng)的效果及作用機(jī)制。