多輪次篩選選育高酚酸耐受性丁醇生產(chǎn)菌

經(jīng)玉潔，黃小倩，田璐毅，丁歡歡，卜 京，施超越，李漢廣

多輪次篩選選育高酚酸耐受性丁醇生產(chǎn)菌

經(jīng)玉潔，黃小倩，田璐毅，丁歡歡，卜 京，施超越，李漢廣※

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/應(yīng)用微生物研究所，南昌 330045）

纖維原料預(yù)處理過程中會產(chǎn)生酚酸等抑制菌株生長的物質(zhì)，為選育出高丁醇產(chǎn)量及高耐受酚酸脅迫丁醇生產(chǎn)菌株，該研究利用多因子復(fù)合篩選策略篩選出一株能夠合成足夠還原力與對丁醇耐受性較好的菌株W6。通過丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化獲得丁醇耐受菌W6-1，其丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量相較于菌株W6分別提高了14.01%和16.85%。通過紫外誘變處理菌株W6-1并結(jié)合理性篩選模型最終獲得丁醇產(chǎn)量較高菌株W6-2，其丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別可達(dá)到（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L。最后將菌株W6-2通過酚酸脅迫適應(yīng)性進(jìn)化得到突變菌W6-3，其能耐受1.0 g/L酚酸脅迫環(huán)境，且丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量相較于菌株W6-2分別提高了18.17%和17.49%。當(dāng)以葛渣水解液為底物進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵時(shí)，突變菌W6-3的丁醇產(chǎn)量達(dá)（8.54±0.31）g/L，相較于菌株W6-2提高了26.71%。經(jīng)多輪次誘變及適應(yīng)性進(jìn)化處理獲得的突變菌的酚酸耐受性及發(fā)酵性能均有較大提高，該文所采用的多輪次篩選方法可以為其他快速篩選優(yōu)良生產(chǎn)菌提供可靠的理論參考。

菌株；發(fā)酵；復(fù)合篩選；酚酸脅迫；水解液

0 引 言

化石能源作為當(dāng)今世界的主要能源之一，在給人類經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來無限動力的同時(shí)，也產(chǎn)生了如大氣污染、溫室效應(yīng)等諸多環(huán)境問題[1]。為克服這一不利局面，人們開始著手開發(fā)可持續(xù)綠色能源，在諸多綠色能源中，生物丁醇作為一種多功能四碳醇（C4H10O），與其他傳統(tǒng)生物燃料（低級醇）相比具有弱腐蝕性、低揮發(fā)性、強(qiáng)混合性及可在現(xiàn)有管道中進(jìn)行運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具潛力的第二代新型生物燃料[2-3]，因此，加強(qiáng)對丙酮丁醇發(fā)酵的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

傳統(tǒng)的丙酮丁醇發(fā)酵（acetone-butanol-ethanol，ABE）是以淀粉、葡萄糖為底物進(jìn)行，原料成本往往占生產(chǎn)成本的60%～70%[4]，尋找廉價(jià)易得可發(fā)酵原料逐漸成為ABE發(fā)酵研究的熱點(diǎn)[5]。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生原料，近年以其作為ABE發(fā)酵原料成為該領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)[6]，中國有很多地方種植葛根，年產(chǎn)量在500萬t以上，從葛根中提取葛根異黃酮和葛根粉后，產(chǎn)生的副產(chǎn)物為葛渣[7]，成分為75%的纖維素和半纖維素、礦物離子、少量含氮化合物，由于粗纖維含量高，大多數(shù)生物難以直接利用，導(dǎo)致其除少數(shù)用來造紙或用作飼料外，其余大部分被廢棄[8]，這一行為會造成資源的大量浪費(fèi)，給后續(xù)環(huán)境處理帶來不少的壓力。因此，將葛渣用作ABE發(fā)酵原料，不僅可以解決制藥或食品企業(yè)的廢棄物排放問題，還可生產(chǎn)生物燃料。然而現(xiàn)有的常用丁醇生產(chǎn)菌（、等）不能將木質(zhì)纖維素直接利用，需要一個(gè)復(fù)雜的預(yù)處理過程[9]。盡管在生物質(zhì)預(yù)處理[10]、酶解[11]和抑制物脫毒[12]等方面均進(jìn)行了較多的工藝改進(jìn)，但在水解過程中還是會產(chǎn)生大量抑制微生物生長與代謝的物質(zhì)，如呋喃類（糠醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF））、酚類（如丁香酸、4-羥基苯甲酸和對香豆酸）以及弱酸類（如乙酸和甲酸）等[12-13]。其中酚類化合物由于會破壞生物膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性的喪失，減弱了細(xì)胞膜作為選擇性屏障的能力，因此酚類化合物被認(rèn)為是抑制作用最強(qiáng)的一大類化合物[14-16]。要想高效利用木質(zhì)纖維水解液作為ABE發(fā)酵原料，必須有效消除酚類化合物對細(xì)胞生長帶來的不利影響[17]。

在木質(zhì)纖維水解液的酚類化合物中，酚酸的種類和含量都要比酚醛多，且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般的物理方法和化學(xué)方法都難以將其消除[18-20]。而且脫毒過程往往存在可發(fā)酵糖的損失以及增加纖維原料的操作成本等問題，若能獲得高酚酸耐受性菌株，有望用未脫毒纖維水解液進(jìn)行ABE發(fā)酵。為選育出高酚酸與高丁醇耐受性丁醇生產(chǎn)菌株，本研究利用丁醇-刃天青-可溶性淀粉多因子復(fù)合篩選策略篩選出一株具有較強(qiáng)丁醇合成能力的菌株；利用丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化及紫外誘變技術(shù)復(fù)合處理菌株以提高其丁醇產(chǎn)量及丁醇耐受性，然后將菌株進(jìn)行酚酸脅迫適應(yīng)性進(jìn)化，以提高菌株的酚酸耐受性能，并以葛渣水解液為底物評估突變菌株對木質(zhì)纖維素水解液利用能力的變化。本研究結(jié)果可為高效利用木質(zhì)纖維水解液為碳源的丁醇生產(chǎn)菌株的選育及其發(fā)酵提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵菌株

本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株W（W），為本實(shí)驗(yàn)室從江西滕王閣藥業(yè)有限公司周邊村莊的土壤中篩選所得[21]。

1.2 培養(yǎng)基

1）分離純化培養(yǎng)基：葡萄糖40.0 g/L，可溶性淀粉40.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，胰蛋白胨6.0 g/L，乙酸胺3.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH值為6.0，121 ℃滅菌20 min。

2）篩選培養(yǎng)基：在分離純化培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加8.0 g/L丁醇及0.02 g/L刃天青。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖55.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，CaCO34.0 g/L，pH值為6.0，121 ℃滅菌20 min。無機(jī)鹽溶液（MgSO4·7H2O 0.02 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L）及維生素（對氨基甲苯酸0.001 g/L、維生素B1 0.001 g/L、生物素0.000 01 g/L）配制成的母液用0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌后加入。

1.3 多因子復(fù)合篩選和脅迫適應(yīng)性進(jìn)化

1.3.1 多因子復(fù)合篩選

菌株接種至丁醇-刃天青-可溶性淀粉多因子篩選固體平板，通過判斷褪色圈、菌落大小以及ABE發(fā)酵后溶劑產(chǎn)量，篩選出一株能夠合成足夠還原力和對丁醇耐受性較好的菌株。

1.3.2 丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化

丁醇的浸泡濃度預(yù)設(shè)定為10、15、20和25 g/L，具體步驟如下：取0.1 mL對數(shù)生長期的細(xì)胞轉(zhuǎn)接至含10 g/L丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基和未加丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中（對照），試驗(yàn)組出現(xiàn)明顯生長現(xiàn)象后取對數(shù)期細(xì)胞液涂布至對應(yīng)丁醇濃度的篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)并挑取生長健壯、透明圈最大的菌株到含15 g/L丁醇固體平板進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化。如此逐步提高培養(yǎng)基中的丁醇濃度，最終獲得高丁醇耐受性菌株，本研究所有試驗(yàn)均進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 酚酸脅迫適應(yīng)性進(jìn)化

適應(yīng)性進(jìn)化所用的復(fù)合酚酸為丁香酸、對羥基苯甲酸和對香豆酸，等比例配成0.5、0.75、1.0、1.1、1.2和1.3 g/L溶液。將活化的菌株按10%的接種量接入含有0.5 g/L混合酚酸的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d，然后取菌液涂布到含有0.75 g/L混合酚酸的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選長勢較好的菌株接種到含有0.75 g/L復(fù)合酚酸的液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，如此逐步提高混合酚酸培養(yǎng)基濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)，最終獲得高酚酸耐受性菌株。

1.4 紫外誘變處理

取700 μL培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液在試管中采用10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，利用無菌生理鹽水將其梯度稀釋至10-4，在紫外燈下分別照射0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9和10 min，每個(gè)處理三個(gè)平行。誘變完成后在黑暗環(huán)境下取100 μL進(jìn)行涂布，避光放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計(jì)算其致死率和正突變率（丁醇產(chǎn)量高于原始菌株5%以上的視為正突變菌株），確定紫外誘變最佳時(shí)間。兩者的計(jì)算公式如下：

式中F為致死率（fatality rate，F(xiàn)R），%；為正突變率，%；1為誘變前菌落數(shù)；2為誘變后菌落數(shù)；3為誘變后正突變菌落數(shù)。

1.5 葛渣水解液制備

將葛渣和蒸餾水按1∶8（質(zhì)量體積比）的比例混合，加入適量濃H2SO4使其終濃度為1.0%（體積分?jǐn)?shù)），攪拌混勻后于121 ℃高溫高壓下水解60 min，冷卻后用Ca(OH)2粉末將pH值調(diào)整至6.0左右，然后通過離心收集上清從而獲得葛渣水解液。

1.6 水解液丁醇發(fā)酵

將活化的菌株按10%的接種量接入水解液培養(yǎng)基（還原糖60.0 g/L，其他成分同發(fā)酵培養(yǎng)基）中，37 ℃靜置培養(yǎng)，定期取樣測定溶劑濃度等數(shù)據(jù)。

1.7 測定方法

1.7.1 還原糖測定

還原糖濃度利用DNS法[22]進(jìn)行測定，測定波長為560 nm。

1.7.2 溶劑含量測定

通過內(nèi)標(biāo)法（內(nèi)標(biāo)為異丁醇）測定上清液中的溶劑含量[23]，氣相色譜條件如下：氣相色譜儀用的檢測器與色譜柱分別為火焰離子檢測器（FID）和毛細(xì)管柱（RB-5，30 mm×0.32 mm×0.25 mm），柱溫、檢測器和進(jìn)樣器溫度分別為70、210和200 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL。總?cè)軇橐掖?、丙酮和丁醇產(chǎn)量之和。

式中為產(chǎn)率，%；為得率，%；B為丁醇占比（Butanol ratio，B），%；：溶劑濃度，g/L；為發(fā)酵時(shí)間，h；C為還原糖消耗量，g/L；C：丁醇濃度，g/L；C：總?cè)軇舛龋琯/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 多因子復(fù)合篩選結(jié)果

ABE發(fā)酵分為產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期2個(gè)階段[24]，在產(chǎn)酸期向產(chǎn)溶劑期過渡過程中，需要還原力NADH的參與[25]。NADH是碳代謝的重要輔因子，通過激活或抑制代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性對碳代謝流流向及其通量進(jìn)行調(diào)控，因此高活力丁醇生產(chǎn)菌株往往具有較強(qiáng)的還原力合成能力[26]。刃天青作為常用的氧化還原指示劑，顏色變化靈敏，可鑒別細(xì)胞的還原能力，靳孝慶等[27]根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了刃天青篩選平板，篩選出高還原活性的菌株。

本研究利用多因子篩選方案共分離純化出58個(gè)單菌落，其中有6個(gè)單菌落顏色為白色至米黃色，呈近似圓形、菌落飽滿、邊緣向外擴(kuò)散，表面呈不透明但有光澤，而且具有較大的透明圈和褪色圈，表明這6株菌具有較強(qiáng)的還原力，同時(shí)具有一定的丁醇耐受性。將此6個(gè)突變菌株分別命名為W1、W2、W3、W4、W5、W6，并將其以葡萄糖作為底物進(jìn)行ABE發(fā)酵。

由表1可以看出，6株突變菌的丁醇產(chǎn)量在6.92～7.49 g/L之間，總?cè)軇┊a(chǎn)量均超過9.0 g/L，丁醇占總?cè)軇┍壤钠骄导s為70%。其中菌株W2、W5和W6的丁醇產(chǎn)量為7.49、7.48和7.47 g/L，在此處理中丁醇產(chǎn)量相對較高，但W6丁醇占比高于W2和W5水平，因此采用菌株W6進(jìn)行下一步的選育。

表1 篩選菌株在以葡萄糖為碳源條件下的溶劑產(chǎn)量

2.2 丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化

有研究表明提高生產(chǎn)菌的丁醇耐受性可以降低菌株的產(chǎn)芽孢率以保證發(fā)酵正常進(jìn)行[28]。而通過外源添加溶劑（丁醇）的方式來模擬生物進(jìn)化是提高菌株耐受性的一種操作簡單、定向性強(qiáng)的技術(shù)。為進(jìn)一步提高菌株W6的丁醇耐受性，本試驗(yàn)對菌株W6進(jìn)行多輪次丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化，由表2可知，隨著丁醇濃度的增大，菌株的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量逐漸提高，當(dāng)外源添加20.0 g/L丁醇時(shí)，此時(shí)丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為（8.22±0.21）和（11.72±0.26）g/L，相較于對照組分別提高了14.01%和16.85%。當(dāng)處理濃度超過20.0 g/L時(shí)，菌株溶劑產(chǎn)量反而略有下降，根據(jù)這一試驗(yàn)現(xiàn)象，將適應(yīng)性進(jìn)化濃度固定在20.0 g/L，此時(shí)獲得的菌株命名為W6-1。

2.3 紫外誘變

紫外誘變作為一種傳統(tǒng)的誘變手段，在提高微生物的生長或發(fā)酵方面起到過非常重要的作用[29]。該方法操作簡單、成本低，普通的實(shí)驗(yàn)室均可開展，為了使適應(yīng)性進(jìn)化后的菌株W6-1獲得一些新的優(yōu)良性狀以期進(jìn)一步提高菌株溶劑產(chǎn)量，本研究將其進(jìn)行紫外照射處理，結(jié)果如圖1所示。

表2 不同濃度丁醇處理后的溶劑產(chǎn)量比較

由圖1可知，菌株的致死率隨著誘變時(shí)間的增加而上升，當(dāng)處理時(shí)間為3 min時(shí)，菌株致死率達(dá)到78.05%；當(dāng)處理時(shí)間為5 min時(shí)，菌株致死率為92.68%；處理時(shí)間超過7 min后，菌株的致死率可達(dá)100%。另一方面，誘變后菌株正突變率隨著誘變時(shí)間的延長呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)處理時(shí)間為3 min時(shí)，獲得了最大正突變率（4.5%）。有研究表明菌體的誘變效果和生存能力在致死率為80%左右時(shí)為最佳誘變條件[30]，由此本試驗(yàn)確立最佳紫外誘變時(shí)間為3 min。

圖1 不同誘變時(shí)間下菌株致死率及正突變率

將紫外誘變處理3 min后的菌懸液涂布于篩選平板，挑取褪色圈較大、健壯單菌落進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。由圖2可知，發(fā)酵結(jié)束后丁醇濃度在8.0 g/L以上的菌株約占57%，其中溶劑產(chǎn)量在菌株W6-1之上的有10株，占總菌株的38.46%。此外第13株菌的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量最大，分別為（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L，相較于菌株W6-1分別提高了15.69%和30.72%（與菌株W6相比分別提高了27.31%和45.90%）。因此選第13株菌作為研究對象（命名為W6-2）。

圖2 紫外誘變高產(chǎn)菌株丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量

2.4 菌株W6-2遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

為驗(yàn)證菌株W6-2的遺傳穩(wěn)定性，將菌株進(jìn)行了10次傳代培養(yǎng)，由表3可知，試驗(yàn)過程中菌株的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量穩(wěn)定維持在8.56～9.12和12.02～13.81 g/L范圍，10代丁醇與總?cè)軇┑钠骄a(chǎn)量分別為8.75和12.62 g/L，與第1代相比分別僅降低了0.11%和1.94%，雖然10代丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量略有所變化，但總體穩(wěn)定，說明菌株發(fā)酵性能并無明顯變化，由此可看出該誘變后獲得的菌株具有很好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5 酚酸脅迫適應(yīng)性進(jìn)化策略對菌株耐受性的影響

木質(zhì)纖維素水解液中酚酸多以復(fù)合酚酸形式存在，為提高菌株W6-2對木質(zhì)水解液中酚酸的耐受性，本研究選擇了3種典型酚酸：丁香酸、對香豆酸和對羥基苯甲酸作為脅迫抑制劑。在進(jìn)行酚酸脅迫適應(yīng)性進(jìn)化前，為了確定合適的脅迫濃度，研究了3種典型酚酸單一添加（0.25、0.5、0.75和1.0 g/L）對菌株W6-2發(fā)酵的影響，其結(jié)果如圖3所示。

表3 菌株W6-2遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

注：實(shí)線為丁醇產(chǎn)量，虎線為還原糖濃度。

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)丁香酸和對香豆酸添加量為0.25 g/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量與對照組相比分別提高了19.77%和26.51%；當(dāng)二者的添加量為0.5 g/L時(shí)，丁醇最終產(chǎn)量與對照組相比基本保持不變，而當(dāng)二者的添加濃度為0.75 g/L時(shí)，菌株合成丁醇的能力開始受到明顯抑制作用。另一方面，當(dāng)對羥基苯甲酸添加量為0.5 g/L時(shí)，溶劑產(chǎn)量就開始受到明顯抑制；當(dāng)添加濃度為0.75 g/L時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)幾乎無丁醇產(chǎn)生。

在單一添加的基礎(chǔ)上探究了復(fù)合添加對菌株W6-2發(fā)酵的影響，以總酚酸濃度為0.5 g/L，丁香酸:對羥基苯甲酸、丁香酸:對香豆酸和對香豆酸:對羥基苯甲酸質(zhì)量比為2:1、1:1與1:2和3種酚酸等比例加入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，其結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，3種酚酸等比例復(fù)合時(shí)抑制效果最強(qiáng)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)其丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為（5.83±0.18）和（8.27 ± 0.36）g/L，相比對照組分別降低了32.56%和34.93%。當(dāng)單一丁香酸和對香豆酸添加量為0.5 g/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量分別為（8.34±0.69）和（8.53±0.71）g/L，等比例添加3種酚酸相較于單獨(dú)添加丁醇產(chǎn)量抑制效果分別增強(qiáng)了43.05%和46.31%。相較于單獨(dú)添加對羥基苯甲酸，等比例添加三種酚酸丁醇產(chǎn)量也略微下降。試驗(yàn)結(jié)果表明，單一的抑制物對菌株的生長抑制作用在低濃度時(shí)往往低于多種抑制物協(xié)同作用的；此外，3種酚酸混合添加比其中任意2種酚酸不同比例混合抑制效果更為明顯。因此為將菌株W6-2在類似環(huán)境中進(jìn)行脅迫馴化，選擇了0.5 g/L的復(fù)合酚酸。

為進(jìn)一步提高菌株W6-2對酚酸的耐受性能，本試驗(yàn)將其逐級置于不同比例復(fù)合酚酸的環(huán)境中進(jìn)行脅迫適應(yīng)性進(jìn)化后獲得一株高耐受酚酸脅迫突變菌株W6-3，將其置于0.5 g/L的脅迫環(huán)境，通過比較兩者的生長情況來驗(yàn)證其對酚酸脅迫的適應(yīng)能力。從圖5可看出，在0～12 h內(nèi)，兩菌株生物量增長趨勢基本相似，在12～24 h范圍，菌株W6-2增長速率減緩，當(dāng)培養(yǎng)至72 h，菌株W6-2的OD600為（0.80±0.06）。適應(yīng)性進(jìn)化后的菌株W6-3在12～24 h階段處于對數(shù)生長期，之后增加速度才開始減緩，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)其OD600值為（1.21±0.10），相較于菌株W6-2提高了50.00%。

注：SA：丁香酸；PHBA：對羥基苯甲酸；PCA：對香豆酸，數(shù)值為其前面兩種酸質(zhì)量比，1∶1∶1為三種酸質(zhì)量比。

圖5 酚酸適應(yīng)性進(jìn)化前后菌株生物量變化趨勢

為進(jìn)一步考察突變菌株W6-3的發(fā)酵性能，將其與馴化前菌株W6-2分別置于含0、0.25、0.75和1 g/L的等比例復(fù)合酚酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，其結(jié)果如圖6所示。

由圖6可看出，突變菌株W6-3發(fā)酵結(jié)束后丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為（10.21 ± 0.11）和（14.44 ± 0.21）g/L，相較于菌株W6-2分別提高了18.17%和17.49%。當(dāng)酚酸脅迫濃度處在較低濃度范圍時(shí)（0.25 g/L），能產(chǎn)生低劑量興奮效應(yīng)[31]，此時(shí)能大大促進(jìn)菌株W6-2的溶劑合成，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因可能是低濃度抑制物可以促進(jìn)NADH的合成，進(jìn)而為丁醇等溶劑合成提供更多的還原力，而還原力的有效供給是提高丁醇產(chǎn)量的重要保障之一，這一現(xiàn)象與EZEJI[32]的研究結(jié)果一致。而高酚酸耐受菌W6-3對此濃度酚酸應(yīng)激效果不明顯，溶劑產(chǎn)量變化不大。當(dāng)酚酸脅迫濃度達(dá)到0.5 g/L時(shí)，突變菌株W6-3丁醇產(chǎn)量相較于菌株W6-2提高了12.11%。當(dāng)酚酸脅迫濃度達(dá)到1.0 g/L時(shí)，菌株W6-2基本停止發(fā)酵，而突變菌株W6-3總?cè)軇┊a(chǎn)量可達(dá)（3.42±0.42）g/L。由此可知，經(jīng)過酚酸脅迫適應(yīng)性進(jìn)化后的突變菌株W6-3的酚酸耐受性有較大程度的提升，當(dāng)其處在高濃度的酚酸脅迫環(huán)境中，仍能保持一定的生長及產(chǎn)溶劑能力。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.6 葛渣水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇

本實(shí)驗(yàn)室前期研究了利用葛渣進(jìn)行ABE發(fā)酵的可能性[21]，發(fā)現(xiàn)葛渣經(jīng)過適當(dāng)預(yù)處理可以作為ABE發(fā)酵原料，當(dāng)以葛渣水解液為原料，以ART44為生產(chǎn)菌進(jìn)行ABE發(fā)酵時(shí)，丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達(dá)到（6.66±0.28）g/L和0.08 g/(L·h)，而且在研究葛渣水解液成分時(shí)發(fā)現(xiàn)總酚含量達(dá)到（0.79±0.06）g/L，已達(dá)到對菌株產(chǎn)生脅迫的濃度。為了解菌株W6-2和突變菌株W6-3利用木質(zhì)纖維水解液為底物進(jìn)行ABE發(fā)酵情況，將其置于葛渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其結(jié)果如圖7所示。從圖7可知，發(fā)酵結(jié)束后菌株W6-3的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量為（8.54±0.31）和（10.11±0.65）g/L，相較于W6-2分別提高了26.71%和18.00%；此外，W6-3的丁醇得率達(dá)到了0.17 g/g還原糖，與W6-2（0.14 g/g還原糖）相比提高了21.43%。因此，突變菌株增強(qiáng)了其對木質(zhì)纖維素酸水解液的利用能力。

圖7 菌株W6-2和突變菌株W6-3在以葛渣水解液為底物時(shí)的發(fā)酵特性比較

3 結(jié) 論

為了獲得一株高耐受酚酸抑制物的丁醇生產(chǎn)菌株，本研究利用多因子復(fù)合篩選平板、丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化、紫外誘變處理以及酚酸脅迫適應(yīng)性進(jìn)化手段對出發(fā)菌株W進(jìn)行選育，得出以下結(jié)論：

1）通過判斷菌株在多因子復(fù)合篩選平板中透明圈和褪色圈大小，以及ABE發(fā)酵性能，篩選出一株具有較強(qiáng)還原力及丁醇耐受性的菌株W6。為進(jìn)一步提高菌株W6的丁醇耐受能力，對其進(jìn)行多輪次丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化，最終獲得高丁醇耐受菌株W6-1，其丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為（8.22±0.21）和（11.72±0.26）g/L，與對照組相比分別提高了14.01%和16.85%。

2）為提高菌株溶劑產(chǎn)量，本研究對丁醇脅迫適應(yīng)性進(jìn)化后的菌株W6-1進(jìn)行紫外誘變處理，最終獲得突變菌W6-2，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后其丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L，相較于菌株W6-1分別提高了15.69%和30.72%；遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明菌株W6-2具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3）通過0.5 g/L復(fù)合酚酸對菌株W6-2進(jìn)行脅迫適應(yīng)性進(jìn)化，得到了高酚酸耐受菌株W6-3，突變菌株W6-3的丁醇產(chǎn)量相較于W6-2提高了12.11%。當(dāng)以葛渣水解液為底物進(jìn)行發(fā)酵，其丁醇產(chǎn)量相較于W6-2提高了26.71%。

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Screening of butanol producing strain with high phenolic acid tolerance by the approach of multi-repeating stress acclimation

JING Yujie, HUANG Xiaoqian, TIAN Luyi, DING Huanhuan, BU Jing, SHI Chaoyue, LI Hanguang※

(,,330045,)

Carbon-neutral fuels (such as ethanol and butanol) have gradually drawn much attention in recent years, due to the ever-increasing perception of global warming and environmental protection. Among them, butanol can be expected to serve as one of the promising candidates for biofuels, such as less corrosive, higher octane number, lower solubility in water, and higher energy content, compared with ethanol. However, the high feedstock cost and low productivity can be still a challenge in the acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation, due to the product's (especially butanol) resistance or toxicity to the current butanol-producing strains. The overall economics of bio-butanol production can be enhanced using the abundant source, and low-price of materials (such as lignocellulose). Nevertheless, it must be appropriately pretreated, when these materials are used as the feedstock for the ABE fermentation. Various compounds can be formed during pretreatment. Moreover, the phenolic acids that are derived from lignin degradation can be the most toxicity inhibitor for the butanol-producing strains. In this study, some excellent strains were screened for the high tolerant phenolic acids stress and high butanol production. A multi-factor screening strategy was carried out to obtain the strain W6, in order to synthesize the sufficient reducing power and high tolerance to butanol. Furthermore, the strain W6 was then domesticated to further enhance the butanol tolerance via the appropriate concentration of butanol stress. As such, strain W6-1 was obtained, where the butanol and total solvent production were (8.22 ± 0.21) and (11.72 ± 0.26) g/L, respectively, which were 14.01% and 16.85% higher than that of strain W6. After that, strain W6-1 was treated to improve the production of butanol using UV mutagenesis combined with the multi-factor screening model. The high butanol production strain W6-2 was then selected after treatment. The butanol and total solvent production reached (9.51 ± 0.06) and (15.32 ± 0.11) g/L, resulting in an increase of 15.69% and 30.72%, respectively, compared with the strain W6-1. Finally, the high phenolic acid-tolerant strain W6-3 was achieved by the adaptive evolution strategy with phenolic acid stress condition. At the end of fermentation, the biomass increased by 50.00%, whereas, the butanol and solvent production of the mutant strain W6-3 increased by 18.17% and 17.49%, respectively, compared with the strain W6-2. When strain W6-3 was in the 0.5 g/L of phenol acid stress environment, the butanol production were 12.11% higher than that of strain W6-2, respectively. Once the phenolic acid stress concentration reached 1.0 g/L, there was no growth in the pre-domestication strain W6-2. However, the total solvent production of (3.42 ± 0.42) g/L was obtained for the mutant strain W6-3, indicating excellent phenol acid tolerance. Taking the puerariae slag hydrolysate as the fermentation feedstock, the production of butanol was (8.54 ± 0.31) g/L in the mutant strains W6-3, which was 26.71% higher than that of the strain W6-2. The phenolic acid tolerance and fermentation performance of the mutant strain were greatly improved after multiple rounds of mutagenesis and adaptive evolution. This finding can provide a reliable theoretical reference to rapidly screen the excellent producing trains, in order to fully meet the requirements of fermentation performance.

strains; fermentation; compound screening; phenolic acid stress; hydrolysate

2022-09-28

2023-03-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21466014）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20202BABL203042）；江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（YC2021-S350，YC2022-S433）

經(jīng)玉潔，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能源。Email：1962699928@qq.com

李漢廣，博士，副教授，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開發(fā)利用。Email：hanguangli@jxau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.202209241

S21; TQ923

A

1002-6819(2023)-07-0236-08

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