西藏自治區(qū)鼠疫自然疫源地鼠疫耶爾森菌最低抑菌濃度的測定及研究

楊曉艷?辛有全?何建?靳娟?李勝?張琪?吳海蓮?柏吉祥?金泳?代瑞霞

摘要：目的 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）藥敏試驗方法中的瓊脂平板稀釋法，對分離自西藏自治區(qū)鼠疫自然疫源地內的164株鼠疫耶爾森菌進行抗菌藥物最低抑菌濃度的測定，監(jiān)測西藏地區(qū)耐藥鼠疫耶爾森菌株，掌握其抑菌范圍，為鼠疫的臨床治療提供基礎數(shù)據(jù)。方法 利用瓊脂平板稀釋法分別測定氧氟沙星、環(huán)丙沙星、復方磺胺甲惡唑（甲氧芐啶-磺胺甲惡唑）、硫酸卡那霉素、鏈霉素、頭孢曲松鈉、氨芐青霉素鈉、氯霉素、鹽酸壯觀霉素、頭孢呋辛鈉、鹽酸四環(huán)素、莫西沙星共12種抗生素對164株鼠疫耶爾森菌的最低抑菌濃度（MIC）。若發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，則用K-B法進行驗證。結果 所測的164株鼠疫耶爾森菌中有1株對鏈霉素具有耐藥性（MIC=4096 μg/mL），鏈霉素K-B法檢測抑菌環(huán)直徑為0，這株菌對其余11種抗菌藥物均敏感。其余163株菌對12種抗生素均敏感。結論 發(fā)現(xiàn)1株鼠疫耶爾森菌對鏈霉素具有耐藥性，這是我國首次發(fā)現(xiàn)鼠疫耶爾森菌對鏈霉素耐藥。因鏈霉素是國內外治療鼠疫的首選藥物，耐藥鼠疫耶爾森菌會引起鏈霉素治療失敗，從臨床和公共衛(wèi)生的角度來看，對鼠疫耶爾森菌分離株的抗菌敏感性監(jiān)測應常規(guī)開展。

關鍵詞：耐鏈霉素鼠疫耶爾森菌株；西藏自治區(qū)鼠疫自然疫源地；最低抑菌濃度

中圖分類號：R978.1? ? ? 文獻標志碼：A

Abstract Objective According to the AGAR dilution method of drug sensitivity test method of the clinical and laboratory standards institute （CLSI）， the minimal inhibitory concentration （MIC） of antimicrobial agents against Yersinia pestis isolated from plague natural foci in Tibet Autonomous Region was determined to monitor drug-resistant Yersinia pestis strains and master their inhibition range， so as to provide basic data for clinical treatment of plague. Methods The MIC of 12 antibiotics （ofloxacin， ciprofloxacin， trimethoprim-sulfamethoxazole， kanamycin sulfate， streptomycin， ceftriaxone sodium， ampicillin sodium， chloramphenicol， spectinomycin hydrochloride， cefuroxime sodium， tetracycline hydrochloride， and moxifloxacin） against 164 strains of Yersinia pestis were determined by the AGAR dilution method. If the resistant strain was found， the K-B method was used to verify the strain. Results One of 164 Yersinia pestis strains tested was resistant to streptomycin （MIC= 4096 μg/mL）， and the diameter of inhibition ring detected by the streptomycin K-B method was 0. The strain was sensitive to the other 11 antibiotics. The other 163 strains were all sensitive to the 12 antibiotics. Conclusion? ? ?One strain of Yersinia pestis was found to be resistant to streptomycin， which was the first time that Yersinia pestis was found to be resistant to streptomycin in China. Since streptomycin is the preferred drug for the treatment of plague at home and abroad， drug-resistant Yersinia pestis can cause streptomycin treatment failure. From the perspective of clinical and public health， the antimicrobial susceptibility monitoring of Yersinia pestis isolates should be carried out routinely.

Key words Streptomycin resistance Yersinia pestis; Natural plague Foci in Tibet; Minimum inhibitory concentration

西藏自治區(qū)作為青藏高原的主體部分，1966年被證實為喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地[1]，它也是青藏高原喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地的重要組成部分。該鼠疫自然疫源地是我國乃至世界鼠疫流行最為活躍的地區(qū)之一[2]。1999年以來藏南地區(qū)就新增了11個疫源縣[3]。近年來，濫用抗生素一直是全世界面臨的公共衛(wèi)生問題，從而導致了耐藥細菌的大量出現(xiàn)。鼠疫耐藥菌株比較罕見，已報道在馬達加斯加發(fā)現(xiàn)了2株分離自人體的耐藥鼠疫耶爾森菌株和1株分離自動物體內的鼠疫耶爾森菌株，其中人體的一株菌為多重耐藥菌株[4-6]，耐藥鼠疫耶爾森菌株的出現(xiàn)使得鼠疫臨床治療面臨著新的挑戰(zhàn)。為了解西藏自治區(qū)鼠疫耶爾森菌對臨床常用藥物的耐藥情況，筆者選擇鼠疫治療、預防的藥物及臨床常用藥等12種抗菌藥物，測定這些藥物對西藏自治區(qū)鼠疫耶爾森菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， 以下簡稱MIC），為鼠疫的臨床治療提供基礎數(shù)據(jù)，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株、主要試劑與儀器

1.1.1 實驗菌株

被試菌株為1966—2008年間西藏自治區(qū)鼠疫自然疫源地分離自39個疫源縣（市）的164株代表性鼠疫耶爾森菌株（詳見表1）、鼠疫耶爾森菌標準株141及質控菌株ATCC25922，均由青海省地方病預防控制所提供。

1.1.2 主要試劑

瓊脂粉、牛肉粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白及12種抗生素均購自北京中生瑞泰科技有限公司，赫氏培養(yǎng)基購自北京陸橋有限公司。

1.1.3 主要儀器

MIC多點接種儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司），細胞密度儀（英國Grant Bio）。

1.2 方法

按照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的瓊脂平板稀釋法對鼠疫耶爾森菌的MIC進行抗菌藥物的測定。

1.2.1 抗菌藥物儲備液配制

（1）氧氟沙星、環(huán)丙沙星、磺胺甲惡唑：先加1/2體積滅菌去離子水，然后逐滴加入1 mol/L NaOH至溶解后，再用滅菌去離子水定容，均配制成濃度為10 mg/mL的儲備液。

（2）硫酸卡那霉素、硫酸鏈霉素、頭孢曲松鈉、氨芐青霉素鈉、鹽酸壯觀霉素、頭孢呋辛鈉、莫西沙星：直接用滅菌去離子水溶解，均配制成濃度為10 mg/mL的儲備液。

（3）鹽酸四環(huán)素：直接用滅菌去離子水溶解，配制成濃度為5 mg/mL的儲備液。

（4）氯霉素：直接用95%乙醇溶解，配制成濃度為10 mg/mL的儲備液。

（5）甲氧芐啶：用滅菌去離子水加10%終體積的0.05 mol/L鹽酸，配制成濃度為2.5 mg/mL的儲備液。

配制好的儲備液儲存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備

用滅菌去離子水將13種藥物的儲備液對倍稀釋成所需濃度，加入到已滅菌的定量M-H瓊脂培養(yǎng)基中，制備成含抗菌藥物終濃度為0.004、0.008、0.015、0.031、0.062、0.125、0.25、0.50、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024和4096 μg/mL的含藥平皿。

1.2.3 細菌接種

將被試菌株28℃、24 h培養(yǎng)后，按照何建等[7]鼠疫耶爾森菌最低抑菌濃度測定方法的建立與應用中的方法用MIC多點接種儀進行接種。在接種含抗菌藥物平皿前及接種完成后分別接種一個不含抗菌藥物的M-H質控平皿以檢查接種菌株生長性的純度。將接種好的平皿置37℃溫箱培養(yǎng)24～48 h。

1.2.4 結果觀察

將培養(yǎng)好的平皿置于不反光的表面上觀察被試菌株是否生長。當質控菌株的MIC在質控范圍內時，記錄完全抑制細菌生長的最低抗菌藥物濃度（MIC）。當出現(xiàn)單個菌落或接種物所致的輕微的不清晰現(xiàn)象時可判為未生長；當出現(xiàn)耐藥性菌株生長時重復此方法至少3次以上。

1.3 紙片擴散法

按照美國CLSI[8]推薦，使用藥敏紙片檢測耐鏈霉素鼠疫耶爾森菌、鼠疫標準株141及ATCC 25922對鏈霉素的藥敏性，當出現(xiàn)耐藥性菌株時（未出現(xiàn)抑菌環(huán)）重復此方法至少3次以上。

2 結果

2.1 鼠疫耶爾森菌株耐藥性測定

164株測試菌株中未發(fā)現(xiàn)除鏈霉素外對其它11種抗生素具有單個或多個抗菌藥物抗性的鼠疫耶爾森菌株，但有1株鼠疫耶爾森菌對鏈霉素具有耐藥性，詳見表2和圖1。

2.2 紙片擴散法結果

根據(jù)美國CLSI[8]藥敏紙片法判定標準（耐藥≤11 mm，中度敏感為12～l4 mm，敏感≥15 mm），其中1#平皿為耐鏈霉素鼠疫耶爾森菌株（未出現(xiàn)抑菌環(huán)），2#平皿為鼠疫標準株141（抑菌環(huán)直徑為27.7 mm），3#平皿為質控菌株ATCC 25922（抑菌環(huán)直徑為25.1 mm），詳見圖2。

3 討論

本次研究對1966—2008年間分離自西藏自治區(qū)的164株野生鼠疫耶爾森菌進行MIC測定，其中163株鼠疫耶爾森菌中未發(fā)現(xiàn)對除鏈霉素外對其它11種抗生素具有單個或多個抗菌藥物抗性的鼠疫耶爾森菌株。但有1株鼠疫耶爾森菌對鏈霉素具有耐藥性，這株菌分離自1996年西藏自治區(qū)隆子縣加玉鄉(xiāng)四村一起人間疫情人尸體內，現(xiàn)保藏于青海省地方病預防控制所鼠疫菌專業(yè)實驗室。表現(xiàn)出了對鏈霉素的高度耐藥性（MIC=4096 μg/mL），鏈霉素對鼠疫耶爾森菌的耐藥標準為MIC≥16 μg/mL，遠超耐藥標準，該菌對所測的其余11種抗菌藥物均敏感，這是在我國鼠疫自然疫源地野生鼠疫耶爾森菌株中首次發(fā)現(xiàn)的對鏈霉素耐藥的鼠疫耶爾森菌株。結合流行病學調查、臨床癥狀和患者治療情況，推斷是由于臨床大量使用鏈霉素治療患者引起患者攜帶菌株出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。鏈霉素對鼠疫耶爾森菌有很強的殺菌作用，自20世紀40年代末期以來，一直作為治療鼠疫的首選藥物[9]，鏈霉素耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)，警示我們研究新型、高效和低毒的抗菌藥物應用于鼠疫臨床是下一步十分迫切與必要的工作。而本次研究從表型特征上發(fā)現(xiàn)的耐鏈霉素鼠疫耶爾森菌株的耐藥機制有待進一步研究。

代瑞霞等[10]在1943—2016年分離自我國鼠疫自然疫源地的2753株鼠疫菌中均未檢測到鏈霉素、β-內酰胺類抗菌藥及磺胺類藥物耐藥基因及耐消毒劑基因，而何建等[11]采用PCR法檢測西藏自治區(qū)鼠疫耶爾森菌耐藥質粒時也未發(fā)現(xiàn)攜帶耐鏈霉素質粒的現(xiàn)象，以上兩項研究中均包括此次實驗中發(fā)現(xiàn)的這株耐鏈霉素鼠疫耶爾森菌，但檢測方法只是針對外源耐藥質粒的檢測，故未在檢測菌株中發(fā)現(xiàn)有獲得性耐藥質粒的菌株。而在本次研究中通過表型特征的測定卻發(fā)現(xiàn)了耐鏈霉素鼠疫耶爾森菌株，說明隨著抗菌藥物的廣泛使用及全球化推進，鼠疫耶爾森菌耐藥性的產(chǎn)生是必然趨勢，且不能僅通過一種方法就能篩選出耐藥菌株，而是應該通過多種多次的檢測方法和實驗操作來進一步確認。

1995年法國巴斯德研究所科學家Galimand等[4]在馬達加斯加分離了1株耐鏈霉素鼠疫耶爾森菌 No. 16/95，隨后的研究證實，對鏈霉素具有強耐受性的鼠疫耶爾森菌No.16/95中存在著質粒PIP1203，該質粒長40 kb，可在鼠疫耶爾森菌、假結核耶爾森菌中高頻傳遞，在鼠疫耶爾森菌、大腸埃希菌中以較低的頻率傳遞，其質粒上攜帶有氨基糖甙類?；D移酶基因，能作用于氨基糖的特定羥基，使其磷酸化，導致了耐藥性的出現(xiàn)[12]。

西藏自治區(qū)屬青藏高原喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地，是全國受鼠疫威脅最嚴重的省（自治區(qū)）之一。1966年首次證實鼠疫存在以來，共發(fā)生人間鼠疫22起，發(fā)病120人，死亡75人，平均死亡率為62.5%[13]。西藏自治區(qū)鼠疫自然疫源面積廣，動物間鼠疫流行猛烈，本研究結果發(fā)現(xiàn)的鏈霉素耐藥菌株為人間疫情人尸體所分離，耐藥性極強（MIC=4096 μg/mL），這對我國鼠疫的臨床治療提出了新的研究課題。因此，將抗菌藥物對鼠疫耶爾森菌最低抑菌濃度測定方法，納入到鼠疫耶爾森菌常規(guī)的表型研究中，了解西藏自治區(qū)乃至中國各鼠疫自然疫源地鼠疫耶爾森菌對抗菌藥物的耐藥情況，掌握常用抗菌藥物對鼠疫耶爾森菌的MIC勢在必行。

參 考 文 獻

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