王 聰，王 菡，張海玲，肖毅然，郭禹汐，劉夢迪，李浩菘，吳宗澄，段芙春，盧士英

（1.吉林大學動物醫(yī)學學院/人獸共患病研究教育部重點實驗室，長春 130112；2.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

早孕因子（Early pregnancy factor，EPF）［1］是在哺乳動物早期妊娠血清中檢測到的一種免疫抑制和生長調(diào)節(jié)的功能蛋白，是目前所知最早確認妊娠的生化指標之一，是判斷胚胎活力的標志［2］。精子與卵子結(jié)合后的幾個小時內(nèi)EPF 含量迅速增高，小鼠受精后6 h、牛24 h、人48 h 即可從母體內(nèi)檢測到具有活性的EPF，比人絨毛膜促性腺激素（hCG）的檢出時間較早［3］，但當母體未成功受精時不分泌EPF。早孕因子在不同物種中具有相同的特異性，但不同物種間分子質(zhì)量有很大差別，人體中EPF 分子質(zhì)量為21.5 ku［4］，與牛源序列完全一致［5］，懷孕母豬體內(nèi)EPF 分子質(zhì)量為20~450 ku，但是在不同物種中EPF蛋白存在一個共同點：含有102 個氨基酸殘基的多肽，是早孕因子的基本活性部分。Cheng 等［6］研究表明，當孕婦流產(chǎn)后隨著時間推移，EPF 在體內(nèi)含量逐步下降，在7 d 左右達到正常水平。此外，早孕因子在體內(nèi)含量也與母體胚胎的狀態(tài)相關(guān)［7］，體內(nèi)受精后分泌EPF 釋放因子，保證胎兒在母體不被機體排斥。檢測孕婦體中EPF 的含量有利于及時掌握受孕情況，也可應(yīng)用在家畜的早孕檢測，縮短動物的空懷時間，縮短產(chǎn)犢間隔，還可應(yīng)用于胚胎監(jiān)測、胚胎移植等領(lǐng)域［8］。

早孕因子作為一種免疫抑制蛋白，可以通過降低CD4+T 細胞的增殖來減弱T 淋巴細胞對機體的作用，以緩解疾病癥狀。在妊娠的早期，由于EPF 免疫抑制的保護作用，使胎兒不被母體視作異物清除［9，10］。臨床方面，實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是一種CD4+T 細胞介導的自身免疫性疾病。研究表明，EPF 可作為生物制劑與β 干擾素聯(lián)合用藥對EAE 有明顯的抑制作用［11］。Athanasas-platsis 等［12］被動免疫EPF 單抗到懷孕小鼠體內(nèi)，導致懷孕小鼠流產(chǎn)，說明EPF 能保護胎兒免受母體的免疫排斥，從而保證外來胚胎的活力。Morton 等［10］通過pGEX-2T 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，原核表達獲得了具有生物活性的人早孕因子重組蛋白（rEPF），并在此基礎(chǔ)上，探討人早孕因子重組蛋白與天然蛋白半衰期對比及二者對皮膚移植的時間影響，表明rEPF 可以減弱移植物排斥的影響，增加移植皮膚的存活時間，EPF 在移植器官移植方面會有更廣泛的應(yīng)用。

早孕因子原核表達質(zhì)粒的成功構(gòu)建，其重組蛋白在大腸桿菌中表達與純化，是獲得EPF 蛋白的成本低廉的方法。本研究利用基因工程技術(shù)原核表達牛源EPF 蛋白，獲得高純度的早孕因子重組蛋白，免疫動物制備EPF 多克隆抗體，為進一步研究EPF 高效靈敏檢測方法和其免疫學應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 成年雌性SPF 級新西蘭大耳白兔購自遼寧長生生物技術(shù)公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞和BL21（DE3）感受態(tài)細胞為實驗室制備留存。透析袋（4 000 D）購自北京夢怡美生物科技有限公司，SUMO 蛋白酶、IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）購自中國索萊寶科技有限公司，彩虹預染蛋白Marker、M5HiPer ECL Western HRP Substrate（超敏ECL 發(fā)光液）購自北京聚合美生物科技有限公司，TMB 顯色液A 液、B 液購自北京梅科萬德生物科技有限公司。

超凈工作臺購自天津市生物潔凈設(shè)備廠；離心機、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋購自美國Thermofisher公司。

1.2 方法

1.2.1 EPF 的生物信息學分析 利用Prot Param、Prot Scale、Signal P 4.1Server、Net Phos3.1 Server、TMHMM Server v.2.0 等軟件對EPF 蛋白的生物信息進行系統(tǒng)分析和研究。

1.2.2 引物設(shè)計 從NCBI 網(wǎng)站中獲取牛源EPF基因序列（序列號：NM 002157.3），選取CDS 區(qū)作為目的基因，序列的N 端加入多聚組氨酸（6×His）和SUMO 促溶標簽，命名為srEPF。用Primer Premier5.0軟件設(shè)計上下游引物，分別加入NcoⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點，上游引物：5′ CATGCCATGGGCCATCACCATCATC 3′；下游引物：5′ CGGCTCGAGTCAGTCGACATATTTCCCAAGAA 3′。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.2.3 目的基因的擴增 以目的基因為模板，通過PCR 擴增序列。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并進行膠回收，將純化好的目的片段與pMD-18T 載體連接后轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細胞，接種于含氨芐抗性的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)12 h 后挑取單個菌落進行菌液PCR 鑒定，將其命名為pMD-18T-srEPF。

1.2.4 pET-28a-EPF 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將pMD-18T-srEPF 質(zhì)粒與pET-28a（+）空質(zhì)粒用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，將目的基因與pET-28a（+）載體16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞中，接種于含卡那抗性的LB 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后挑單菌落進行菌液PCR 鑒定，將正確的質(zhì)粒命名為pET-28a-srEPF。

1.2.5 srEPF 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析將質(zhì)粒pET-28a-srEPF 轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，接種于含有卡那抗性的LB 固體平板，挑單菌落接種于LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)并鑒定。加入終濃度為1 mmol/L IPTG，37 ℃培養(yǎng)8 h 后進行SDS-PAGE 凝膠電泳并染色。確認目的蛋白表達成功后，將菌體收集重懸后超聲破碎，確定目的蛋白表達形式。

1.2.6 srEPF 重組蛋白的純化與酶切 將pET-28asrEPF 陽性菌液以1∶100 接種至1 L 含卡那抗性的液體LB 培養(yǎng)基中，按上述步驟進行誘導表達。超聲波破碎后12 000 r/min 離心40 min，通過重力柱純化，上清液與鎳柱于4 ℃結(jié)合1 h，用不同咪唑濃度（40、80、150、200、220、250、300 mmol/L）的洗脫緩沖液梯度洗脫目的蛋白，收集洗脫液后PAGE 電泳鑒定，以確定將EPF 蛋白完全洗脫的咪唑濃度。洗脫下的蛋白緩沖液裝入適當大小的透析袋中，在PBS溶液中透析3 次（3 h/次），用PEG 20 000 濃縮，通過BCA 試劑盒檢測重組EPF 蛋白濃度。

將濃縮后的融合蛋白以每1 mg 融合蛋白加入2 μL SUMO 蛋白酶和20 μL SUMO Protease buffer 進行酶切，用ddH2O 補至1 mL，4 ℃切割過夜并進行SDS-PAGE 檢測。切割后產(chǎn)物使用Ni 親和柱純化，His-SUMO 標簽掛柱，目的蛋白從Ni親和柱上流出，收集流穿液后進行PAGE 分析，通過BCA 試劑盒建立標準曲線，檢測酶切后EPF 蛋白濃度。

1.2.7 多克隆抗體制備 采集未免疫時兔耳緣靜脈的血液，作為陰性血清，將去除抑制區(qū)的EPF 蛋白背部皮下注射的方式免疫動物，皮下免疫4 次，每次免疫間隔7 d。初免時800 μg EPF 與弗氏完全佐劑等體積乳化，加強免疫用400 μg 重組蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻后注射，4 免后3 d 耳緣靜脈采血測其效價。

1.2.8 多克隆抗體效價的測定及其反應(yīng)原性鑒定重組EPF 蛋白以5 μg/mL 濃度包被ELISA 板，37 ℃孵育2 h；PBST 洗3 次，用5%脫脂乳37 ℃封閉1 h；PBST 洗滌3 次，將兔抗EPF 多抗倍比稀釋加入酶標板，100 μL 每孔，37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3 次，二抗使用HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體，1∶4 000 倍稀釋，37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3 次，再加入TMB 顯色液37 ℃避光8 min，加入50 μL 終止液，利用酶標儀450 nm 波長測定OD值。

通過Western blotting 方法檢測反應(yīng)原性，一抗為兔源EPF 多克隆抗體，用5%脫脂乳500 倍稀釋后孵育；二抗為HRP 標記的羊抗兔IgG，用5%脫脂乳5 000 倍稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPF 蛋白的理化分析

通過理化性質(zhì)分析軟件Prot Param（https：//web.expasy.org/protparam/）對EPF 的消光系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、半衰期和平均親水系數(shù)等進行分析。結(jié)果表明，牛源EPF 蛋白由102 個氨基酸組成，各氨基酸含量見表1。含負電荷氨基酸（Asp + Glu）13 個，其中Asp 8 個，Glu 5 個；含正電荷氨基酸（Arg+Lys）15 個，其中Lys 11 個，Arg 4 個。含量最高的是Val 和Gly（13.7%），其次是為Lys（10.8%）。分子式為C494H801N1294O145S2，原子總數(shù)為1 571 個，分子質(zhì)量為10.9 ku，理論等電點5.87，偏酸性，消光系數(shù)為4 470 L/（mol·cm），半衰期為30 h，脂溶系數(shù)為95.39，平均親水系數(shù)為-0.041，不穩(wěn)定系數(shù)為23.75，為穩(wěn)定蛋白。

表1 牛源EPF 蛋白的氨基酸組成

2.2 EPF 蛋白的親/疏水性及跨膜區(qū)分析

利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析EPF 蛋白的親/疏水性；利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析EPF 蛋白是否含有跨膜區(qū)。結(jié)果表明，EPF 蛋白總平均親水性為-0.041，氨基酸得分最大值為2.220，最小值為-1.611，為親水性蛋白，親水氨基酸數(shù)量多于疏水氨基酸（圖1）。EPF 蛋白無信號肽和跨膜區(qū)（圖2、圖3），不屬于跨膜蛋白，且亞細胞定位分析顯示，主要分布于宿主的細胞質(zhì)（56.5%）、細胞核（17.4%）和線粒體（8.7%）中。

圖1 EPF 蛋白的親/疏水性分析

圖2 EPF 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預測

圖3 EPF 蛋白的信號肽預測

2.3 EPF 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測

通過SOPMA 和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析EPF 蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)。 二級結(jié)構(gòu)分析顯示，EPF 蛋白含有α-螺旋（Hh）30 個，占比29.41%，α-螺旋是一種穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，由此推測EPF 蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；含有β 轉(zhuǎn)角（Tt）13 個，占比12.75%；延長鏈（Ee）26 個，占比25.49%；無規(guī)則卷曲（Cc）33 個，占比32.35%（圖4）。α-螺旋不易變形，較為穩(wěn)定，一般在蛋白內(nèi)部，不易形成抗原表位，β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲鍵能較低，穩(wěn)定性較差，常處于蛋白質(zhì)外部，易形成B 細胞抗原表位，三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖5 所示。

圖4 EPF 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測

圖5 EPF 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測

2.4 pET-28a-EPF 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定后，將其轉(zhuǎn)化到BL21 感受態(tài)細胞中進行菌液PCR 鑒定（圖6），在641 bp 處有明亮的條帶，與預期大小相符，表明pET-28a-EPF 重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。

圖6 菌液PCR 鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.5 srEPF 重組蛋白的誘導表達

SDS-PAGE 分析結(jié)果如圖7 所示，經(jīng)IPTG 誘導后，pET-28a 轉(zhuǎn)化后菌株在26 ku 左右處出現(xiàn)1 條蛋白條帶，與預期大小相符，表明srEPF 已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達。

圖7 SDS-PAGE 鑒定srEPF 的誘導表達

2.6 誘導條件的優(yōu)化

如圖8、圖9 所示，當反應(yīng)條件為37 ℃誘導8 h，加入IPTG 終濃度為0.2 mmol/L 時，重組蛋白表達量最多，誘導條件最終確定為終濃度0.2 mmol/L IPTG，37 ℃下誘導8 h，此時蛋白分子質(zhì)量為26 ku。

圖8 不同誘導時間下EPF 蛋白的表達

圖9 不同濃度誘導劑下重組蛋白的表達

2.7 重組蛋白的可溶性表達與純化

2.7.1 重組蛋白的可溶性表達 為確定重組蛋白的表達形式，方便后續(xù)純化，采用超聲波破碎方法破碎菌體蛋白，擴大培養(yǎng)菌體后將其超聲波破碎，破碎后進行SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖10 所示，重組蛋白上清表達量高于包涵體，表明重組蛋白為上清液表達，分子質(zhì)量為26 ku，可用于重力柱親和層析純化。

圖10 重組蛋白的可溶性表達

2.7.2 重組蛋白的純化與酶切 將目的蛋白純化，超聲后上清液在咪唑濃度約為220 mmol/L 時完全被洗脫（圖11）。將蛋白完全洗脫后根據(jù)濃度和酶切體系進行酶切，獲得無標簽的EPF 蛋白，酶切后蛋白大小約為11 ku，符合預期（圖12），通過BCA 試劑盒檢測酶切后EPF 蛋白濃度為1.1 mg/mL。

圖11 重組蛋白鎳柱純化的SDS-PAGE

圖12 純化酶切后蛋白的結(jié)果

2.8 多克隆抗體的制備及抗體效價的測定

利用純化的EPF 重組蛋白免疫動物制備多克隆抗體，通過間接ELISA 方法檢測4 免后血清效價為1∶256 000（圖13），表明純化后的EPF 蛋白誘導大耳白兔獲得高水平效價。

圖13 多抗效價的測定

圖14 EPF 蛋白的Western blotting 檢測

2.9 多抗反應(yīng)原性鑒定

Western blotting 鑒定結(jié)果表明，制備的多抗能夠特異性識別重組EPF 蛋白和牛血清中的天然EPF蛋白，且與去除抑制區(qū)的EPF 蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，該蛋白和抗體可用于后續(xù)探究其免疫抑制作用和建立快速、靈敏的檢測方法。

3 結(jié)論與討論

目前，EPF 是最早確認妊娠的生化指標之一。Fan 等［13］通過檢測EPF 在懷孕母牛體內(nèi)的含量，空懷奶牛準確率接近90%。Haq 等［14］在孕婦受精后24 h 內(nèi)檢測到活性EPF，明顯早于人絨毛膜促性腺激素，EPF 活性也幾乎存在于整個妊娠期。在臨床上，EPF 可作為妊娠超早期診斷的指標之一，可應(yīng)用于規(guī)?；B(yǎng)殖場，提高產(chǎn)犢效率，縮短動物空懷時間，降低空懷期的經(jīng)濟損失。

EPF 作用不僅局限于妊娠，EPF 也存在于腫瘤細胞，可應(yīng)用于某些腫瘤的早期診斷及預后判斷。Rolfe 等［4］研究顯示在睪丸母細胞瘤病人血清可檢測出EPF，而健康男性未檢出。Fan 等［15］檢測滋養(yǎng)細胞腫瘤的病人血清中EPF 活性情況，診斷腫瘤患者準確率高達90%，因此EPF 活性可作為判定滋養(yǎng)細胞瘤的指標之一，從滋養(yǎng)細胞瘤患者血清中獲得EPF 抗原，并制備其單克隆抗體，通過檢測患者血清中的EPF 探究腫瘤進程。

本研究針對牛源EPF基因構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-srEPF，通過原核表達成功獲得了純度較高的srEPF，將EPF 作為免疫原獲得高效價的兔源多克隆抗體。Western blotting 結(jié)果表明，制備的兔源多克隆抗體能夠特異性識別srEPF 和去除抑制區(qū)的EPF，EPF 及其抗體的獲得為奶牛早期診斷、腫瘤早期篩查等EPF 相關(guān)免疫學檢測方法開發(fā)與應(yīng)用提供了試驗基礎(chǔ)和必備材料。