張 威，祁進(jìn)康，李晉芳，胡世俊，閆曉慧

（西南林業(yè)大學(xué)，a.生物多樣性保護(hù)學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.林學(xué)院/西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650233）

薇甘菊（Mikania micranthaH.B.K）是菊科假澤蘭屬植物，原產(chǎn)熱帶南美洲，已在世界上許多國(guó)家發(fā)生和分布。薇甘菊是一種危害性極大的農(nóng)林雜草，由于其較強(qiáng)的攀援、繁殖擴(kuò)散能力，可致使其他樹(shù)木枯死，素有“植物殺手”之稱，被列為世界上最具危害性的100 種外來(lái)入侵物種之一［1，2］。在中國(guó)，薇甘菊于1919 年在香港出現(xiàn)，后逐漸蔓延至華南其他地區(qū)。薇甘菊在其原產(chǎn)地被廣泛用作傳統(tǒng)民間草藥，可治療腳氣、皮膚瘙癢、蛇咬傷等疾病［3］，其次生代謝產(chǎn)物豐富，包括單萜、倍半萜、二萜、三萜、黃酮、甾體等多種結(jié)構(gòu)類型［4］。已有研究表明薇甘菊粗提物具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等作用［5，6］；許華等［7］研究發(fā)現(xiàn)薇甘菊粗提物對(duì)黃瓜枯萎病菌等農(nóng)業(yè)病原菌有一定的抑制效果；祝木金等［8］、郝彩琴等［9］研究發(fā)現(xiàn)，薇甘菊乙酸乙酯提取物對(duì)蘋果炭疽病、番茄灰霉病、小麥赤霉病等植物病原菌真菌菌絲的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。上述研究表明，薇甘菊粗提物具有抗植物病原真菌活性，而粗提物中具體的抗菌成分值得進(jìn)一步研究。

核桃（Juglans regia）又稱胡桃，是一種世界性分布的重要“木本糧油”生態(tài)樹(shù)種。中國(guó)是核桃的產(chǎn)地之一，其種植面積和產(chǎn)量居世界前列。中國(guó)核桃產(chǎn)區(qū)普遍受到黑斑病、炭疽病及枯枝病等病害的危害［10-12］，嚴(yán)重影響核桃的品質(zhì)和質(zhì)量，且隨著中國(guó)核桃種植面積逐漸增加，病害發(fā)生日趨嚴(yán)重。核桃病害防治仍依賴化學(xué)藥劑，但隨著人們對(duì)綠色無(wú)污染食品的需求和生態(tài)環(huán)保意識(shí)的提高，植物源殺菌劑已成為核桃病害防治的重要發(fā)展方向之一。馮小飛等［13］、譚亞婷等［14］研究發(fā)現(xiàn)飛機(jī)草、小飛蓬、波斯菊等菊科植物提取物對(duì)核桃病原真菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制效果，發(fā)掘了菊科植物在植物源殺菌劑方面的潛能。

本研究采用平皿法，以6 種核桃病原真菌為篩選模型，通過(guò)活性追蹤不同溶劑萃取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，發(fā)現(xiàn)抑制活性成分集中于乙酸乙酯萃取物中，進(jìn)一步對(duì)該部分進(jìn)行化合物的分離純化，并進(jìn)行了分離化合物的抑菌活性研究。本研究將為薇甘菊的綜合開(kāi)發(fā)利用提供新的依據(jù)，通過(guò)發(fā)掘薇甘菊在植物源殺菌劑方面的潛能，力求變廢為寶，變害為利，為薇甘菊的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

1.1.1 供試植物來(lái)源 薇甘菊地上部分于2016 年8月采自云南省騰沖市，由西南林業(yè)大學(xué)胡世俊副教授鑒定。

1.1.2 供試菌株來(lái)源 供試菌株由采自云南省楚雄市、大理白族自治州等地發(fā)病的核桃病理組織中分離得到，分別為炭疽菌（Colletotrichumsp.）、擬莖點(diǎn)霉（Phompsissp.）、葉點(diǎn)霉（Phyllostictasp.）、鏈格孢（Alternariasp.）、殼二孢（Ascochytasp.）及殼梭孢（Fusicoccumsp.），均由西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳玉惠教授提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；DL-1 型萬(wàn)用電爐，天津市賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；正相色譜硅膠，青島海洋化工廠；ZF-6 型三用紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；WPL-230BE 型恒溫電熱培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；無(wú)菌超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；Bruker DRX 500 型核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司。

1.2.2 試劑 多菌靈，四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司；MCI 小孔樹(shù)脂、40~70 μm 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20，瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB 公司；工業(yè)純硫酸、分析純乙醇、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)于云南楊林汕滇藥業(yè)有限公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、三氯甲烷、甲醇、乙腈均購(gòu)于昆明鍇泰納工貿(mào)有限公司；氘代氯仿、氘代丙酮均購(gòu)于美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories 公司。

1.3 提取與分離

稱取薇甘菊地上部分13.50 kg，風(fēng)干粉碎，甲醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得到甲醇提取物浸膏，水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓濃縮后得到石油醚萃取物300.00 g、乙酸乙酯萃取物120.15 g 和正丁醇萃取物213.00 g?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物對(duì)核桃病原菌的抑制活性較好，因此進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯萃取物的化學(xué)成分進(jìn)行活性追蹤。乙酸乙酯萃取物用丙酮溶解后，經(jīng)硅膠柱層析，依次用石油醚-丙酮（1∶0~0∶1，V/V）梯度洗脫，濃縮得到5 個(gè)餾分：Fr1（1.76 g）、Fr2（1.94 g）、Fr3（2.34 g）、Fr4（26.58 g）和Fr5（19.40 g）。Fr3 經(jīng)MCI 色譜柱10%~95%甲醇溶液分離后，經(jīng)葡聚糖凝膠色譜柱（三氯甲烷∶甲醇=1∶1，V/V）純化后重結(jié)晶析出白色針晶，為化合物1（131.90 mg）；Fr4 經(jīng)MCI 色譜柱10%~95%甲醇溶液分離后，采用硅膠柱色譜分離，以氯仿-丙酮（1∶0~0∶1，V/V）洗脫，分成7 個(gè)亞部分，為Fr4-1 至Fr4-7，其中，F(xiàn)r4-1 經(jīng)重結(jié)晶析出白色不規(guī)則晶體，為化合物2（171.20 mg）；Fr4-3 經(jīng)葡聚糖凝膠色譜柱（三氯甲烷∶甲醇=1∶1，V/V）純化為黃色不定形粉末，為化合物4（60.00 mg）；Fr4-4 經(jīng)液相色譜柱乙腈∶水（50∶50，V/V）分離純化為白色針狀結(jié)晶，為化合物3（93.00 mg）；Fr5 經(jīng)MCI 色譜柱10%~95%甲醇溶液分離后，經(jīng)葡聚糖凝膠色譜柱（三氯甲烷∶甲醇=1∶1，V/V）純化后重結(jié)晶析出淡黃色針狀晶體，為化合物5（19.50 mg）。

1.4 薇甘菊化學(xué)成分抑菌活性測(cè)定

精確稱取供試粗提物及化合物，采用二甲基亞砜將提取物配制成100.0 mg/mL，化合物配制成2.0 mg/mL 的母液，過(guò)濾除菌后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用平皿法?5］測(cè)定薇甘菊甲醇提取物、不同萃取物及分離得到5 個(gè)化合物的抑菌活性。PDA 培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃以下，準(zhǔn)確吸取一定量母液加入培養(yǎng)基中，粗提物稀釋至1 mg/mL，單體化合物稀釋至100 μg/mL 迅速搖勻倒平板，冷卻后制成含藥平板。用打孔器在供試菌種邊緣打直徑為4 mm 的菌餅，用鑷子將菌餅接入平板中央，每皿放置1 個(gè)菌餅，將處理好的培養(yǎng)皿置于28 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。根據(jù)式（1）和式（2）計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.5 薇甘菊化學(xué)成分毒力測(cè)定

將薇甘菊提取物母液加入熔化冷卻至50 ℃的PDA 培養(yǎng)基，混勻，制備提取物含量為0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL 的PDA 平板；同樣，制備單體化合物濃度為25、50、100、200 μg/mL 的PDA 平板，以加入等梯度的等體積DMSO 為對(duì)照，每個(gè)處理共5 個(gè)重復(fù)，接種與培養(yǎng)方式同“1.4”。采用幾率值分析法，以藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（x），抑菌活性概率為縱坐標(biāo)（y），采用數(shù)據(jù)軟件繪制毒力曲線，求得毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)，計(jì)算EC50，對(duì)不同粗提物、化合物的毒力大小進(jìn)行比較。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Excel 2010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用SPSS 17.0 軟件（One-Way ANOVA，Duncan post hoc testP＜0.05）進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針狀結(jié)晶；ESI+MS：m/z412［M+H］+，確定分子質(zhì)量為412 u；分子式為C29H48O；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：5.35（1H，m，-OH），5.14（1H，m，H-22），5.01（1H，m，H-23），3.52（1H，m，H-3），1.02（3H，s，H-21），1.00（3H，s，H-19），0.80（3H，d，J=7.6 Hz，H-29），0.78（3H，d，J=11.5 Hz，H-27），0.67（3H，d，J=9.2 Hz，H-18）；13C NMR（CDCl3，500 MHz）δ：36.1（d，C-1），36.5（d，C-2），71.8（d，C-3），42.3（t，C-4），140.8（s，C-5），121.7（d，C-6），31.9（q，C-7），31.7（t，C-8），50.2（d，C-9），37.3（t，C-10），21.2（t，C-11），40.5（s，C-12），42.2（t，C-13），56.9（d，C-14），24.4（t，C-15），29.0（t，C-16），56.0（d，C-17），12.1（q，C-18），19.4（q，C-19），39.7（s，C-20），21.1（q，C-21），138.4（d，C-22），129.3（d，C-23），51.3（d，C-24），29.7（t，C-25），21.1（t，C-26），19.0（q，C-27），25.4（t，C-28），12.3（q，C-29）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1 為豆甾醇。

化合物2：白色不規(guī)則晶體；ESI+MS：m/z291［M+H］+，確定分子質(zhì)量為290 u；分子式為C15H14O6；1H NMR（CD3COCD3，500 MHz）δ：7.62（1H，d，J= 1.8 Hz，H-3），6.24（2H，d，J= 3.6 Hz，H-13），4.48（1H，dd，J= 3.1，6.0 Hz，H-6），2.28（1H，d，J= 16.9 Hz，H-1），2.25（2H，dd，J=11.0，2.5 Hz，H-9），1.12（3H，s，H-14）；13C NMR（CD3COCD3，500 MHz）δ：58.4（d，C-1），56.3（d，C-2），50.8（d，C-3），130.9（s，C-4），149.3（d，C-5），84.3（d，C-6），51.1（d，C-7），77.4（d，C-8），43.7（t，C-9），57.9（s，C-10），139.6（s，C-11），168.2（s，C-12），122.2（t，C-13），21.6（q，C-14），171.3（s，C-15）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17-19］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2 為薇甘菊內(nèi)酯。

化合物3：白色針狀結(jié)晶；ESI+MS：m/z299［M+ Na］+，確定分子質(zhì)量為276 u；分子式為C15H16O5；1H NMR（CD3COCD3，500 MHz）δ：7.78（1H，brs，H-5），5.44（1H，brs，H-6），4.81（1H，m，H-8），3.49（2H，d，J= 1.5 Hz，H-2），1.15（3H，s，H-14）；13C NMR（CD3COCD3，500 MHz）δ：61.9（d，C-1），23.7（t，C-2），22.3（t，C-3），149.6（d，C-5），82.8（d，C-6），50.7（d，C-7），78.5（d，C-8），44.3（t，C-9），57.3（s，C-10），133.1（s，C-11），138.8（s，C-12），22.2（t，C-12），172.6（s，C-13），20.5（q，C-14），168.4（s，C-15）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3 為去氧薇甘菊內(nèi)酯。

化合物4：黃色不定形粉末；ESI+MS：m/z353［M + Na］+，確定分子質(zhì)量為330 u；分子式為C17H14O6；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：8.54（2H，dd，J=8.8，8.8 Hz，H-2′，6′），6.77（1H，s，H-8），3.98（3H，s，7-OCH3），3.86（3H，s，6-OCH3）；13C NMR（CDCl3，500 MHz）δ：123.8（d，C-1′），148.1（s，C-2），130.7（d，C-2′，6′），138.0（s，C-3），116.5（d，C-3′，5′），177.6（s，C-4），159.3（s，C-4′），152.7（s，C-5），132.4（s，C-6），161.0（s，C-7），91.2（d，C-8），152.5（s，C-9），105.8（S，C-10），56.4（q，6-OCH3），60.7（q，7-OCH3）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4 為異澤蘭素。

化合物5：淡黃色針狀結(jié)晶；ESI+MS：m/z339［M + Na］+，確定分子質(zhì)量為316 u；分子式為C16H12O7；1H NMR（CD3COCD3，500 MHz）δ：7.49（1H，dd，J= 2.2，7.7 Hz，H-6′），7.46（1H，d，J= 2.3 Hz，H-2′），6.98（2H，d，J=8.3 Hz，H-3′，5′），6.59（1H，s，H-8），6.57（1H，s，H-3），3.86（3H，s，6-OCH3）；13C NMR（CD3COCD3，500 MHz）δ：123.8（s，C-1′），165.2（s，C-2），114.1（d，C-2′），103.6（d，C-3），146.4（s，C-3′），183.5（s，C-4），150.0（s，C-4′），154.0（s，C-5），116.6（d，C-5′），132.1（s，C-6），120.1（d，C-6′），157.5（s，C-7），94.6（d，C-8），153.9（s，C-9），105.7（s，C-10），60.6（q，6-OCH3）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［22］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5 為澤蘭黃酮。

化合物1 至化合物5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 化合物1 至化合物5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 薇甘菊粗提物的抑菌活性

采用平皿法測(cè)定了薇甘菊粗提物對(duì)6 種核桃病原真菌的菌絲生長(zhǎng)抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，薇甘菊甲醇提取物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物對(duì)葉點(diǎn)霉均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，抑菌率為17.82%~40.59%，其中，正丁醇萃取物對(duì)葉點(diǎn)霉的抑菌作用最強(qiáng)，顯著高于其他粗提物；正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物對(duì)炭疽菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其中，乙酸乙酯萃取物對(duì)炭疽菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑制率高達(dá)40.00%，顯著高于其他粗提物；甲醇提取物對(duì)炭疽菌無(wú)抑菌活性；薇甘菊各粗提物對(duì)鏈格孢的抑菌活性差異顯著，其中，甲醇提取物對(duì)鏈格孢的抑菌作用最強(qiáng)，顯著高于其他粗提物，石油醚萃取物對(duì)鏈格孢的抑菌作用最差；各粗提物對(duì)殼梭孢的抑菌活性均較弱，抑菌率為0.39%~21.82%；甲醇提取物對(duì)擬莖點(diǎn)霉的抑菌作用最強(qiáng)，正丁醇萃取物對(duì)擬莖點(diǎn)霉無(wú)抑菌活性。上述結(jié)果表明，薇甘菊對(duì)供試6 種核桃病原菌的抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物中，因此，對(duì)乙酸乙酯萃取物的抑菌成分進(jìn)行研究。

表1 薇甘菊提取物對(duì)6 種核桃病原菌的抑菌活性（單位：%）

2.3 薇甘菊粗提物對(duì)供試病原菌的毒力

對(duì)核桃病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性的初篩結(jié)果表明，薇甘菊乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對(duì)供試病原菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用。進(jìn)一步用濃度梯度法測(cè)定不同濃度的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物分別對(duì)炭疽菌、葉點(diǎn)霉菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，并建立濃度與抑制活性的回歸方程，分析2 種萃取物對(duì)2種核桃病原真菌的毒力。由圖2、表2 可知，不同濃度薇甘菊乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對(duì)供試病原菌的抑制率差異顯著。在濃度為2.00 mg/mL 時(shí)，薇甘菊乙酸乙酯萃取物對(duì)炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率可達(dá)63.89%，EC50為1.250 00 mg/mL；正丁醇萃取物對(duì)葉點(diǎn)霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率為53.85%，EC50為1.660 000 mg/mL。毒力測(cè)定以多菌靈為陽(yáng)性對(duì)照，其對(duì)炭疽菌的EC50為0.000 78 mg/mL，對(duì)葉點(diǎn)霉的EC50為0.000 49 mg/mL，毒力均高于薇甘菊萃取物。

表2 薇甘菊粗提物對(duì)供試菌株的相對(duì)毒力

圖2 不同濃度萃取物對(duì)供試菌株的抑制效果

2.4 化合物對(duì)供試病原菌的抑菌活性

從抑菌活性較好的乙酸乙酯萃取物分離純化，得到5 個(gè)量大的化合物，以這5 個(gè)化合物為供試化合物，測(cè)定其對(duì)6 種核桃病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性。結(jié)果（表3）表明，不同化合物對(duì)各病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率之間的差異顯著，5 個(gè)化合物具有較廣譜的抑菌活性。5 個(gè)化合物對(duì)殼梭孢均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，菌絲生長(zhǎng)抑制率為12.26%~59.77%，其中，化合物2 對(duì)殼梭孢的抑制作用最強(qiáng)，化合物3次之；5 個(gè)化合物對(duì)擬莖點(diǎn)霉均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性，其中，化合物2 對(duì)擬莖點(diǎn)霉的抑制作用最強(qiáng)，抑制率高達(dá)62.65%，顯著高于其他化合物，其次為化合物3。各化合物對(duì)殼二孢、葉點(diǎn)霉、炭疽菌、鏈格孢的抑菌活性強(qiáng)弱表現(xiàn)為化合物2＞化合物3＞其他3 個(gè)化合物（化合物1、化合物4、化合物5）。表明化合物2 和化合物3 對(duì)6 種核桃病原菌均表現(xiàn)出較好的抑菌作用，對(duì)擬莖點(diǎn)霉菌絲生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)。

表3 化合物對(duì)6 種核桃病原真菌的抑菌活性（單位：%）

2.5 化合物對(duì)供試病原菌的毒力分析

進(jìn)一步以抑菌活性較好的3 個(gè)量大的化合物2、化合物3、化合物5 為供試化合物，測(cè)定其對(duì)核桃病原真菌的抑菌毒力，結(jié)果（圖3、表4、圖4）表明，不同化合物對(duì)核桃病原真菌的毒力存在顯著差異，且隨著濃度的增加，5 個(gè)化合物的抑制效果均有所提高。在濃度為200 μg/mL 時(shí)，化合物2、化合物3 和化合物5 對(duì)擬莖點(diǎn)霉的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為71.33%、72.00%、53.00% μg/mL，EC50分別為60.62、89.13、190.55 μg/mL，毒力測(cè)定以多菌靈為陽(yáng)性對(duì)照藥劑，其對(duì)擬莖點(diǎn)霉的EC50為0.08 μg/mL，3 個(gè)化合物對(duì)擬莖點(diǎn)霉的毒力顯著低于陽(yáng)性對(duì)照。在濃度為200 μg/mL 時(shí)，化合物2、化合物3 對(duì)殼梭孢菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為72.84%、71.60%，EC50分別為43.65、61.66 μg/mL；化合物2 對(duì)葉點(diǎn)霉、殼二孢、炭疽菌菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)出較好的抑制作用，抑制率為53.06%~60.67%，其EC50分別為218.78、144.54、138.04 μg/mL，毒力測(cè)定以多菌靈為陽(yáng)性對(duì)照，其對(duì)葉點(diǎn)霉的EC50為0.49 μg/mL，對(duì)殼二孢的EC50為0.07 μg/mL，對(duì)殼梭孢的EC50為14.79 μg/mL，對(duì)炭疽菌的EC50為0.78 μg/mL，對(duì)擬莖點(diǎn)霉的EC50為0.08 μg/mL，毒力均高于從薇甘菊乙酸乙酯提取物中分離的3 個(gè)化合物。

表4 化合物對(duì)供試菌株的相對(duì)毒力

3 小結(jié)與討論

本研究對(duì)薇甘菊粗提物及從中分離的化合物的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，薇甘菊粗提物及其化合物對(duì)供試的6 種核桃病原真菌菌絲生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，且呈明顯的劑量效應(yīng)，隨著粗提物、化合物濃度升高，抑菌率也相應(yīng)增大。研究發(fā)現(xiàn)，薇甘菊對(duì)供試6 種核桃病原菌的抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物中，可能是由于抑制核桃病原真菌的活性成分極性與乙酸乙酯極性相似。該萃取物經(jīng)多種柱層析技術(shù)分離純化得到5 個(gè)化合物，比較發(fā)現(xiàn)，化合物2 和化合物3 能夠有效抑制擬莖點(diǎn)霉、殼梭孢病原菌，抑制率為52.85%~62.65%，進(jìn)一步測(cè)定了化合物2、化合物3、化合物5 對(duì)幾種核桃病原真菌的抑菌毒力，化合物2（薇甘菊內(nèi)酯）對(duì)擬莖點(diǎn)霉的EC50為60.62 μg/mL，對(duì)殼梭孢的EC50為43.65 μg/mL；化合物3（去氧薇甘菊內(nèi)酯）對(duì)擬莖點(diǎn)霉的EC50為89.13 μg/mL、對(duì)殼梭孢的EC50為61.66 μg/mL，該結(jié)果與已報(bào)道的吉瑪烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物薇甘菊內(nèi)酯、去氧薇甘菊內(nèi)酯具有抗菌作用相吻合［23］。祝木金等［8］、郝彩琴等［9］研究發(fā)現(xiàn)，薇甘菊乙酸乙酯提取物對(duì)多種植物病原真菌菌絲的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。董麗梅［24］研究發(fā)現(xiàn)薇甘菊中的單體化合物主要為倍半萜和二萜類化合物，并且發(fā)現(xiàn)吉瑪烷型倍半萜內(nèi)酯對(duì)植物病原細(xì)菌青枯假單胞菌和萎蔫短小桿菌的抑制活性顯著。馬秋等［25］研究發(fā)現(xiàn)薇甘菊中吉瑪烷型倍半萜類化合物薇甘菊內(nèi)酯和二氫薇甘菊內(nèi)酯對(duì)綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等表現(xiàn)出抑菌作用。莊世宏等［26］從薇甘菊中分離得到4 種抑菌活性物質(zhì)，包括去氧薇甘菊內(nèi)酯、二氫薇甘菊內(nèi)酯、豆甾醇和β-谷甾醇，發(fā)現(xiàn)去氧薇甘菊內(nèi)酯和二氫薇甘菊內(nèi)酯對(duì)小麥紋枯病菌、辣椒疫霉病菌和棉花立枯病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)。綜上所述，推測(cè)薇甘菊抑菌活性成分主要為倍半萜類化合物，本研究發(fā)現(xiàn)薇甘菊內(nèi)酯、去氧薇甘菊內(nèi)酯對(duì)6 種核桃病原菌的抑制效果較其他3 個(gè)化合物顯著，與上述研究結(jié)果中倍半萜類物質(zhì)具有較強(qiáng)的生物活性一致，進(jìn)一步豐富了薇甘菊的抑菌生物活性譜，發(fā)掘了薇甘菊在植物源抑菌藥物方面的潛能。

本研究發(fā)現(xiàn)，從薇甘菊乙酸乙酯萃取物中分離到的薇甘菊內(nèi)酯、去氧薇甘菊內(nèi)酯對(duì)擬莖點(diǎn)霉、殼梭孢、殼二孢、葉點(diǎn)霉、炭疽菌及鏈格孢6 種核桃病原真菌的菌絲生長(zhǎng)都表現(xiàn)出了一定的抑制活性，說(shuō)明這2 個(gè)化合物對(duì)上述6 種病原真菌的菌絲體生長(zhǎng)造成一定的影響，阻礙其在培養(yǎng)基上的正常生長(zhǎng)。本研究明確了活性化合物的結(jié)構(gòu)和種類，為核桃病原菌的防治提供了參考，也為薇甘菊的資源化利用提供新的依據(jù)。