左瑤 朱聯(lián)旭 路宏朝 任宏強(qiáng) 王令 王珊珊 吳國(guó)飛 張濤

摘? 要：基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)鎮(zhèn)巴臘肉加工過(guò)程不同階段的微生物種群組成進(jìn)行鑒定和分析，同時(shí)對(duì)細(xì)菌表型及相關(guān)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)加工過(guò)程中，真菌豐度大于細(xì)菌豐度，并隨著發(fā)酵時(shí)間及加工工藝變化，微生物群落存在明顯的演替；鎮(zhèn)巴臘肉中豐度最高的細(xì)菌為厚壁菌門(mén)（Firmcutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬隨著加工步驟推進(jìn)由原料肉樣品中的大腸-志賀氏菌屬演替為腌制時(shí)期和熏制時(shí)期的葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和乳桿菌屬（Latilactobacillus）；豐度最高的真菌門(mén)為子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），優(yōu)勢(shì)真菌屬由鐮刀菌屬（Fusarium）和被孢霉屬演替為鐮刀菌屬（Mortierella）和德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）；基于菌落演替變化及細(xì)菌表型和功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)巴臘肉在加工過(guò)程中有害微生物不斷減少，利于發(fā)酵的微生物逐漸增加，促進(jìn)鎮(zhèn)巴臘肉風(fēng)味物質(zhì)形成。

關(guān)鍵詞：鎮(zhèn)巴臘肉；微生物多樣性；高通量測(cè)序；微生物群落演替

Abstract： High-throughput sequencing technology was used to identify and analyze the microbial community in Zhenba bacon at different stages of processing， and bacterial phenotypes and related functions were predicted. The results showed that during the processing of Zhenba bacon， the abundance of fungi was greater than that of bacteria， and there was an obvious succession of microbial community during the fermentation process. The most abundant bacteria were Firmcutes and Proteobacteria. As the process proceeded， the dominant bacteria changed from Escherichia coli and Shigella in the raw meat samples to Staphylococcus， Psychrobacter and Latilactobacillus at the curing and smoking stages. The most abundant fungal phyla were Ascomycota and Basidiomycota， and the dominant fungi changed from Fusarium and Alternaria to Mortierella and Debaryomyces. Based on the microbial community succession and the prediction of bacterial phenotype and functions， it was found that during the processing of Zhenba bacon， the harmful microorganisms decreased continuously， and the microorganisms conducive to the fermentation process gradually increased， which promoted the formation of flavor substances of Zhenba bacon.

Keywords： Zhenba bacon; microbial diversity; high-throughput sequencing; microbial community succession

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230224-018

中圖分類號(hào)：TS251.51? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：

引文格式：

左瑤， 朱聯(lián)旭， 路宏朝， 等. 鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程中微生物組成及多樣性變化[J]. 肉類研究， 2023， 37（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230224-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZUO Yao， ZHU Lianxu， LU Hongzhao， et al. Changes in microbial composition and diversity during the production of zhenba bacon[J]. Meat Research， 2023， 37（5）：? . （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230224-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

臘肉具有獨(dú)特的風(fēng)味、色澤、口感和質(zhì)地，是一種傳統(tǒng)腌干肉制品，品種、類型繁多[1]。臘肉屬于發(fā)酵肉制品，其原料肉在自然條件或人工設(shè)定的環(huán)境下，通過(guò)微生物或酶的發(fā)酵作用，發(fā)生一系列生物、化學(xué)及物理變化，形成具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，且能長(zhǎng)時(shí)間保藏的肉制品[2]。臘肉在發(fā)酵過(guò)程中，微生物菌群是影響其風(fēng)味、口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)鍵因素[3-4]。受自然環(huán)境和飲食習(xí)慣影響，不同地區(qū)臘肉具有明顯的風(fēng)味差異和地域特色，這主要受臘肉生產(chǎn)過(guò)程中微生物種群差異的影響[5]。周瑩等[6]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)解析安徽地區(qū)徽派臘肉的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)菌群為乳球菌屬、嗜冷桿菌屬和葡萄球菌屬等；文開(kāi)勇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，四川臘肉的優(yōu)勢(shì)微生物為葡萄球菌屬和曲霉屬；李彥虎等[4]研究表明，甘肅地區(qū)隴西臘肉中環(huán)絲菌屬、肉食桿菌屬及乳桿菌屬等是其中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

陜西省鎮(zhèn)巴縣地屬北亞熱帶季風(fēng)氣候，境內(nèi)植被豐茂，自然環(huán)境優(yōu)良，具有悠久的臘肉生產(chǎn)歷史和成熟的生產(chǎn)工藝[8]，鎮(zhèn)巴臘肉形成了自己獨(dú)特的風(fēng)味和口感，2010年獲地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)主要采用傳統(tǒng)加工方式，依賴自然發(fā)酵[9]。由于鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)酵劑等添加，故鎮(zhèn)巴臘肉中的風(fēng)味物質(zhì)等形成主要靠發(fā)酵過(guò)程中的微生物參與原料的諸多生化反應(yīng)，受微生物多樣性及種群結(jié)構(gòu)影響較大。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，分析鎮(zhèn)巴臘肉腌制和熏制過(guò)程中微生物多樣性，為優(yōu)化鎮(zhèn)巴臘肉發(fā)酵工藝提供數(shù)據(jù)支撐，為鎮(zhèn)巴臘肉產(chǎn)品提質(zhì)創(chuàng)新和相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)主要有原料肉修整、腌制和熏制過(guò)程。其中生肉預(yù)處理主要將原料分割至相應(yīng)大小肉坯，洗掉血污、肉表浮油，瀝干表面水分；然后將食用粗鹽均勻涂抹于表面，置于香樟木桶，室溫腌制8～9 d；腌制結(jié)束后轉(zhuǎn)至熏房，保持熏房溫度為25～45 ℃，熏制30～32 d。根據(jù)鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程，分別選擇原料肉（修整后，M）、腌制中期（腌制4 d，S4D）、腌制末期（腌制8 d，S8D）、熏制中期（熏制16 d，F(xiàn)16D）和熏制末期（熏制32 d，F(xiàn)32D）5 個(gè)時(shí)期的樣品，切取表層0.3～0.5 cm肉樣，每組樣品采集3 份平行樣品，分別標(biāo)記M1～M3、S4D1～S4D3、S8D1～S8D3、F16D1～F16D3、F32D1～F32D3，置于50 mL無(wú)菌離心管中，低溫保存，快速送回實(shí)驗(yàn)室后置于－80 ℃冰箱保存。

1.2? ?儀器與設(shè)備

Synergy HTX酶標(biāo)儀? ?香港基因有限公司；Legend Micro 21高速離心機(jī)、5424EQ766751 24 孔離心機(jī)? ?德國(guó)Eppendorf公司；G560E振蕩器? ?美國(guó)Scientific Industries公司；9902 96 孔聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀? ?美國(guó)Thermo Fisher公司；1795微型離心機(jī)? ?天根生化科技（北京）有限公司。

1.3? ?方法

1.3.1? ?樣品處理

每種樣品分別取約5 g，剪碎至1 cm左右大小，加入10 mL滅菌生理鹽水漩渦振蕩3～5 min充分懸浮，重復(fù)2 次，收集上清液。6 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體。使用基因組DNA提取試劑盒提取微生物基因組DNA，檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度后置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2? ?DNA片段擴(kuò)增及測(cè)序

將處理后的樣品送至北京擎科生物科技有限公司，完成DNA提取后，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)域，以及引物ITS 1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS 2-Rev（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）PCR擴(kuò)增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）區(qū)域。PCR擴(kuò)增體系為10×PCR buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）35 μL、模板DNA 10 ng、正反向引物（10 μmol/L）各2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 U，加dd H2O補(bǔ)齊體系至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)25 次，最后72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。純化目標(biāo)DNA后基于該公司Illumina Novaseq測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序。

1.4? ?數(shù)據(jù)處理

DNA樣品質(zhì)檢合格后基于Illumina Novaseq 6000平臺(tái)，采用雙末端測(cè)序的方法，經(jīng)堿基識(shí)別得到原始序列。隨后使用Trimmomatic v0.33和Cutadapt 1.9.1軟件對(duì)原始序列進(jìn)行過(guò)濾，同時(shí)識(shí)別并去除引物序列，基于Usearch v10軟件將序列拼接起來(lái)，并根據(jù)不同區(qū)域的長(zhǎng)度范圍對(duì)拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾。使用QIIME2軟件進(jìn)行去噪并去除嵌合體序列，得到最終的有效序列，同時(shí)劃分樣品的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），統(tǒng)計(jì)樣品的ACE、Chao 1、Simpson和Shannon指數(shù)來(lái)評(píng)估樣品α多樣性。參考Silva數(shù)據(jù)庫(kù)使用樸素貝葉斯分類器對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，繪制樣品微生物門(mén)、屬水平分布柱狀圖。通過(guò)t檢驗(yàn)和線性判別分析效應(yīng)量（line discriminant analysis （LDA） effect size，LEfSe）完成樣品組間差異分析。通過(guò)BugBase和PICRUSt2軟件對(duì)樣品中微生物的表型及功能進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?高通量測(cè)序結(jié)果質(zhì)控及聚類分析

由表1可知，測(cè)序共得到845 613 條優(yōu)質(zhì)細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)序列和841 258 條優(yōu)質(zhì)真菌ITS序列，結(jié)果覆蓋率達(dá)100.00%，說(shuō)明測(cè)序深度足以代表樣品中微生物的多樣性，測(cè)序結(jié)果代表樣品中微生物的真實(shí)情況。使用QIIME2軟件對(duì)所得到的序列進(jìn)行去噪和聚類，15 個(gè)樣本共產(chǎn)生414 個(gè)細(xì)菌OTUs和1 974 個(gè)真菌OTUs，可以反映樣品中細(xì)菌的豐度。其中樣品F16D1中細(xì)菌OTUs達(dá)到155 個(gè)，樣品S8D2僅有50 個(gè)；樣品F32D3產(chǎn)生315 個(gè)真菌OTUs，S4D3僅產(chǎn)生263 個(gè)真菌OTUs，總體而言，樣品中真菌豐度大于細(xì)菌豐度。

基于OTU對(duì)臘肉生產(chǎn)過(guò)程5 個(gè)階段樣品的微生物群落多樣性進(jìn)行聚類分析，繪制Venn圖，利用Venn圖可以清晰地展示樣品中共有和特有的特征數(shù)目，以達(dá)到評(píng)估不同樣本間OTUs組成及分布異同的目的。由圖1可知，鎮(zhèn)巴臘肉制作過(guò)程各時(shí)期中共有的細(xì)菌OTUs數(shù)量為9 個(gè)，真菌OTUs數(shù)量為56 個(gè)。其中樣品M、S4D、S8D、F16D、F32D獨(dú)有的細(xì)菌OTUs分別為51、19、50、35、12 個(gè)，獨(dú)有的真菌OTUs分別為320、348、303、90、94 個(gè)。樣品M共有125 個(gè)細(xì)菌OTUs和718 個(gè)真菌OTUs，樣品S4D共有98 個(gè)細(xì)菌OTUs和721 個(gè)真菌OTUs，樣品S8D共有171 個(gè)細(xì)菌OTUs和705 個(gè)真菌OTUs，樣品F16D共有199 個(gè)細(xì)菌OTUs和578 個(gè)真菌OTUs，樣品F32D共有162 個(gè)細(xì)菌OTUs和561 個(gè)真菌OTUs。結(jié)果表明，在鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程中F16D中細(xì)菌微生物豐度最高，S4D細(xì)菌微生物豐度最低；S4D真菌微生物豐度最高，F(xiàn)32D真菌微生物豐度最低。不同生產(chǎn)時(shí)期樣品的微生物組成有差異，細(xì)菌OTUs隨加工工藝變化和時(shí)間延長(zhǎng)浮動(dòng)較大，而真菌OTUs在加工過(guò)程中不斷降低，說(shuō)明鎮(zhèn)巴臘肉樣品中真菌豐度受加工階段和時(shí)間影響，并逐漸下降。

2.2? ?α多樣性分析

α多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性。Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)是微生物群落豐度指數(shù)，反映物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，即不同物種分布越均勻，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)越大，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。

由圖2A可知：臘肉樣品中S4D的細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均最低，F(xiàn)16D的Shannon指數(shù)達(dá)到最高，F(xiàn)32D的Simpson指數(shù)最高，說(shuō)明S4D中的細(xì)菌物種多樣性最低，熏制時(shí)期2 種樣品細(xì)菌物種多樣性最高。M和S4D有顯著差異，這表明腌制處理對(duì)于樣品中的細(xì)菌組成影響較大；Chao 1和ACE指數(shù)在M和S4D中最低，F(xiàn)16D中最高，說(shuō)明F16D中細(xì)菌物種豐富度最高。由圖2B可知：樣品中真菌的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在M、S4D和S8D均處于較高水平，在熏制處理時(shí)期有所下降，說(shuō)明熏制處理對(duì)于臘肉樣品中真菌組成有影響；Chao 1和ACE指數(shù)在S8D最低，熏制時(shí)期顯著上升。綜上所述，熏制是鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程中重要的發(fā)酵步驟，對(duì)臘肉樣品中微生物組成有較大影響。

2.3? ?鎮(zhèn)巴臘肉中菌群結(jié)構(gòu)分析

由圖3可知，通過(guò)對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋、統(tǒng)計(jì)并聚類分析，在臘肉樣品中共鑒定出11 個(gè)細(xì)菌門(mén)和13 個(gè)真菌門(mén)，以及部分未分類和注釋的微生物，其中細(xì)菌以變形菌門(mén)（Proteobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為主要優(yōu)勢(shì)菌群，真菌以子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）為主要優(yōu)勢(shì)組成部分，且子囊菌門(mén)在各加工時(shí)期均屬于優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度在整個(gè)加工過(guò)程中一直保持在50%以上，為臘肉樣品中第一優(yōu)勢(shì)真菌群。M組變形菌門(mén)細(xì)菌占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度達(dá)到91%，在腌制處理后相對(duì)豐度顯著降低至14%，隨腌制時(shí)間延長(zhǎng)和熏制加工后，相對(duì)豐度回升至50%左右。臘肉樣品中厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度也隨加工處理時(shí)間的延長(zhǎng)和工藝變化而產(chǎn)生波動(dòng)，加工處理最終階段穩(wěn)定在50%左右。

為進(jìn)一步揭示鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程中不同時(shí)期細(xì)菌組成變化，將先前測(cè)序所得序列處理后，基于屬分類水平將樣品中微生物進(jìn)行聚類分析，由圖4可知，M組臘肉樣品中占比較大的細(xì)菌菌屬為大腸-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella），其相對(duì)豐度為37%，通過(guò)加工工藝處理后其相對(duì)豐度降低至10%以下。在腌制處理時(shí)期，葡萄球菌屬（Staphylococcus）、球菌屬（Macrococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）相對(duì)豐度不斷上升，球菌屬在S4D組達(dá)到最高，其相對(duì)豐度由M組的3%上升至51%；葡萄球菌屬和嗜冷桿菌屬也在S4D和S8D組相對(duì)豐度上升至30%和12%。熏制處理后，樣品中主要的細(xì)菌菌屬為弧菌屬（Vibrio）、乳桿菌屬（Latilactobacillus），其相對(duì)豐度分別為35%和19%；到熏制后期（F32D組），樣品中的葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬相對(duì)豐度回升，成為這一時(shí)期優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度分別為39%和23%。

真菌組成較細(xì)菌組成更復(fù)雜，種類更多。其中鐮刀菌屬（Fusarium）在各個(gè)發(fā)酵時(shí)期相對(duì)豐度均有10%左右，在F16D組相對(duì)豐度最高，達(dá)到11%。被孢霉屬（Mortierella）相對(duì)豐度在各個(gè)發(fā)酵時(shí)期均穩(wěn)定在5%左右。熏制處理后，庫(kù)爾茨曼氏菌屬（Kurtzmaniella）和德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）相對(duì)豐度上升，F(xiàn)16D和F32D組分別達(dá)到11%和25%，成為熏制時(shí)期的優(yōu)勢(shì)真菌。

綜上結(jié)果表明，在鎮(zhèn)巴臘肉發(fā)酵過(guò)程中，微生物組成在不斷發(fā)生極大變化，優(yōu)勢(shì)菌群有明顯的演替現(xiàn)象。如大腸-志賀氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）等菌屬在未處理的原料肉樣品中為主要細(xì)菌屬，這幾類細(xì)菌廣泛分布于外界環(huán)境，如水體、土壤中[10-11]，故推斷是由于原料肉存放期間和加工過(guò)程的間隙附著在樣品表面，但在腌制和熏制時(shí)期相對(duì)豐度降低。在發(fā)酵過(guò)程中葡萄球菌屬等生肉時(shí)期的非優(yōu)勢(shì)菌群成為主要組成部分，在發(fā)酵后期乳桿菌屬等成為優(yōu)勢(shì)菌群，這說(shuō)明不僅優(yōu)勢(shì)菌群存在演替現(xiàn)象，非優(yōu)勢(shì)菌群也存在演替現(xiàn)象。

2.4? ?鎮(zhèn)巴臘肉不同加工時(shí)期微生物組成差異分析

為明確鎮(zhèn)巴臘肉加工過(guò)程中不同時(shí)期的微生物屬水平組成差異，對(duì)樣本數(shù)據(jù)每2 組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，由圖5可知：較生肉時(shí)期樣品，腌制處理后，葡萄球菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度顯著上升；隨著加工進(jìn)程推進(jìn)，熏制完成后樣品中希瓦氏菌屬（Shenwanella）相對(duì)豐度上升，罕見(jiàn)小球菌屬（Subdoligranulum）相對(duì)豐度下降。腌制加工后相較生肉樣品而言真菌組成變化不大；熏制加工處理后，對(duì)比生肉樣品真菌組成差異較明顯，靈芝屬（Ganoderma）和冬蟲(chóng)夏草屬（Cordyceps）等菌屬相對(duì)豐度上升，曲霉菌屬（Aspergillus）和長(zhǎng)西氏菌屬（Naganishia）等菌屬相對(duì)豐度下降。對(duì)比S8D和F32D組真菌物種豐度差異，可以看出熏制工藝可以有效增加曲霉菌屬和長(zhǎng)西氏菌屬的豐度。

綜上結(jié)果表明，腌制工藝可有效增加樣品中的葡萄球菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度，熏制工藝對(duì)于臘肉樣品中真菌菌群的組成和結(jié)構(gòu)影響較大，加工前后菌群結(jié)構(gòu)差異顯著。

LEfSe分析用于評(píng)估每組微生物種類的重要性。由圖6可知，共分析得到36 種細(xì)菌生物標(biāo)記物和42 種真菌生物標(biāo)記物，其LDA值大于4.0，柱狀圖的長(zhǎng)度代表差異物種的影響大小。加工處理后的樣品較原料肉樣品微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，生肉時(shí)期的菌群多為有害菌，在腌制加工后轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸亚蚓鷮俚燃?xì)菌，熏制前期也出現(xiàn)了乳桿菌屬，熏制后期的樣品中葡萄球菌屬等細(xì)菌也占據(jù)主要地位。

各個(gè)發(fā)酵時(shí)期的真菌演替較明顯，菌群結(jié)構(gòu)組成變化較大。在熏制后期的樣品中以酵母菌屬（Saccharomycetes）和德巴利氏酵母屬等為主要菌群，其LDA值最高，說(shuō)明酵母菌屬和德巴利氏酵母屬菌種在鎮(zhèn)巴臘肉發(fā)酵后期至成品時(shí)期中起重要作用。

綜上結(jié)果可以看出，在鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中菌群演替明顯，各時(shí)期發(fā)揮重要功能的微生物組分變化較大，說(shuō)明鎮(zhèn)巴臘肉發(fā)酵過(guò)程是多種微生物共同作用的。葡萄球菌屬、酵母菌屬和德巴利氏酵母屬等菌群LDA值較其他菌群高，表明其在鎮(zhèn)巴臘肉原料發(fā)酵過(guò)程中起主要作用。

2.5? ?鎮(zhèn)巴臘肉中微生物的功能相關(guān)性分析及預(yù)測(cè)

基于OUT水平分類，使用BugBase對(duì)組內(nèi)功能途徑的生物水平覆蓋表型進(jìn)行預(yù)測(cè)，由表2可知，BugBase預(yù)測(cè)結(jié)果表明，臘肉發(fā)酵各時(shí)期的微生物組成變化顯著，其表型也有較大差異。在M組樣品中，革蘭氏陰性菌占細(xì)菌中的主要地位，其相對(duì)豐度高達(dá)90.92%，厭氧型和兼性厭氧型細(xì)菌相對(duì)豐度超過(guò)50%，并且潛在致病性細(xì)菌占比也較大。腌制加工后，S4D和S8D組樣品中細(xì)菌組成主要為革蘭氏陽(yáng)性菌，相對(duì)豐度均在60%以上；相對(duì)原料肉樣品，腌制后的樣品中包含質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)基因元件的細(xì)菌相對(duì)豐度降低至20%左右，潛在致病性細(xì)菌含量也降低至10%以內(nèi)，說(shuō)明腌制過(guò)程可以有效降低潛在致病性細(xì)菌的含量。在加工處理末期，熏制完成后革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌相對(duì)豐度基本持平，厭氧型和兼性厭氧型細(xì)菌占比相對(duì)需氧細(xì)菌較高，約為60%，潛在致病性細(xì)菌在加工過(guò)程中相對(duì)豐度有所浮動(dòng)，在加工末期穩(wěn)定在16.88%，相較未處理（M組）有所降低，但仍然存在一定程度的風(fēng)險(xiǎn)。

為更進(jìn)一步探究臘肉發(fā)酵各時(shí)期細(xì)菌的功能，使用PICRUSt2軟件，對(duì)各時(shí)期樣品KEGG生物代謝通路進(jìn)行分析，以觀測(cè)不同組樣品之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化。由圖7可知，臘肉中發(fā)酵各階段的細(xì)菌功能主要是參與各類代謝途徑，相對(duì)豐度最高的代謝途徑為全局圖和概覽圖（Global and overview maps），在發(fā)酵各時(shí)期相對(duì)豐度達(dá)到40%以上；氨基酸代謝（Amino acid metabolism）和碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）途徑次之，相對(duì)豐度在各發(fā)酵時(shí)期均處于9%和6%以上；能量代謝（Energy metabolism）途徑、輔因子及維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）途徑、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）及脂代謝（Lipid metabolism）途徑相對(duì)豐度在臘肉發(fā)酵各時(shí)期均占2%～5%。除此之外，臘肉樣品中的細(xì)菌功能還集中在膜運(yùn)輸（Membrane transport）、復(fù)制與修復(fù)（Replication and repair）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、翻譯（Translation）等途徑。

3? ?討? 論

鎮(zhèn)巴臘肉加工工藝主要為腌制、自然發(fā)酵和熏制等環(huán)節(jié)，過(guò)程中影響因素較多，微生物結(jié)構(gòu)也較為復(fù)雜。本研究選取加工過(guò)程中各時(shí)期的鎮(zhèn)巴臘肉材料表層組織作為研究對(duì)象，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵各時(shí)期樣品進(jìn)行微生物多樣性檢測(cè)與分析。從OUT層面，對(duì)比文開(kāi)勇等[7]研究的四川臘肉中細(xì)菌微生物豐度高于真菌這一特性，鎮(zhèn)巴臘肉中細(xì)菌OTUs數(shù)量顯著低于真菌OTUs數(shù)量，發(fā)酵各時(shí)期的OTUs數(shù)量也有較顯著差異，細(xì)菌豐度顯著低于真菌豐度。腌制中期和熏制中期樣品分別為真菌豐度和細(xì)菌豐度最高，這2 個(gè)過(guò)程是加工工藝轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵期，因此微生物群落組成受加工工藝變化影響，微生物群落組成變化較大。在發(fā)酵過(guò)程中，鎮(zhèn)巴臘肉的微生物組成有明顯的演替現(xiàn)象，先前研究[4，6]也表明，隴西臘肉和徽派臘肉均在發(fā)酵過(guò)程中有菌落演替現(xiàn)象，且不僅優(yōu)勢(shì)菌群，非優(yōu)勢(shì)菌群同樣具有演替現(xiàn)象，說(shuō)明加工工藝對(duì)臘肉中微生物組成影響較大，是臘肉生產(chǎn)過(guò)程微生物群落演替的主要驅(qū)動(dòng)力。

鎮(zhèn)巴臘肉中細(xì)菌的主要組成部分是變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，這2 種細(xì)菌廣泛存在于隴西臘肉[4]、四川臘肉[7]、新疆傳統(tǒng)風(fēng)干肉[12]及恩施臘肉[13]等我國(guó)各地腌臘肉制品中，在其他種類的發(fā)酵肉制品中，如干腌草魚(yú)[14]、即食雞肉[15]、駱駝肉香腸[16]和貴州傳統(tǒng)酸酢肉[17]中，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)同樣是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這2 類細(xì)菌廣泛存在于各類發(fā)酵肉制品中，不受原料和工藝限制。另有研究[15]表明，變形菌門(mén)細(xì)菌豐度會(huì)隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)而下降，鎮(zhèn)巴臘肉表層組織的變形菌門(mén)豐度在低溫腌制時(shí)下降，隨后在高溫熏制過(guò)程中，其豐度又有所回升。鎮(zhèn)巴臘肉中的主要細(xì)菌屬為葡萄球菌，葡萄球菌是參與脂肪代謝的重要細(xì)菌[18]，主要參與不飽和脂肪酸的代謝，調(diào)控發(fā)酵過(guò)程中脂肪氧化[4]。同時(shí)具有較強(qiáng)的蛋白酶活性，分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生特定芳香類物質(zhì)和多肽[19]，優(yōu)化臘肉口味并抑制不良風(fēng)味，不僅是諸多腌臘肉類產(chǎn)品加工生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中重要的微生物發(fā)酵劑[3，12，20]，還是肉制品發(fā)酵過(guò)程中重要的風(fēng)味菌[14，21-22]。

真菌部分主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬多為酵母菌屬、鐮刀菌屬和被孢霉屬。酵母菌由于其發(fā)酵特性，廣泛存在于各種發(fā)酵產(chǎn)品中，是發(fā)酵肉制品中常見(jiàn)的菌種。酵母菌可以降解臘肉中的脂肪和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生醇類化合物，與乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸結(jié)合產(chǎn)生酯類化合物，進(jìn)一步豐富臘肉的風(fēng)味和色澤[5]。部分酵母菌可以在高濃度鹽和高pH值環(huán)境中發(fā)酵[1]，有利于優(yōu)化臘肉的發(fā)酵環(huán)境，減少雜菌干擾，降低臘肉制品的酸度。被孢霉屬真菌具有產(chǎn)多聚不飽和脂肪酸和轉(zhuǎn)化有機(jī)化合物的能力[23-24]，且霉菌同樣是發(fā)酵肉制品中的常見(jiàn)真菌，有研究表明，部分霉菌可以產(chǎn)生脂肪酶，可作為外源發(fā)酵劑用于發(fā)酵，改善肉制品質(zhì)構(gòu)，加速臘肉脂肪的分解，增加風(fēng)味物質(zhì)前體的積累[25-26]；抑菌隔氧，防止肉制品的腐敗[27]。需要注意的是，這類微生物并非全都無(wú)害，部分霉菌會(huì)產(chǎn)生具有毒性的次生代謝物，主要由曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬等真菌產(chǎn)生[28]，鐮刀菌屬是動(dòng)物飼料生產(chǎn)過(guò)程中最常見(jiàn)的污染真菌之一，并且廣泛存在于食品和飼料生產(chǎn)的發(fā)酵等加工過(guò)程中[29]，是生產(chǎn)過(guò)程中難以避免的問(wèn)題之一。

鎮(zhèn)巴臘肉在發(fā)酵過(guò)程中微生物結(jié)構(gòu)變化受工藝影響，微生物功能主要集中在代謝方面，氨基酸、碳水化合物、脂類等物質(zhì)代謝是臘肉發(fā)酵過(guò)程主要的揮發(fā)性前體物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的主要來(lái)源。并且臘肉發(fā)酵過(guò)程中厭氧型和兼性厭氧型微生物相對(duì)豐度高于需氧型微生物，這為臘肉發(fā)酵環(huán)境優(yōu)化提供了良好的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)未處理的原料肉表面組織存在較多的潛在致病微生物，如大腸-志賀氏菌屬，這類細(xì)菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌[30]。由于生肉未經(jīng)處理，在放置和運(yùn)輸過(guò)程中接觸空氣、水體等，很多環(huán)境中的細(xì)菌易附著在生肉表層，在經(jīng)過(guò)清洗、腌制等處理后，潛在致病性菌種相對(duì)豐度也有所降低，同時(shí)在后續(xù)加工及包裝環(huán)節(jié)配合一定的滅菌工藝來(lái)降低鎮(zhèn)巴臘肉的風(fēng)險(xiǎn)性，延長(zhǎng)鎮(zhèn)巴臘肉的貨架期。

4? ?結(jié)? 論

本研以鎮(zhèn)巴臘肉不同加工時(shí)期的材料為研究對(duì)象，通過(guò)高通量測(cè)序分析不同加工時(shí)期樣品中微生物的16S V3～V4區(qū)序列和ITS序列，共檢測(cè)到414 個(gè)細(xì)菌OTUs和1 974 個(gè)真菌OTUs。研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程中微生物群落組成變化較大，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬由原料肉樣品中的大腸-志賀氏菌屬逐漸演替為腌制時(shí)期的葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬，以及熏制時(shí)期的乳桿菌屬；優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)為子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)真菌屬也由鐮刀菌屬和被孢霉屬演替為鐮刀菌屬和德巴利氏酵母菌屬。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)巴臘肉生產(chǎn)過(guò)程中的微生物主要為厭氧型和兼性厭氧型細(xì)菌，其功能主要集中在氨基酸、碳水化合物等能量物質(zhì)代謝途徑，這些功能有助于鎮(zhèn)巴臘肉的風(fēng)味物質(zhì)形成，為解析其風(fēng)味物質(zhì)組成提供參考。

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