毛可欣，王海榮，安 淼，呂 巍，李 健，李國田

（1.山東省果樹研究所，山東泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271000）

獼猴桃原產(chǎn)于中國，在中國分布廣泛，全球54個獼猴桃屬種中52 個原產(chǎn)中國，其中44 個為中國特有。中國商業(yè)化栽培起步較晚，20 世紀(jì)70 年代才開始相關(guān)品種普查以及改良工作［1］。當(dāng)前商業(yè)化栽培主要有中華獼猴桃（Actinidia chinensis）、美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）和少量的軟棗獼猴桃（Actinidiaarguta）、毛花獼猴桃（Actinidia erianthaBenth.），其余仍處于野生或半野生狀態(tài)。中國已公布選育的獼猴桃品種有百余個，目前有20 多個省份種植，獼猴桃采收面積和產(chǎn)量均位居世界第一［2］。

溫度是影響獼猴桃生長發(fā)育的主要因素，低溫脅迫會抑制其生長發(fā)育，影響產(chǎn)量，造成巨大損失。獼猴桃在花芽和嫩葉初生時期遭受凍害會出現(xiàn)萎縮、褐變、脫落［3］，在早春遭受低溫脅迫后會落花、無果。冬末春初時枝條、根系易發(fā)生凍害，嚴(yán)重時導(dǎo)致全株死亡［4，5］。研究表明，不同品種獼猴桃對低溫耐受有較大差異，其中，抗寒力較強(qiáng)的品種有‘魁綠’‘秦美’‘泰山1 號’等，‘徐香’的抗寒力較弱［6］。獼猴桃的低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制主要聚焦在ICE-CBECOR依賴的低溫信號通路［7-9］，低溫誘導(dǎo)CBF基因表達(dá)，其編碼的蛋白激活COR表達(dá)，導(dǎo)致滲透物、低溫保護(hù)蛋白等積累，從而使植物提高低溫耐受性。此外，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativaL.）中發(fā)現(xiàn)MYB 轉(zhuǎn)錄因子也可以通過調(diào)節(jié)CBF的表達(dá)來調(diào)節(jié)植物的低溫耐受性［10］。在低溫脅迫下植物激素也發(fā)揮重要作用，油菜素類固醇的信號通路能調(diào)節(jié)COR的表達(dá)［11］，外源施加油菜素類固醇可以增加COR表達(dá)以提高植物的耐寒性［12］。茉莉酸信號通路中的JAZ1（Jasmonate ZIM-domain protein）和JAZ4 可以削弱CBF表達(dá)［13］，乙烯信號通路中EIN3（Ethylene Insensitive 3）和EIL1（EIN3-Like 1）可以調(diào)節(jié)CBF的表達(dá)［14］。

目前關(guān)于獼猴桃不同品種的低溫耐受性尚不明確，黃永紅等［6］的研究中‘徐香’抗寒能力較弱，與山東省泰安市‘徐香’抗寒能力弱結(jié)果一致，中華獼猴桃‘臍紅’在泰安市抗寒性表現(xiàn)較好。針對不同品種獼猴桃應(yīng)對外界低溫的生理變化、低溫響應(yīng)反應(yīng)以及調(diào)節(jié)的相關(guān)基因尚不明確，本研究選取抗寒性強(qiáng)的中華獼猴桃‘臍紅’以及抗寒性弱的美味獼猴桃‘徐香’作為研究對象，在秋末（11 月）以及越冬期（12 月、1 月、2 月）取樣，通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定其差異表達(dá)基因，并聚類到相關(guān)的途徑，明確其對低溫脅迫的響應(yīng)差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植株為4 年生‘臍紅’‘徐香’獼猴桃品種，位于山東省果樹研究所泰東科研基地；東經(jīng)116°20′—117°59′、北緯35°38′—36°28′，年平均降水量697 mm，溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候；中性偏酸沙壤土，有機(jī)質(zhì)含量1%，堿解氮含量19~43 mg/kg，磷含量21~34 mg/kg，鉀含量32~68 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 2020 年11 月15 日至2021 年2 月15日，取直徑為0.5~0.8 cm 1年生的獼猴桃樹新枝作為樣品（‘徐香’‘臍紅’2個品種），每月1次，共取4次，每次3 個重復(fù)，用作轉(zhuǎn)錄組與生理指標(biāo)的測定材料。

1.2.2 生理指標(biāo)測定 丙二醛測定使用10%的三氯乙酸（TCA）溶液研磨，取上清液后加入0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴反應(yīng)，冷卻后離心取上清液，于450、532 和600 nm 波長下測定其吸光值?？扇苄蕴菧y定使用蒽酮試劑，測定620 nm 波長下的吸光值。脯氨酸含量測定采用茚三酮法。超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用WST 方法。此外，還測定了電導(dǎo)率的相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 參考基因組來自http：//kiwifruitgenome.org/ftp/A_chinensis/Hongyang/v3.0/，使用Hisat2［15］進(jìn)行比對。使用DEGseq 進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，多重檢驗(yàn)校正方法選擇BH，篩選條件為差異倍數(shù)大于2 或者小于0.5，P-adjust 為0.001。組內(nèi)差異表達(dá)分析：分別將12、1、2 月的基因組序列與11月的基因組序列對比，得到組內(nèi)差異表達(dá)基因。組間差異表達(dá)分析：將2 個品種各月份的基因組序列進(jìn)行比對得到差異表達(dá)基因。

分別對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 分類統(tǒng)計，選取GO 通路的前20 位（P-adjust＜0.5），繪制氣泡圖；分別對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 分類統(tǒng)計，選取KEGG 通路的前20 位（P-adjust＜0.5），去除無關(guān)通路，繪制氣泡圖。

1.2.4 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR 使用EASYspin 植物RNA 快速提取試劑盒提取RNA，使用SUMOnetubeRTMixture 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR 使用UltraSYBR Mixture（Low ROX）試劑，使用15 μL 體系：cDNA 模板1 μL，2×SYBRGreenMix 7.5 μL，上下游引物（表1）各0.3 μL，ddH2O 5.9 μL，儀器為ABI QuantStudio 6 Flex，結(jié)果使用相對定量的2（-ΔΔCT）法處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬季降溫過程中獼猴桃的生理變化

在氣溫較低的11月至次年1月，‘臍紅’與‘徐香’的電導(dǎo)率升高，峰值都出現(xiàn)在氣溫最低的1月（圖1），說明在溫度降低過程中細(xì)胞膜有所損傷；二者的丙二醛含量、可溶性糖含量升高，脯氨酸含量先下降后上升。‘臍紅’與‘徐香’的超氧化物歧化酶（SOD）活性差異較大，‘臍紅’的SOD 活性變化幅度較小，‘徐香’的SOD 活性明顯高于‘臍紅’；‘徐香’電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性糖含量高于‘臍紅’。但在12 月和1 月，‘臍紅’與‘徐香’的可溶性糖含量、脯氨酸含量較接近。結(jié)果表明，在氣溫逐漸降低的過程中‘臍紅’的低溫耐受調(diào)節(jié)高于‘徐香’，且存在除SOD、可溶性糖和脯氨酸外的有效調(diào)控途徑。

2.2 獼猴桃種間差異表達(dá)分析

‘臍紅’12、1、2 月與11 月相比，差異表達(dá)基因數(shù)量分別為4 866、5 501 和5 740 個（圖2），數(shù)目隨時間推移逐漸增多；上調(diào)基因數(shù)量分別為3 457、3 450 和2 518 個，下調(diào)基因數(shù)量分別為1 409、2051 和3 222個，下調(diào)基因數(shù)量逐漸上升，在12、1 月上調(diào)基因數(shù)量基本一致，但在2 月上調(diào)基因數(shù)量減少?！煜恪?2、1、2 月與11 月相比，差異表達(dá)基因分別為5 388、4 462 和4 630 個，在12 月差異表達(dá)基因數(shù)量最多；上調(diào)基因分別為2089、2 148 和3 014 個，上調(diào)基因數(shù)量逐漸增多，下調(diào)基因數(shù)量分別為3 299、2 314 和1 616 個，數(shù)量逐漸減少。

圖2 獼猴桃差異表達(dá)基因統(tǒng)計

品種間差異表達(dá)基因在GO 分類中包括生殖過程、多細(xì)胞生物體過程、發(fā)育過程、對刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、代謝過程等（圖3）。在‘臍紅’的GO 聚類中，12 月至次年2 月，細(xì)胞成分組織或生物生成、細(xì)胞過程、細(xì)胞器部分、代謝過程、膜部分等差異表達(dá)基因數(shù)量有不同程度增加；在2 月，代謝過程和催化活性差異表達(dá)聚類增多。而‘徐香’中細(xì)胞成分組織或生物生成、細(xì)胞器部分等差異表達(dá)基因數(shù)量沒有明顯增加。從KEGG 通路差異表達(dá)基因分布可以看出，‘臍紅’和‘徐香’的基因表達(dá)模式具有一定差異，在溫度低于0 ℃的時候‘徐香’出現(xiàn)大量上調(diào)表達(dá)的基因，而‘臍紅’在整個過程中下調(diào)基因較多。12 月至次年1 月‘臍紅’膜運(yùn)輸、翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)等相關(guān)的差異表達(dá)基因減少，而在‘徐香’中并沒有明顯減少；2 個品種在其他氨基酸的代謝、輔助因子和維生素的代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝中差異表達(dá)基因均表現(xiàn)為增加，在糖類的生物合成和代謝中均表現(xiàn)為降低。

2.3 獼猴桃在越冬期不同月份差異表達(dá)分析

在越冬期GO 注釋統(tǒng)計中（圖4），差異基因富集靠前的GO 通路包括尿酸代謝過程、跨膜運(yùn)輸、氧化還原酶活性、單氧酶活性、類黃酮代謝等。在氣溫高于0 ℃的11 月，跨膜運(yùn)輸、磷化作用、單羧酸代謝過程、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性高度富集，隨著越冬期溫度的下降，富集程度降低。溫度下降初期的12 月出現(xiàn)了鐵離子結(jié)合相關(guān)通路的富集，最冷月1 月出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移糖基團(tuán)和單糖代謝過程的富集，2月出現(xiàn)了運(yùn)輸、磷的代謝過程、含磷化合物的代謝過程、漿膜的固有成分、血紅素結(jié)合相關(guān)通路的富集。在溫度下降初期（12 月），尿酸代謝、UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性、次生代謝物的生物合成、氧化還原酶活性、葡萄糖醛酸代謝、類黃酮代謝等過程基因高度富集，其中，氧化還原反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因數(shù)量激增，11 月的差異表達(dá)基因數(shù)量為282 個，12 月為323個，但1 月降至34 個。

在越冬期KEGG 通路富集中（圖5），11 月高富集的差異表達(dá)基因包含芪類、二芳基庚烷類和姜醇的生物合成、氮素代謝、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝過程等。越冬初期的12 月，出現(xiàn)了玉米素的生物合成、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、苯丙氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、葉酸的生物合成、精氨酸的生物合成、氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、ABC 運(yùn)輸工具等相關(guān)過程的富集。在氣溫最低的1 月，出現(xiàn)了酪氨酸代謝、蛋白質(zhì)輸出、其他糖類降解、蕓苔素類化合物生物合成相關(guān)的富集。在2 月，出現(xiàn)了色氨酸代謝、檸檬烯和蒎烯的降解、半乳糖代謝、果糖和甘露醇的代謝相關(guān)的富集。在整個越冬期都出現(xiàn)了淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙類化合物生物合成、黃酮類化合物生物合成等過程的富集。

圖5 越冬期KEGG 富集

2.4 獼猴桃基因表達(dá)譜及驗(yàn)證分析

差異表達(dá)基因富集分析發(fā)現(xiàn)，淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙類化合物的生物合成和黃酮類化合物的生物合成通路始終存在差異表達(dá)。由圖6 可知，在基因表達(dá)圖譜中2 個品種差異較大，‘徐香’油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因表達(dá)顯著高于‘臍紅’，推測其在‘徐香’抵御低溫脅迫中發(fā)揮作用。其次，在酪氨酸代謝和蛋白質(zhì)輸出的相關(guān)基因中，‘徐香’的表達(dá)量高于‘臍紅’。但是在糖類降解中，‘臍紅’在低溫的1 月表達(dá)顯著高于‘徐香’，猜測其通過降解其他糖類累積可溶性糖以抵御低溫。差異表達(dá)基因富集通路顯示，‘臍紅’與‘徐香’的低溫基因表達(dá)模式有所區(qū)別，在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最明顯，大部分基因在2 個品種中具有不同的表達(dá)模式。

圖6 差異通路基因表達(dá)圖譜

從差異表達(dá)基因中篩選出蛋白分泌基因（Anch273941）、蠟質(zhì)合成基因（Achn098691）和植物激素相關(guān)基因（Achn253311、Achn180501、Achn054121）5 個基因，qRT-PCR 測定其表達(dá)水平，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。5 個候選基因的qRTPCR 與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致（圖7），說明轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)相對準(zhǔn)確。

圖7 差異表達(dá)基因驗(yàn)證

3 討論

目前對作物低溫生理效應(yīng)研究較多［16］，但是對植物越冬期間的低溫響應(yīng)與調(diào)節(jié)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃的耐寒與不耐寒品種的基因表達(dá)具有較大差異，主要區(qū)別為低溫后的相關(guān)調(diào)節(jié)。從電導(dǎo)率和丙二醛含量的測定也能驗(yàn)證‘臍紅’的低溫耐受性高于‘徐香’。‘臍紅’在整個降溫過程中上調(diào)基因數(shù)量減少，下調(diào)基因數(shù)量增加，與‘徐香’的區(qū)別較大，尤其在氣溫最低的1 月，二者在2 月的差異表達(dá)基因數(shù)量均升高，原因是2 月獼猴桃開始脫休眠進(jìn)入生長發(fā)育狀態(tài)?！毤t’在12 月的特異差異表達(dá)基因比1 月少，但‘徐香’在溫度降低初期具有較多的差異表達(dá)基因，證實(shí)2 個品種在溫度降低的過程中具有不同的基因表達(dá)模式。

在GO 分類統(tǒng)計中，2 個品種在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞器、細(xì)胞部分、催化活性相關(guān)部分差異表達(dá)基因均較高，以上途徑均參與了植物應(yīng)對低溫脅迫的響應(yīng)。在‘臍紅’越冬過程中，細(xì)胞成分組織或生物生成、細(xì)胞器部分等差異表達(dá)基因數(shù)量增加，而‘徐香’與‘臍紅’差異表達(dá)基因數(shù)量沒有明顯增加。在KEGG 的分類統(tǒng)計中，尤其是在12 月至次年1 月，‘臍紅’的膜運(yùn)輸、翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)等相關(guān)的差異表達(dá)基因減少，而在‘徐香’中并沒有明顯減少，說明2 個品種在低溫脅迫下自身的基因表達(dá)模式不同。在KEGG 富集中，二者均出現(xiàn)了MAPK 信號傳導(dǎo)途徑，低溫信號傳導(dǎo)涉及蛋白激酶通路［17］。‘臍紅’中有明顯的角質(zhì)素、亞葉酸和蠟質(zhì)途徑的差異表達(dá)，表明其在溫度降低的過程中發(fā)揮了重要作用，在‘徐香’中最特殊的是氨基酸的生物合成與代謝，包括精氨酸的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝。綜上，‘臍紅’與‘徐香’在低溫脅迫下的反應(yīng)與調(diào)節(jié)機(jī)制有所區(qū)別。

在越冬期不同月份對比中發(fā)現(xiàn)，在氣溫最低的1 月出現(xiàn)了較多的糖類合成與代謝相關(guān)基因，低溫脅迫會觸發(fā)淀粉降解［18］，并將葡萄糖等轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，通過在液泡中積累糖分增強(qiáng)植物的低溫耐受性［19］。在差異表達(dá)基因中，‘徐香’的糖類降解相關(guān)基因表達(dá)量較高，可溶性糖含量也相對較高，說明在低溫脅迫下通過調(diào)節(jié)糖類的降解以應(yīng)對低溫環(huán)境。植物可以改變自身的角質(zhì)素、蠟質(zhì)的成分和數(shù)量來抵御外界脅迫［20-22］，植物表面蠟質(zhì)可以增強(qiáng)植物對干旱、鹽、低溫脅迫的耐受性［23］，植物角質(zhì)素、蠟質(zhì)合成過程復(fù)雜，部分基因在低溫脅迫下被誘導(dǎo)高水平表達(dá)，形成抗寒屏障應(yīng)對低溫環(huán)境。‘臍紅’中角質(zhì)素、亞葉酸和蠟的生物合成相關(guān)基因表達(dá)顯著高于‘徐香’，同時，脂肪酸是合成角質(zhì)素、亞葉酸和蠟的重要前體物質(zhì)，C16 和C18 脂肪酸含量也會增多［24］。此外，植物激素在低溫響應(yīng)中同樣具有重要作用，‘臍紅’與‘徐香’均在植物激素響應(yīng)中具有較多的差異表達(dá)基因，包括色氨酸代謝、玉米素生物合成、二萜類化合物的生物合成、類胡蘿卜素的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、蕓苔素的生物合成、α-亞麻酸的代謝和苯丙氨酸的代謝。分析表明，植物激素、MAPK、糖類降解和氨基酸代謝等途徑在獼猴桃的低溫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其中，部分途徑如糖類代謝、角質(zhì)素蠟質(zhì)等途徑的差異性是‘臍紅’與‘徐香’在低溫脅迫下耐受性不同的主要原因。

4 結(jié)論

比較轉(zhuǎn)錄組分析顯示，越冬低溫期間，‘臍紅’與‘徐香’2 個品種的差異表達(dá)基因具有一定的相似性。但部分途徑基因存在表達(dá)差異，以上的分析結(jié)果為研究獼猴桃的越冬轉(zhuǎn)錄水平變化提供了新的見解，有助于進(jìn)一步研究獼猴桃的低溫脅迫響應(yīng)的潛在分子調(diào)節(jié)機(jī)制，為獼猴桃的低溫耐受性新品種培育提供理論基礎(chǔ)。