朱海濱，方 靜，唐木蘭，池鑫宇，曾春暉，楊 柯

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200）

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是由直接因素或間接因素（創(chuàng)傷、輸血和感染）引起的，導(dǎo)致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫和急性缺氧性呼吸功能不全［1，2］。ALI 以彌漫性急性肺部炎癥為主要病理特征，伴有先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的浸潤、促炎和抗炎細(xì)胞因子平衡的轉(zhuǎn)換［3，4］。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路已被報(bào)道參與ALI，在配體刺激TLR4 后，TLR4 觸發(fā)下游MyD88/NF-κB 信號，導(dǎo)致各種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加重肺損傷［5，6］。雙氫楊梅樹皮素（Ampelopsin，APS）作為藤茶中主要黃酮類成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保護(hù)心血管和增強(qiáng)免疫等作用［7，8］。另有研究發(fā)現(xiàn)，APS 在急性肺損傷和肺纖維化中發(fā)揮保護(hù)肺的作用［9-11］。然而，目前關(guān)于APS 在ALI 中發(fā)揮的作用及其具體機(jī)制尚不明確，因此本研究通過體內(nèi)急性肺損傷小鼠模型，研究APS 通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB 經(jīng)典炎癥信號通路在LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 6—8 周齡SPF 級KM 小鼠，雌雄各半，體重18~22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001。

1.1.2 主要試劑與儀器 雙氫楊梅樹皮素（純度≥98%，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）；脂多糖（北京索萊寶科技有限公司，貨號：L8880）；醋酸地塞米松（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：170761）；髓過氧化物酶測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20190717）；蘇木素染液（武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司，貨號：G1005-1）；伊紅染液（武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司，貨號：G1001）；小鼠TNF-α（欣博盛生物科技有限公司，批號：M191231-102a）；小鼠IL-1β（欣博盛生物科技有限公司，批號：M191231-001a）；TLR4 抗體（Thermo Fisher Scientic，貨號：MA5-16216）；MyD88 抗體（Thermo Fisher Scientic，貨號：MA5-15762）；IκBα 抗體（Thermo Fisher Scientic，貨號：MA5-15132）；p-IκBα 抗體（Thermo Fisher Scientic，貨號：MA5-15087）；p65 抗體（Thermo Fisher Scientic，貨號：33-9900）；p-p65 抗體（Thermo Fisher Scientic，貨號：MA5-15160）。Ani-Res2005 動物肺功能分析系統(tǒng)購自北京貝蘭博科技有限公司；Synergy H1 酶標(biāo)儀購自美國BioTek Instruments 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、給藥及急性肺損傷小鼠模型的構(gòu)建 取72 只健康KM 小鼠，按體重隨機(jī)分為6 組：正常（CON）組、模型（LPS）組（8 mg/kg）、陽性（DEX）組、APS 高（APS-H）劑量組、APS 中（APS-M）劑量組、APS 低（APS-L）劑量組，每組12 只，雌雄各半。APS-H、APS-M、APS-L 劑量組小鼠分別以APS 溶液（50、25、12.5 mg/kg）灌胃，4 次/d，即200、100、50 mg/kg；DEX組予以地塞米松溶液（7.5 mg/kg）灌胃；CON 組與LPS 組給予等量生理鹽水。第三天第一次給藥后1 h，0.4%戊巴比妥鈉溶液（0.15 mL/10 g）腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠仰臥位固定于木板上，調(diào)整到合適角度，照明燈照亮小鼠咽喉部位，隨后打開小鼠口腔，用壓舌板向下抵住小鼠舌頭以便于暴露氣道口，然后將LPS 溶液（40 μL/只）從氣管向肺內(nèi)注入，CON 組小鼠按照上述方法向氣管內(nèi)滴入40 μL無菌生理鹽水，并于造模后2、4、8 h 進(jìn)行后續(xù)給藥。

1.2.2 肺功能的檢測 小鼠腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/10 g）麻醉后，取仰臥位固定于木板上，行氣管插管后，將小鼠轉(zhuǎn)移至體描箱內(nèi)動態(tài)監(jiān)測小鼠呼吸狀態(tài)，設(shè)定呼吸機(jī)的呼吸頻率為90次/min，呼吸比為20∶10，待系統(tǒng)顯示小鼠自主呼吸消失，進(jìn)入平穩(wěn)階段后，記錄3 min 內(nèi)吸氣相氣道阻力（RL）和呼氣相氣道阻力（Re）的最小值、肺動態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）的平均值、每分鐘最大通氣量（MVV）的平均值，試驗(yàn)完成后停止采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行保存。

1.2.3 肺組織勻漿的制備和勻漿中髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性的檢測 摘取除左下肺以外50 mg 左右的肺組織在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，洗去血液后，濾紙吸干，稱重后迅速用眼科剪將肺組織剪碎，加入10 mL EP 管中。隨后加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)，勻漿介質(zhì)重量為肺組織的9 倍。EP 管置于冰上，將電動勻漿器伸入管內(nèi)進(jìn)行勻漿制備，機(jī)器每次工作10 s、休息30 s，如此反復(fù)3~5 次。制備好的勻漿液以10 000 r/min 離心10 min，所得上清液按MPO 測試盒說明書進(jìn)行MPO 活力測定。

1.2.4 ELISA 法檢測BALF 中炎癥因子（TNF-α、IL-1β）的含量 從-80 ℃中取出凍存的BALF 上清液，置于室溫下自然解凍，4 ℃下1 000 r/min離心15 min，取上清液，按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.2.5 肺組織病理學(xué)觀察 將小鼠左肺下葉組織固定于4%多聚甲醛溶液中，48 h 后進(jìn)行脫水、透明和石蠟包埋。用切片機(jī)作4 μm 厚切片，并進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)［12］進(jìn)行肺組織病理學(xué)評分（表1）。

表1 評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 Western blotting 檢測肺組織中TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65 蛋白表達(dá) 從-80 ℃中取出肺組織，解凍后剪碎，加入提取試劑（m∶V=1∶9），在冰上混合靜置30 min 后低溫快速勻漿，將勻好的肺組織勻漿液倒入1.5 mL EP 管，4 ℃下12 000 r/min離心20 min。取上清液，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，Loading buffer 試劑變性后保存于-80 ℃。利用Western blotting 檢測TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、p65 和p-p65 表達(dá)情況，應(yīng)用Gel Doc 2000 Gel Documentation System 成像，通過Image Lab 對膜上蛋白條帶進(jìn)行掃描和定量分析。蛋白表達(dá)量以條帶的調(diào)整體積值表示，β-actin 作為內(nèi)參，以目的條帶調(diào)整體積值與β-actin 調(diào)整體積值的比值對肺組織中目的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x+s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，P＜0.05（0.01）為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 APS 對LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺功能的影響

如表2 所示，LPS 氣管內(nèi)滴注后8 h，小鼠的吸氣阻力與呼氣阻力極顯著高于CON 組（P＜0.01），而APS-H、APS-M 和DEX 給藥后顯著降低吸氣阻力（P＜0.05），而對呼氣阻力無明顯影響（P＞0.05）；另外，LPS 滴注極顯著降低小鼠的肺動態(tài)順應(yīng)性與每分鐘最大通氣量（P＜0.01），而APS-H、APS-M 給藥后顯著提高小鼠肺動態(tài)順應(yīng)性和每分鐘最大通氣量（P＜0.05）。APS 可明顯改善LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的肺功能。

表2 小鼠肺功能指標(biāo)檢測情況表

2.2 APS 對LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠中MPO活力的影響

由圖1 可知，LPS 氣管內(nèi)滴注后，小鼠肺組織勻漿液中MPO 活力顯著升高（P＜0.05），而APS-H 和DEX 給藥可顯著降低MPO 活力（P＜0.05），APS 可明顯降低LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤程度。

圖1 小鼠肺組織中MPO 活力

2.3 APS 對LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織病理學(xué)的影響

由圖2 及表3 可知，LPS 滴注后，小鼠肺臟各級支氣管分支結(jié)構(gòu)不完整；肺泡上皮細(xì)胞空泡變性或壞死，胞質(zhì)染色不均或空泡化，胞核固縮或碎裂，少量細(xì)胞脫落于肺泡腔內(nèi)；肺泡間質(zhì)可見少量或多量核呈桿狀的中性粒細(xì)胞及圓形深染的淋巴細(xì)胞浸潤；肺組織病理評分極顯著升高（P＜0.01）；而APS 及DEX 給藥后，小鼠肺臟各級支氣管分支結(jié)構(gòu)較為正常；少量肺泡上皮細(xì)胞空泡變性或壞死，肺泡間質(zhì)可見少量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤；與LPS 組相比，DEX 組和APS 各劑量組肺臟病理評分，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 小鼠肺泡炎病理情況（HE 染色）（400×）

表3 肺臟損傷病理學(xué)分級評分統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 APS 對LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中炎癥因子釋放的影響

如圖3、圖4 所示，LPS 滴注后，小鼠BALF 中的TNF-α 和IL-1β 含量極顯著或顯著升高（P＜0.01、P＜0.05），而APS-H、APS-L 和DEX 給藥可極顯著降低BALF 中TNF-α 和IL-1β 的含量（P＜0.01），提示APS可明顯減輕LPS 誘導(dǎo)引起的炎癥反應(yīng)。

圖3 小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α 的含量

圖4 小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β 的含量

2.5 APS 對LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠中TLR4/MyD88/ NF-κB 信號通路的影響

由圖5 可知，LPS 滴注后，小鼠肺組織中TLR4、MyD88、p-IκB、p65 及p-p65 蛋白表達(dá)極顯著上調(diào)（P＜0.01），IκB 蛋白表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01），提示LPS 誘導(dǎo)激活了急性肺損傷小鼠體內(nèi)的TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路。而APS 及DEX 給藥后可顯著下調(diào)TLR4、MyD88、p-IκB、p65 及p-p65 蛋白表達(dá)（P＜0.05），上調(diào)IκB 蛋白表達(dá)（P＜0.05），提示APS給藥可明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠體內(nèi)TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的激活。

圖5 小鼠TLR4/MyD88/NF-κB 通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)情況

3 小結(jié)與討論

ALI 是一種嚴(yán)重的炎癥和損傷性疾病，可引起呼吸衰竭和肺功能受損，死亡率高達(dá)30%［12，13］。LPS被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建ALI 動物模型，能夠引起炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致肺損傷。LPS 刺激引起炎癥介質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)ALI 的發(fā)生［14］。本研究采用無創(chuàng)式氣管內(nèi)滴注LPS（8 mg/kg）復(fù)制急性肺損傷小鼠模型。通過檢測小鼠肺功能發(fā)現(xiàn)，LPS 氣管內(nèi)滴注提高了吸氣阻力和呼氣阻力，提示小鼠肺泡變窄肺容積降低，呼吸受阻；另外，LPS 滴注降低了肺動態(tài)順應(yīng)性和每分鐘通氣量，提示肺容積降低、肺臟彈性降低、肺功能通氣障礙。而APS 干預(yù)后可通過增大肺容積、增加肺部通氣量以及改善肺臟彈性等，緩解肺通氣功能能障礙，對呼吸功能有較大改善，對ALI小鼠肺功能具有保護(hù)作用。

中性粒細(xì)胞是感染、炎癥和組織損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞［15］。急性肺損傷的發(fā)生也常常伴隨著中性粒細(xì)胞浸潤［16］。本研究中檢測了MPO 活力來間接觀察中性粒細(xì)胞在LPS 誘導(dǎo)ALI 小鼠肺組織中的浸潤情況。MPO 主要存在于中性粒細(xì)胞中，與中性粒細(xì)胞的活化有很強(qiáng)的相關(guān)性，通常選擇MPO 作為中性粒細(xì)胞的活化標(biāo)志物［17］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 滴注后提高了小鼠肺組織中MPO 活力，而APS 干預(yù)后降低了MPO 活力，提示APS 干預(yù)可有效減輕LPS 誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的聚集和活化。研究表明，BALF 中促炎因子TNF-α、IL-1β 含量是評價(jià)肺部炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度的關(guān)鍵指標(biāo)［18］。通過進(jìn)一步的ELISA 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APS 給藥明顯降低BALF 中的TNF-α 以及IL-1β含量，提示APS 干預(yù)能夠有效地緩解LPS 刺激引起的肺部炎癥。

Toll 樣受體（TLRs）是一類模式識別受體家族，是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵元件［19］。其中TLR4 屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，位于胞膜外的結(jié)構(gòu)域可識別多種病原體，位于細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)則參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。MyD88 是TLR 信號通路上重要的接頭蛋白，可通過C 端的TIR 結(jié)構(gòu)域和膜受體的TIR 結(jié)構(gòu)域相互作用，向下游傳遞信號；MyD88 蛋白分子被激活后，依賴其N 端的“死亡結(jié)構(gòu)域”與白介素-1 受體相關(guān)激酶家族成員IRAK-1、IRAK-4 形成復(fù)合物；活化的IRAK-1 與TRAF-6 進(jìn)一步磷酸化，接著被激活的TRAF-6 與轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（TGF-β-activated kinase 1，TAK1）結(jié)合后，使得IKK 復(fù)合物磷酸化，從而導(dǎo)致IκB 發(fā)生磷酸化、泛素化，使靜息狀態(tài)下與IκB 結(jié)合的NF-κB 解離出來，導(dǎo)致NF-κB 活化入核，在核轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮其強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用，從而啟動炎癥基因的表達(dá)，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β 等促炎因子的合成與釋放，引起肺部炎癥級聯(lián)反應(yīng)［20］。本研究中LPS 滴注引起小鼠肺組織中TLR4 蛋白活化，導(dǎo)致下游接頭蛋白MyD88 的大量募集，IκB 蛋白發(fā)生磷酸化進(jìn)而降解，使得在靜息狀態(tài)下的NF-κB 解離出來，其亞基p65 蛋白及其磷酸化蛋白p-p65 表達(dá)升高，表明LPS 刺激激活了ALI 小鼠中TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路；而在APS 干預(yù)后，肺組織中TLR4、MyD88、p-IκBα、p65、p-p65 蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，并且IκBα 蛋白的降解受到抑制，表明APS 可通過抑制LPS 激活的TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路，從而減少TNF-α 和IL-1β 等促炎因子的釋放，降低肺部炎癥，改善急性肺損傷。然而，本研究還需要進(jìn)一步的體內(nèi)外試驗(yàn)來驗(yàn)證并完善APS 是通過TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路在ALI中發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究明確APS 在LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠中的保護(hù)作用，并且初步確定了APS 通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路，提高肺功能，減輕肺部炎癥，改善肺組織損傷。