李桂榮,沈忱悠,衛(wèi) 棟,陳靜瑜

急性肺損傷(ALI)是指心源性以外的因素導(dǎo)致急性的、進行性的、缺氧性的急性呼吸衰竭,典型特征是出現(xiàn)彌漫性肺泡損傷,肺組織發(fā)生過度炎癥、水腫、肺透明膜,嚴重時導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合癥,致死率在29%～42%[1-3]。LPS作為TLR4激動劑可誘導(dǎo)急性肺損傷,激活TLR4信號途徑,接著導(dǎo)致NF-κB信號途徑的激活,促進炎癥因子的表達[4]。急性肺損傷中,多種免疫細胞如巨噬細胞和中性粒細胞被激活和招募,尤其是肺泡巨噬細胞,占肺組織常駐細胞的80%,不同的微環(huán)境下呈現(xiàn)促炎和抗炎的表型,參與肺組織的炎癥反應(yīng)及組織修復(fù)[5-6]。

槲皮素是廣泛存在于自然界的黃酮醇化合物,具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用[7]。越來越多的研究表明,槲皮素對不同因素導(dǎo)致的急性肺損傷有保護作用。在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中,槲皮素可以抑制肺組織炎癥細胞的流入和cAMP-Epac信號途徑,減輕了肺組織炎癥損傷[8-9]。吸煙誘導(dǎo)的急性肺損傷,槲皮素可抑制肺組織的氧化應(yīng)激壓力和白細胞水平,減輕肺組織損傷[10]。在膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中,槲皮素可以通過SIRT1/AMPK信號途徑降低氧化應(yīng)激的壓力,減輕肺組織損傷[11]。而槲皮素在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷中的作用和機制仍不清楚。本研究利用LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型,研究槲皮素對急性肺損傷大鼠的保護作用及對巨噬細胞促炎表型的調(diào)節(jié)作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:SPF級SD大鼠,購于常州卡文斯實驗動物有限公司[SCXK(蘇)2021-0013],本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則;槲皮素購于Sigma公司;一抗抗體CD68、IRF5、Arg1、Notch1購于Abcam公司;內(nèi)參β-actin、辣根過氧化氫酶標記的羊抗兔及羊抗鼠二抗、配制SDS-PAGE蛋白膠的相關(guān)試劑、動物RNA抽提試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;生物素標記的羊抗兔二抗、鏈霉親和素全長蛋白、DAB顯色試劑盒購于Abcam公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司;ECL底物發(fā)光液購于Thermo公司。

1.2 急性肺損傷動物模型的建立:30只SPF級SD大鼠,重量(200±30)g,隨機分成3組,即對照組、脂多糖組、脂多糖+槲皮素組。在脂多糖組,用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射,給藥40 mg/kg麻醉大鼠,剪開頸部皮膚,暴露氣管,用1 mL注射器吸取LPS 100 μL,給藥量5 mg/kg,經(jīng)氣管進行滴注,為了讓LPS均勻分布到肺組織,滴注完LPS后,大鼠保持直立并旋轉(zhuǎn)1～2 min,縫合皮膚,正常喂養(yǎng),LPS刺激24 h 后取肺,部分肺組織-80 ℃凍存,部分肺組織置于10%中性福爾馬林中固定,用于后續(xù)的病理實驗。對照組的大鼠暴露氣管后給予同等體積的PBS,取肺后部分組織-80 ℃凍存,部分組織置于10%中性福爾馬林中固定。脂多糖+槲皮素組,腹腔注射給予槲皮素,一次給藥量為50 mg/kg,同時氣管滴注給予LPS (5 mg/kg),24 h后取肺,部分肺組織于-80 ℃凍存,部分肺組織置于10%中性福爾馬林中固定,用于后續(xù)病理實驗。

1.3 肺組織蘇木精-伊紅染色:蘇木精-伊紅染色(HE染色)的方法觀察肺組織的病理變化,灌流后的左肺組織在10%中性福爾馬林中固定24 h,進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟,然后包埋,切片,厚度為4 μm,對切片進行HE染色,中性樹膠封片,光鏡下拍照,觀察肺組織病理變化。

1.4 肺組織濕干重比檢測:用肺組織濕干重比檢測肺組織的水腫變化程度。取新鮮的左肺組織,紗布吸取表面的液體,稱取肺組織的質(zhì)量為濕重,然后置于60 ℃烘箱中72 h,至肺組織質(zhì)量不再發(fā)生變化時稱取的質(zhì)量為干重。濕重與干重的比值反應(yīng)肺組織的水腫程度。

1.5 肺組織炎癥因子的檢測:qRT-PCR方法檢測肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達變化。設(shè)計合成引物1OD,TNF-α(上游序列5′-CTGGCGTGTTCATCCGTTCT-3′,下游序列5 ′-GCCACTACTTCAGCGTCTCG-3′),IL-1β(上游序列5 ′-AGGCTGACAGACCCCAAAAG-3′,下游序列5 ′-GCTCCACGGGCAAGACATA-3′),內(nèi)參GAPDH(上游序列5 ′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′,下游序列5 ′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′),用RNA抽提試劑盒抽提右上肺組織RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,實時熒光定量PCR進行擴增。GAPDH作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt方法計算目標基因TNF-α和IL-1β的相對表達量。

1.6 肺組織免疫組織化學(xué)實驗檢測:經(jīng)多聚甲醛灌流后的肺組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h,進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。取左肺切片厚度4 μm,進行脫蠟復(fù)水,然后置于0.3%甲醇-H2O2溶液中浸泡20 min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,切片置于枸櫞酸緩沖液中用高壓鍋煮沸10 min,進行抗原修復(fù)。用5%的BSA室溫封閉40 min后,一抗CD68,4 ℃孵育過夜。切片洗滌后,滴加生物素標記的二抗,室溫孵育1.5 h,洗滌,用鏈霉親和素-過氧化物酶封閉后,用DAB顯色液顯色,蘇木精襯染、脫水、透明、封片,拍照觀察。Image J軟件計算各組圖片的陽性細胞占總細胞的百分比,在分析過程中,各組取五張片子,每張片子取五個視野,統(tǒng)計分析CD68的表達差異。

1.7 Western blot 實驗:取各組大鼠的右下肺組織,液氮下研磨成粉,RIPA裂解液提取蛋白,加入5×上樣緩沖液混勻,100 ℃煮沸5 min,上樣,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜2 h,5%牛奶封閉1 h,加入一抗IRF5、Arg1、Notch1及β-actin抗體,4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,辣根過氧化氫酶標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗室溫孵育1.5 h,TBST洗膜3次,ECL發(fā)光液顯色,G:Box凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織炎癥損傷:HE染色結(jié)果顯示,在SD大鼠中,LPS刺激肺組織24 h后,造成肺組織急性的炎癥損傷,肺泡壁增厚,肺泡腔發(fā)生炎癥浸潤,給予槲皮素后,肺泡腔的炎癥浸潤降低,肺泡壁厚度降低,見圖1(目錄后)。LPS刺激大鼠肺組織24 h后,肺組織濕干比值、炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)的mRNA表達增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),給予槲皮素后,肺組織濕干比值及炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達降低,與脂多糖組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 槲皮素對LPS刺激大鼠肺組織濕干比和TNF-α、IL-1β的mRNA水平的影響

2.2 免疫組化染色觀察槲皮素對LPS刺激大鼠肺組織中CD68的表達影響:免疫組織化學(xué)方法染色肺泡巨噬細胞的標志蛋白CD68,結(jié)果顯示,LPS刺激大鼠肺組織24 h后,肺組織中肺泡巨噬細胞浸潤,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);給予槲皮素后,肺組織的巨噬細胞浸潤程度顯著降低,與脂多糖組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2(目錄后)與表2。

表2 免疫組化染色中各組大鼠肺組織CD68陽性細胞的百分比分析

2.3 Western blot分析槲皮素對LPS刺激大鼠肺組織中IRF5、Arg1和Notch1蛋白表達的影響:IRF5對肺泡巨噬細胞的促炎表型有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,Western blot結(jié)果顯示,LPS刺激大鼠肺組織24 h后,IRF5的表達增加,給予槲皮素后,IRF5的表達降低。巨噬細胞抗炎表型的標志蛋白Arg1在LPS刺激24 h后表達降低,給予槲皮素后,Arg1蛋白表達上調(diào)。說明槲皮素可抑制肺組織巨噬細胞的促炎表型。此外,LPS刺激肺組織后,Notch1蛋白表達增加,腹腔注射給予槲皮素后,Notch1蛋白表達下降,結(jié)果表明槲皮素抑制了Notch1蛋白的表達,見圖3(目錄后)和表3。

表3 槲皮素對LPS刺激的大鼠肺組織IRF5、Arg1、Notch1蛋白表達的影響

3 討論

槲皮素是自然界廣泛存在的黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗纖維化的作用,很多研究表明針對不同的疾病動物模型,槲皮素的保護作用機制不同。在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中,槲皮素可以抑制肝組織的炎癥和纖維化,其機制與抑制肝組織M1型巨噬細胞的激活有關(guān)[12]。在盲腸結(jié)扎穿孔引起的休克中,槲皮素可降低氧化應(yīng)激和炎癥對肺組織的損傷[13]。在小鼠腎損傷中,槲皮素可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2極化衰減腎損傷和纖維化[14]。本研究的實驗結(jié)果表明,槲皮素可抑制肺組織炎癥浸潤、肺水腫及肺組織炎癥因子的表達,抑制肺組織中肺泡巨噬細胞的浸潤和促炎表型可能與Notch1蛋白有關(guān)。

急性肺損傷是一個復(fù)雜的病理過程,肺泡巨噬細胞在急性肺損傷的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用[15]。在急性肺損傷的炎癥反應(yīng)階段,肺泡巨噬細胞啟動促炎的級聯(lián)反應(yīng)清理氣道和肺泡的病原菌,傳導(dǎo)固有免疫應(yīng)答,早期分泌的促炎因子如TNF-α、IL-1β可招募中性粒細胞、巨噬細胞等。炎癥階段的肺泡巨噬細胞呈M1型,過度釋放NO和MMP會直接導(dǎo)致組織的損害,也可以通過過度招募中性粒細胞和TH17細胞間接擴大組織損傷。在急性肺損傷的后期,肺損傷的修復(fù)機制被激活,伴隨著病原菌的清除,促炎信號的降低及促炎中性粒和巨噬細胞的清除,巨噬細胞由促炎的M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡椎腗2表型,釋放TGF-β、IL-10等產(chǎn)物,促進組織的修復(fù)[3,16]。本研究中,在LPS刺激大鼠肺組織后,CD68蛋白和IRF5蛋白表達上調(diào),Arg1蛋白表達下調(diào),肺組織的巨噬細胞發(fā)生浸潤及呈現(xiàn)促炎的表型,應(yīng)答肺組織的炎癥反應(yīng)。槲皮素抑制了CD68蛋白和IRF5蛋白表達,促進Arg1蛋白表達,抑制了肺泡巨噬細胞的浸潤和促炎表型,進一步抑制肺組織的炎癥損傷。

Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物體內(nèi),研究表明,Notch信號途徑在免疫性疾病及炎癥性疾病中,對巨噬細胞的活化能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[17]。在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病中,抑制Notch通路的激活,可降低關(guān)節(jié)炎的M1型巨噬細胞,增加M2型巨噬細胞,減輕關(guān)節(jié)組織的損傷[18]。Notch信號在糖尿病的損傷修復(fù)的早期有關(guān)鍵作用,可調(diào)節(jié)巨噬細胞依賴的炎癥介質(zhì)產(chǎn)物[19]。在骨髓源的巨噬細胞(BMDM)中,Notch通路直接抑制信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的表達,調(diào)控巨噬細胞的極化和吞噬作用[20]。本研究中,LPS刺激大鼠肺組織后,Notch1蛋白表達上調(diào),加劇了肺組織炎癥損傷,槲皮素抑制了Notch1蛋白的表達,因此,槲皮素對大鼠急性肺損傷的保護作用可能與Notch1蛋白相關(guān),但具體機制需要進一步研究。

綜上所述,LPS可誘導(dǎo)大鼠肺組織的急性肺損傷,肺組織發(fā)生水腫時炎癥因子TNF-α和IL-1β表達上調(diào),CD68蛋白上調(diào),肺組織巨噬細胞發(fā)生浸潤,促炎巨噬細胞標志蛋白IRF5表達上調(diào),抑炎標志蛋白Arg1表達下調(diào),肺部巨噬細胞呈現(xiàn)M1表型。給予槲皮素后,抑制了肺組織巨噬細胞的浸潤,促炎表型和肺組織炎癥損傷,因此槲皮素對大鼠急性肺損傷有保護作用。